Name: interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing
Uploaded: 2018-10-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por um subsídio do Ministério italiano da educação e Universidade (2010P3S8BR_002 para CP).

1. a construção da biblioteca ORF (Figura 1)
<ol><li>Preparação do ADN da inserção
	<ol>
<li>
Preparação de fragmentos de DNA genômico ou sintético
		<ol>
<li>Extrato/purifica DNA usando métodos padrão26.</li>
			<li>Fragmento de DNA pelo sonication. Se usando um sonicador padrão, como um começo de sugestão geral com 30 pulsos de s a 100% potência de saída. Nota: As experiências piloto devem ser feitas com poder...

<ol>
	<li>Loman, N. J., Pallen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+bacterial+genome+sequencing.">Twenty years of bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).</li><li>Jones, C. E., Brown, A. 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C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+Than+1,001+Problems+with+Protein+Domain+Databases:+Transmembrane+Regions,+Signal+Peptides+and+the+Issue+of+Sequence+Homology.">More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology.</a> PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867 (2010).</li><li>Bioinformatics, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+correction+of+abnormal,+incomplete+and+mispredicted+proteins+in+public+databases.">Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases.</a> BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).</li><li>Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+on+a+proteomic+scale.">Protein analysis on a proteomic scale.</a> Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).</li><li>DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaleable+and+integrated+crystallization+pipeline+applied+to+mining+the+Thermotoga+maritima+proteome.">A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome.</a> J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).</li><li>Nordlund, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).</li><li>Heger, A., Holm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaustive+enumeration+of+protein+domain+families.">Exhaustive enumeration of protein domain families.</a> J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).</li><li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+open+reading+frames+from+DNA.">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li><li>Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+of+cDNA+libraries:+Enrichment+of+cDNA+expression+using+open+reading+frame+selection.">Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection.</a> Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+&#945;-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+(RIDome).">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of &#945;-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li><li>Collins, M. O., Choudhary, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+multiprotein+complexes+by+affinity+purification+and+mass+spectrometry.">Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).</li><li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).</li><li>Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+Drosophila+gene+coding+for+a+protein+containing+a+novel+phosphatidylserine-binding+motif.">Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif.</a> J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).</li><li>Deng, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+antibody+single-chain+variable+fragments+with+improved+carbohydrate+binding+by+phage+display.">Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display.</a> J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).</li><li>Danner, S., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+phage+display:+A+novel+genetic+selection+system+for+cloning+RNA-binding+proteins+from+cDNA+libraries.">T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).</li><li>Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+chain+antibodies+specific+for+fatty+acids+derived+from+a+semi-synthetic+phage+display+library.">Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library.</a> Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+&#945;-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+(RIDome).">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of &#945;-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li><li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Protocols+in+Molecular+Biology.">Current Protocols in Molecular Biology.</a> Mol Biol. 1 (2), 146 (2003).</li><li>Sblattero, D., Bradbury, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+recombination+in+single+bacteria+to+make+large+phage+antibody+libraries.">Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries.</a> Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).</li><li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+:+architecture+and+applications.">BLAST+: architecture and applications.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 421 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+The+Swiss-Army+tool+for+genome+feature+analysis.">BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis.</a> Curr Protoc Bioinforma. , (2014).</li><li>Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBrowse:+A+next-generation+genome+browser.">JBrowse: A next-generation genome browser.</a> Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).</li><li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+monoclonal+antibody+epitopes+by+filtered+gene+fragment+phage+display.">Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display.</a> Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li></ol>

A criação de uma biblioteca filtrada altamente diversificada de alta qualidade ORFs é o primeiro passo crítico em todo o processo desde que afetará todas as etapas subsequentes do pipeline.
Uma característica importante e vantajosa do nosso método é que qualquer fonte de DNA (intronless) (cDNA, DNA genômico, PCR derivado ou DNA sintético) é apropriado para a construção da biblioteca. O primeiro parâmetro que deve ser levado em conta é que o comprimento dos fragmentos do DNA clon...

Aqui, descrevemos um método de alta produtividade para a construção e seleção das bibliotecas de domínios da proteína dobrada e solúvel de qualquer fonte de partida genic/genômica. A abordagem combina três tecnologias diferentes: phage display, o uso de um repórter de dobramento e sequenciamento de próxima geração (NGS) com uma ferramenta de web específica para análise de dados. Os métodos podem ser usados em muitos contextos diferentes de pesquisa à base de proteínas, para a identificação e a anotação de novos domínios de proteínas/proteína, a caracterização das propriedades estruturais e funcionais de proteínas conhecidas, bem como a definição de rede de interação de proteínas.
Muitas questões estão ainda presentes na pesquisa baseada em proteína e o desenvolvimento de métodos para a produção de proteína ideal é uma necessidade importante para vários campos de investigação. Por exemplo, apesar da disponibilidade dos milhares de genomas de procariotas e eucariotas1, mapa correspondente do proteomes relativa com uma anotação direta dos peptídeos e proteínas codificadas ainda está faltando para a grande maioria dos organismos. O catálogo de proteomes completa está emergindo como um objetivo desafiador que exige um grande esforço em termos de tempo e recursos. O padrão ouro para anotação experimental permanece a clonagem de todos o Open Frames de leitura (ORFs) de um genoma, construindo o chamado "ORFeome". Geralmente, função do gene é atribuída com base na homologia de genes relacionados de actividade conhecida mas esta abordagem é mal exata devido à presença de muitas anotações incorretas na referência bases de dados2,3,4, 5. Além disso, mesmo para as proteínas que foram identificadas e anotadas, estudos adicionais são necessários para atingir a caracterização em termos de abundância, padrões de expressão em diferentes contextos, incluindo propriedades estruturais e funcionais, bem como redes de interação.
Além disso, uma vez que as proteínas são compostas de diferentes domínios, cada um deles apresentando características específicas e contribuindo de forma diferente para funções de proteína, o estudo e a definição exata destes domínios podem permitir que um quadro mais abrangente, tanto para o single Gene e no nível do genoma completo. Toda esta informação necessária faz pesquisa baseada em proteína um campo amplo e desafiador.
Nesta perspectiva, um importante contributo poderia ser dada por métodos imparciais e alta produtividade para a produção de proteína. No entanto, o sucesso de tais abordagens, ao lado do considerável investimento necessário, conta com a capacidade de produzir construções de proteína solúvel/estável. Esta é uma grande limitação do fator desde que estima-se que apenas cerca de 30% de proteínas pode ser com êxito expressa e produzido em níveis suficientes para ser experimentalmente úteis6,7,8. Uma abordagem para superar essa limitação é baseada na utilização de DNA fragmentado aleatoriamente para produzir diferentes polipeptídeos, que juntos fornecem sobrepostos representação fragmento de genes individuais. Apenas uma pequena percentagem dos fragmentos de DNA gerados aleatoriamente são ORFs funcionais, enquanto a grande maioria deles é não-funcional (devido à presença de códons de parada dentro de suas sequências) ou codifica para un-natural (ORF em uma moldura que não seja o original) polipeptídeos com nenhum significado biológico.
Para resolver todos esses problemas, o nosso grupo desenvolveu uma plataforma de análise com proteína de alta produtividade expressão e interação que pode ser usada em uma escala genômica9,10,11,12. Esta plataforma integra as seguintes técnicas: 1) um método para selecionar conjuntos de domínios da proteína correctamente dobrada da parte codificação do DNA de qualquer organismo; 2) a tecnologia de exibição do fago para selecionar parceiros de interações; 3) o NGS completamente caracterizam a interactome toda sob estudo e identificar os clones de interesse; e 4) uma ferramenta web para análise de dados para usuários sem conhecimento de programação ou bioinformática executar análise Interactome-Seq de forma fácil e amigável.
O uso desta plataforma oferece vantagens importantes sobre estratégias alternativas de investigação; acima de tudo, o método é completamente imparcial, alta produtividade e modular para estudo que variam de um único gene até um genoma inteiro. A primeira etapa do gasoduto é a criação de uma biblioteca de DNA fragmentado aleatoriamente sob estudo, que então profundamente caracteriza-se por NGS. Esta biblioteca é gerada usando um vetor de engenharia onde/fragmentos de genes de interesse são clonados entre uma sequência de sinal para a secreção de proteínas para o espaço periplasmático (ou seja, um líder Sec) e o gene de β-lactamase TEM1. A proteína de fusão irá conferir resistência à ampicilina e a capacidade de sobreviver sob pressão de ampicilina somente se fragmentos clonados são em-frame com esses elementos e a proteína de fusão resultante é corretamente dobrado10,13 ,14. Todos os clones resgataram após seleção de antibióticos, os chamados "clones de filtrado", são ORFs e, a grande maioria deles (mais de 80%), são derivados de genes real9. Além disso, o poder desta estratégia encontra-se nas conclusões que todos os clones ORF filtrado são codificação para proteínas corretamente dobrado/solúvel/domínios15. Como muitos clones, presentes na biblioteca e mapeamento de mesmo região/domínio, têm pontos diferentes inicial e final, isto permite a identificação imparcial, passo a passo dos fragmentos mínimos que poderão resultar em produtos solúveis.
Uma melhoria na tecnologia é dada pelo uso de NGS para caracterizar a biblioteca. A combinação dessa plataforma e uma ferramenta de web específico para análise de dados fornece importante informação imparcial sobre as sequências de nucleótidos exata e sobre a localização das ORFs selecionados na referência de DNA em estudo, sem a necessidade de mais extensas análises ou esforço experimental.
Domainome bibliotecas podem ser transferidas para um contexto de seleção e usadas como um instrumento universal para realizar estudos funcionais. A proteína do elevado-throughput expressão e interação análise plataforma que estamos integrados e que chamamos Interactome-Seq aproveita a tecnologia de exibição do fago, transferindo a ORF filtrada em um vetor de phagemid e criando um fago-ORF biblioteca. Uma vez re-clonado em um contexto de exibição do fago, proteína domínios são exibidos na superfície das partículas de M13; desta forma domainome bibliotecas podem ser selecionadas diretamente para fragmentos do gene codificação domínios com actividades enzimáticas específicas ou vincular propriedades, permitindo interactome redes de criação de perfil. Esta abordagem foi inicialmente descrita por et al . Zacchi 16 e mais tarde usado em vários outros contexto13,17,18.
Em comparação com outras tecnologias utilizadas para estudar a interação da proteína-proteína (incluindo dois sistema híbrido de levedura e espectrometria de massa19,20), uma das principais vantagens é a amplificação do parceiro de ligação que ocorre durante o fago exiba várias rodadas de seleção. Isto aumenta a sensibilidade de seleção, permitindo a identificação dos domínios dos baixo abundantes proteínas presentes na biblioteca. A eficiência da seleção realizada com biblioteca ORF-filtrado é ainda maior devido à ausência de clones não-funcional. Finalmente, a tecnologia permite que a seleção para ser executada contra tanto da proteína e da proteína não iscas21,22,23,24,25.
Seleções do fago usando a biblioteca do fago-domainome podem ser realizadas usando anticorpos proveniente de soros de pacientes com diferentes condições patológicas, por exemplo, doenças auto-imunes13, câncer ou infecção doenças como isca. Esta abordagem é usada para obter a chamado "assinatura de anticorpo" da doença em estudo, permitindo-se maciçamente, identificar e caracterizar os antígenos/epítopos especificamente reconhecidos por anticorpos dos pacientes ao mesmo tempo. Em comparação com outros métodos, o uso do phage display permite a identificação de epítopos antigênicos lineares e conformacionais. A identificação de uma assinatura específica potencialmente poderia ter um impacto importante para a patogênese da compreensão, novo design de vacina, identificação de novos alvos terapêuticos e o desenvolvimento de ferramentas de diagnósticos e prognósticos de novas e específicas. Além disso, quando o estudo é focado em doenças infecciosas, uma grande vantagem é que a descoberta de proteínas imunogênicas é independente do cultivo de organismos patogénicos.
Nossa abordagem confirma que os repórteres dobráveis podem ser usados em escala genômica para selecionar o "domainome": uma coleção de domínios corretamente dobrado, bem expressa, as proteínas solúveis da porção codificação do DNA ou cDNA de qualquer organismo. Uma vez isolados os fragmentos de proteína são úteis para muitos propósitos, fornecendo informações essenciais de experimentais para anotação de gene, bem como para estudos estruturais, mapeamento de epítopo de anticorpos, identificação de antígeno, etc. A completude da elevado-throughput de dados fornecidos pelo NGS permite a análise de amostras altamente complexas, tais como bibliotecas de exibição do fago e detém o potencial para contornar a tradicional colheita trabalhosa e ensaio de clones individuais do fago resgatado.
Ao mesmo tempo graças as funcionalidades da biblioteca de filtrado e a extrema sensibilidade e poder de análise o NGS, é possível identificar o domínio de proteína responsável de cada interação diretamente em uma tela inicial, sem a necessidade de criar bibliotecas adicionais para cada um ligado a proteínas. NGS permite para obter uma definição abrangente do domainome inteiro de qualquer fonte de partida genic/genômica e a ferramenta de web de análise de dados permite a obtenção de uma caracterização altamente específica de um ponto de vista qualitativo e quantitativo do domínios dos interactome proteínas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1817px;" width="1817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sonopuls&#160; ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:444px;">Bandelin</td>
			<td style="width:423px;">HD2070</td>
			<td style="width:557px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0321</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0311</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Molecular Biology Agarose</td>
			<td style="width:444px;">BioRad</td>
			<td style="width:423px;">161-3102</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Green Gel Plus</td>
			<td style="width:444px;">Fisher Molecular Biology</td>
			<td style="width:423px;">FS-GEL01</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">R0611</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28704</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Quick Blunting Kit</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">E1201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:393px;">NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">S1420S</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">EcoRV</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0195L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Antarctic Phosphatase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sodium Acetate 3M pH5.2</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ethanol for molecular biology</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:423px;">E7023</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DH5aF&#39; bacteria cells</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,2 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">1,5 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,1 cm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:444px;">Biosigma</td>
			<td style="width:423px;">4905020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Electroporator 2510</td>
			<td style="width:444px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">2x YT medium</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DreamTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EP0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">96-well thermal cycler (with heated lid)</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">150 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">100 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BssHII</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0199L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NheI</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M13KO7 Helper Phage</td>
			<td style="width:444px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>27-1524-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Cloride (NaCl)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagnaRack Magnetic Separation Rack</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonfat dried milk powder</td>
			<td style="width:444px;">EuroClone</td>
			<td>EMR180500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KAPA HiFi HotStart ReadyMix&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Kapa Biosystems, Fisher Scientific</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP beads&#160;</td>
			<td>Agencourt, Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nextera XT dual Index&#160; Primers&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Illumina</td>
			<td>FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq or Hiseq2500&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotomer</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent Bioanalyzer or TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>&#160;5&#8217; TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAGCAAGCGGCGCGCATGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGATTGGTTTGCCGCTAGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing

Repórteres de dobramento são proteínas com fenótipos facilmente identificáveis, tais como a resistência aos antibióticos, cujo dobramento e a função fica comprometida quando fundido ao mal dobrar proteínas ou frames de leitura abertos ao acaso. Temos desenvolvido uma estratégia onde, por meio de β-lactamases de TEM-1 (a enzima que confere resistência à ampicilina) em escala genômica, podemos selecionar coleções de domínios da proteína dobrada corretamente da porção codificação do DNA de qualquer intronless genoma. Os fragmentos de proteína obtidos por esta abordagem, o chamado "domainome", será bem expresso e solúvel, tornando-os adequados para estudos estrutural/funcional.
Clonagem e exibindo o "domainome" diretamente em um sistema de exibição do fago, mostramos que é possível selecionar domínios de proteínas específicas com as propriedades de vinculação desejado (por exemplo, para outras proteínas ou anticorpos), proporcionando assim essencial informações experimentais para identificação de anotação ou antígeno gene.
A identificação dos clones mais enriquecidos em uma população de polyclonal selecionado pode ser alcançada usando tecnologias romance sequenciamento de próxima geração (NGS). Por estes motivos, apresentamos a análise profunda de sequenciamento da biblioteca em si e as saídas de seleção para fornecer informações completas sobre a diversidade, abundância e mapeamento preciso de cada um do fragmento selecionado. Os protocolos aqui apresentados mostram as principais etapas para a construção da biblioteca, caracterização e validação.

A abordagem de filtragem é esquematizada na Figura 1. Cada tipo de DNA intronless pode ser usado. Na figura 1A é representada a primeira parte da abordagem de filtragem: após o carregamento em um gel de agarose ou um bioanalyzer, uma boa fragmentação do DNA de interesse aparece como uma mancha de fragmentos com uma distribuição de comprimento no tamanho desejado da bp 150-750. Uma imagem de gel de virtual representativa do...

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Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: Um protocolo para a construção da biblioteca de Domainome, a validação e a seleção por Phage Display e a próxima geração de sequenciamento

Os protocolos descritos permitem a construção, caracterização e seleção (contra o destino de escolha), de uma biblioteca de "domainome", feita a partir de qualquer fonte de DNA. Isto é conseguido por um pipeline de pesquisa que combina diferentes tecnologias: a exibição do fago, repórter dobrável e sequenciamento de próxima geração com uma ferramenta web para análise de dados.

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na pesquisa baseada em proteínas, como anotação de novas proteínas ou domínios proteicos, caracterização de propriedades estruturais e funcionais de proteínas conhecidas, definição de redes de interação proteica ou assinaturas de anticorpos de antígenos em diferentes condições. A principal vantagem desta técnica é que ela é completamente imparcial, de alto rendimento e modular para qualquer tipo de estudo que vai de um único gene até um genoma inteiro. A construção de uma biblioteca de domínios é muito útil para estudos funcionais.Pode ser transferido para um contexto de exibição de phage e usado para a seleção contra diferentes alvos, como proteínas de ligação ou anticorpos purificados. O acoplamento com NGS permite uma análise extremamente sensível e poderosa. Ao mesmo tempo, as ferramentas web especificamente desenvolvidas dão uma caracterização precisa de todo o domainome e interactome.Para construir a biblioteca ORF primeiro, sonicar o DNA com pulsos de 30 segundos a 100% de saída. Após a sônicação, carregue a escada e o DNA sonicado em um gel de 1,5%. Em seguida, inicie a unidade de eletroforese a cinco volts por centímetro por 15 minutos.A eletroforese do gel agarose mostra a presença de mancha de DNA confirmando a sônicação. Isto é comparado com a faixa sólida obtida a partir de um DNA não submetido à sônica. Em seguida, corte a porção de gel com a mancha de DNA fragmentada e purifique usando o kit de extração de gel à base de coluna.Meça a concentração do DNA purificado no espectrofotômetro UV. Em seguida, siga as instruções do fabricante e trate cinco microgramas da inserção com um microliter de mistura de enzimas de corte rápido. Em seguida, inativar a mistura de enzimas a 70 graus Celsius por 10 minutos.Para preparar o vetor de filtragem, primeiro digerir cinco microgramas do vetor de clonagem purificado com enzima de restrição EcoRV. Em seguida, carregue os vetores digeridos e não digeridos e o marcador molecular em um gel de 1%agarose. Em seguida, o calor inativa a enzima de restrição a 80 graus Celsius por 20 minutos.Em seguida, fosforilizar o vetor digerido com cinco unidades de enzima fosfata e 1/10 de volume do tampão fosfates de 10X. Em seguida, incubar a mistura a 37 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, inativar a enzima fosfattase a 65 graus Celsius por cinco minutos.Em seguida, extrair o plasmídeo do gel e purificar o DNA. Em seguida, meça a concentração do DNA no espectrofotômetro UV. Para realizar a reação de ligadura, adicione 400 nanogramas das pastilhas fosforiladas a um micrograma de vetor digestado, tampão de ligase de DNA 10X T4 e liga liga ligase de DNA T4 a um volume final de 100 microliters.Em seguida, incubar a reação de ligadura a 16 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, o calor inativa a liga ligase a 65 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, adicione 1/10 de volume de três acetato de sódio molar no pH 5.2 e 2,5 volumes de 100% etanol para precipitar o produto de ligadura.Para precipitar o DNA, misture os reagentes e congele a menos 80 graus Celsius por 20 minutos. Após 20 minutos, centrífuga na velocidade mais alta por 20 minutos a quatro graus Celsius. Depois da centrifugação, expulse o supernasce.À pelota, adicione 500 microliters de frio 70% de etanol e novamente centrífuga. Descarte o supernatante no final da centrifugação. Uma vez que a pelota é seca ao ar, dissolva o DNA precipitado em 10 microliters de água.Antes de realizar a eletroporação, organize o número adequado de tubos de microcentrifuuge e cuvettes de eletroporação de 0,1 centímetro no gelo. Em seguida, adicione um microliter do produto de ligadura purificada a 25 microliters das células. Em seguida, pipeta o DNA, mistura celular para a cuvette eletroporação fria e flick o tubo.Em seguida, limpe a água do exterior da cuvette e coloque na unidade de eletroporação e bata no pulso. Após o fim da eletroporação, adicione rapidamente um mililitro de meio YT líquido 2X sem qualquer antibiótico às células da cuvette. Em seguida, transfira a mistura celular para um tubo de 10 mililitros.Deixe o tubo em um agitador a 220 revoluções por minuto a 37 graus Celsius por uma hora. Emplaque as diluições da biblioteca em placas de ágar YT de 10 centímetros 2X suplementadas com clororamfenicol, ampicillina e apenas clororamfenicol. Isto é para obter colônias únicas a serem testadas por PCR e realizar a titulação.Em seguida, emplaque as células competentes transformadas em placas de ágar YT de 15 centímetros 2X suplementadas com clorofenicol e ampicillina. Em seguida, incubar as placas a 30 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, conte as colônias escolhendo a diluição onde são contáveis.Então calcule o tamanho da biblioteca. O tamanho da biblioteca é calculado da seguinte forma, o número médio de colônia vezes fator de diluição vezes o volume total da biblioteca. O tamanho da biblioteca deve ser da ordem de 10 ao poder de seis clones.Se a concentração de ampicilina for ideal para realizar mais filtragem, o número de clones reduz para um a 20 do obtido na ausência deste antibiótico. Para testar as colônias positivas, use uma dica para pegar cerca de 15 a 20 colônias individuais. Em seguida, diluir as colônias com 100 microliters de 2X YT médio sem antibióticos.Em seguida, pcr amplificar 0,5 microliter da cultura como modelo de DNA com polimerase de DNA Taq. Durante o PCR, execute 25 ciclos de amplificações usando temperatura de ressarção de 55 graus Celsius e um tempo de extensão de 40 segundos a 72 graus Celsius. Verifique se o comprimento da pastilha está na faixa esperada de 150 a 750 pares de base.E que diferentes colônias apresentam diferentes inserções com tamanhos diferentes. Isso indica uma boa preparação da biblioteca em termos de variabilidade. Em seguida, adicione três mililitros de meio YT 2X fresco às placas de 150 milímetros para coletar as bactérias.Em seguida, colher as bactérias usando um raspador estéril. Depois de misturar bem, adicione 20% de glicerol e deixe em menos 80 graus Celsius em alíquotas para uso futuro. Para uso imediato, execute o kit de extração plasmídeo baseado em coluna para purificar o DNA plasmídeo de uma das alíquotas da biblioteca antes de adicionar glicerol.Meça a concentração do DNA no espectrofotômetro UV e, em seguida, armazene as amostras a menos 20 graus Celsius até o uso. Use 2,5 microliters da biblioteca como modelo de DNA para amplificação pcr. Defina as condições do termociclador e inicie a corrida.Em seguida, use um kit pcr de índice para executar pcr índice. Isso sequenciará as bibliotecas indexadas duplas dentro de executas de Illumina multiplexada. Em seguida, defina as condições do termociclador e inicie a corrida.Após a purificação com contas AMPure XP, para verificar o tamanho, execute um microliter de uma a 10 diluição da biblioteca final no bioanalíter. Em seguida, quantifique selecionando a região do traço final da biblioteca. Essas representações esquemáticas demonizam que após a clonagem no vetor do filtro P, apenas colônias correspondentes aos ORFs produzem beta-lactamase funcional na presença de antibióticos.Depois de filtrar uma diminuição no número de clones de 20 vezes é esperado. Com orfs de boa pasta crescendo em concentrações de antibióticos mais altas. Além disso, os fragmentos ORF podem ser facilmente recuperados da biblioteca filtrada.Uma biblioteca de ORF phagemid é construída para realizar a seleção de exibição de phage contra proteínas-alvo ou anticorpos. Todas as bibliotecas e as saídas obtidas são então profundamente analisadas pelo NGS. O NGS fornece informações completas sobre diversidade de bibliotecas, abundância e mapeamento preciso de cada um dos fragmentos selecionados.Finalmente, o webtool interactome busca desenvolvido gera leituras de sequenciamento bruto que vão até a lista de domínios putativos com anotações genômicas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como construir e validar uma biblioteca domainome a partir de uma fonte de DNA desejada. E para realizar uma triagem de alto rendimento da biblioteca por sequenciamento de próxima geração.Otimizamos o sequenciamento das bibliotecas de filtragem ORF com as plataformas Illumina e desenvolvemos um webtool que possibilita a análise desse tipo de dados sem qualquer necessidade de habilidades de programação.

Research

JoVE Journal

Biology

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Primer-Free Seleção Aptamer usando uma biblioteca de DNA Aleatório

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Biologia

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Peptídeos de Phage Biblioteca Mostrar modular a expressão de genes em células mesenquimais e potenciar a osteogênese em defeitos ósseos unicorticais

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Microscopia de fluorescência de Triagem e seqüenciamento da próxima geração: Ferramentas úteis para a identificação de genes envolvidos na integridade das Organelas

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Um protocolo para exibição Fago e Affinity Seleção Usando Iscas proteína recombinante

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

O sequenciamento de próxima geração de 16S RNA ribossomal Gene amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Alvejado DNA análise de metilação por Sequenciação de próxima geração

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplificação, sequenciamento de próxima geração, e Genomic DNA Mapeamento das retrovirais Integração Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

3' final de preparação da biblioteca com A-seq2 de sequenciamento

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Caracterização de Microbiome carrapato de próxima geração 16S rRNA Amplicon sequenciação

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Análise de microbiota usando PCR de duas etapas e sequenciamento do gene 16S rRNA de próxima geração

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