Name: interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing
Uploaded: 2018-10-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing at JoVE.com

Эта работа была поддержана грант от министерства образования Италии и университета (2010P3S8BR_002 КТ).

1. Строительство ORF библиотеки (рис. 1)
<ol><li>Подготовка Вставка ДНК
	<ol>
<li>
Подготовка фрагментов из синтетических или геномной ДНК
		<ol>
<li>Экстракт/очищают ДНК, используя стандартные методы26.</li>
			<li>Фрагмент ДНК в sonication. Если с помощью стандар?...

<ol>
	<li>Loman, N. J., Pallen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+bacterial+genome+sequencing.">Twenty years of bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).</li><li>Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+annotation+error+rate+of+curated+GO+database+sequence+annotations.">Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations.</a> BMC Bioinformatics. 8 (1), 170 (2007).</li><li>Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+inconsistencies+in+genome-wide+protein+function+annotations:+a+machine+learning+approach.">Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach.</a> BMC Bioinformatics. 8 (1), 284 (2007).</li><li>Wong, W. -. C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+Than+1,001+Problems+with+Protein+Domain+Databases:+Transmembrane+Regions,+Signal+Peptides+and+the+Issue+of+Sequence+Homology.">More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology.</a> PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867 (2010).</li><li>Bioinformatics, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+correction+of+abnormal,+incomplete+and+mispredicted+proteins+in+public+databases.">Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases.</a> BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).</li><li>Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+on+a+proteomic+scale.">Protein analysis on a proteomic scale.</a> Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).</li><li>DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaleable+and+integrated+crystallization+pipeline+applied+to+mining+the+Thermotoga+maritima+proteome.">A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome.</a> J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).</li><li>Nordlund, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+open+reading+frames+from+DNA.">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li><li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interactome+profiling+by+massive+sequencing.">Rapid interactome profiling by massive sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 38 (9), e110 (2010).</li><li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).</li><li>Heger, A., Holm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaustive+enumeration+of+protein+domain+families.">Exhaustive enumeration of protein domain families.</a> J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).</li><li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+open+reading+frames+from+DNA.">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li><li>Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+of+cDNA+libraries:+Enrichment+of+cDNA+expression+using+open+reading+frame+selection.">Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection.</a> Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+&#945;-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+(RIDome).">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of &#945;-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li><li>Collins, M. O., Choudhary, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+multiprotein+complexes+by+affinity+purification+and+mass+spectrometry.">Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).</li><li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).</li><li>Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+Drosophila+gene+coding+for+a+protein+containing+a+novel+phosphatidylserine-binding+motif.">Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif.</a> J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).</li><li>Deng, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+antibody+single-chain+variable+fragments+with+improved+carbohydrate+binding+by+phage+display.">Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display.</a> J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).</li><li>Danner, S., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+phage+display:+A+novel+genetic+selection+system+for+cloning+RNA-binding+proteins+from+cDNA+libraries.">T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).</li><li>Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+chain+antibodies+specific+for+fatty+acids+derived+from+a+semi-synthetic+phage+display+library.">Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library.</a> Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+&#945;-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+(RIDome).">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of &#945;-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li><li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Protocols+in+Molecular+Biology.">Current Protocols in Molecular Biology.</a> Mol Biol. 1 (2), 146 (2003).</li><li>Sblattero, D., Bradbury, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+recombination+in+single+bacteria+to+make+large+phage+antibody+libraries.">Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries.</a> Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).</li><li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+:+architecture+and+applications.">BLAST+: architecture and applications.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 421 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+The+Swiss-Army+tool+for+genome+feature+analysis.">BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis.</a> Curr Protoc Bioinforma. , (2014).</li><li>Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBrowse:+A+next-generation+genome+browser.">JBrowse: A next-generation genome browser.</a> Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).</li><li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+monoclonal+antibody+epitopes+by+filtered+gene+fragment+phage+display.">Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display.</a> Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li></ol>

Создание высокого качества весьма разнообразны ORFs отфильтрованных библиотеки является первым важным шагом в рамках всей процедуры так, как оно повлияет на все последующие шаги трубопровода.
Важной особенностью выгодно нашего метода является, что любой источник (intronless) ...

Здесь мы описываем метод высокой пропускной способностью для строительства и выбор библиотек складывается и растворимого белка доменов из любого источника, генной/геномной начиная. Этот подход сочетает в себе три различные технологии: фага дисплей, использование складной репортером и следующего поколения последовательности (НГС) с конкретным веб-инструмент для анализа данных. Методы могут использоваться во многих различных контекстах белка на основе исследований, для идентификации и аннотации новых доменов белков/белков, характеристика структурных и функциональных свойств известных белков, а также определение белок взаимодействие сети.
Многие открытые вопросы по-прежнему присутствуют в исследованиях на основе белков и разработки методов для оптимального белок производства является важной потребность в нескольких областях расследования. Например несмотря на наличие тысяч геномов прокариот и эукариот1, соответствующий карта относительной протеомов аннотацию прямого закодированного белков и пептидов отсутствует до сих пор подавляющее большинство организмов. Каталог полный протеомов становится сложной цели, требующие огромных усилий в плане времени и ресурсов. Золотой стандарт для экспериментальных заметки остается клонирования все открытые рамки считывания (ORFs) генома, строительство так называемой «ORFeome». Обычно функции гена назначается на основании гомологии связанных генов известных деятельности, но этот подход является недостаточно точной из-за наличия многих неправильные аннотации в справочных баз данных2,3,4, 5. Кроме того, даже для белков, которые были выявлены и комментариями, дополнительные исследования необходимы для достижения характеристика с точки зрения обилия, выражений шаблонов в разных контекстах, включая структурные и функциональные свойства, а также взаимодействие сетей.
Кроме того поскольку белки состоят из разных доменов, каждый из них показаны специфические особенности и вклад в по-разному функций белков, изучение и точное определение этих доменов может позволить более полную картину, как на сингл гена и на уровне полного генома. Все необходимая информация делает исследования белков на широкой и сложной области.
В этой перспективе важный вклад могут предоставляться на беспристрастной и высок объём методы для производства белка. Однако успех таких подходов, рядом значительных инвестиций, необходимых, опирается на способность производить растворимый/стабильный белка конструкции. Это основные ограничения фактор, так как было подсчитано, что только около 30% белков может успешно выразил и производится на достаточных уровнях экспериментально полезным6,,78. Подход для преодоления этого ограничения основан на использовании случайно фрагментированных ДНК, чтобы произвести различных полипептидов, которые вместе обеспечивают перекрывающихся фрагментов представление отдельных генов. Только небольшой процент случайных фрагментов ДНК являются функциональные ORFs, хотя подавляющее большинство из них являются нефункциональные (благодаря наличию стоп-кодонов внутри их последовательностей) или кодировать для неестественное (ORF в кадре оригинал) полипептиды с биологического смысла.
Для решения всех этих вопросов, наша группа разработала высок объём белка выражение и взаимодействие анализ платформу, которая может быть использована на геномной масштаб9,10,и11,12. Эта платформа включает следующие методики: 1) метод для выбора коллекции правильно сложенный протеин доменов из кодирования части ДНК от любого организма; 2 технология отображения фага для выбора партнеров взаимодействия; 3) NGS полностью характеризовать весь interactome стадии изучения и выявления клонов интерес; и 4) веб-инструмент для анализа данных для пользователей без каких-либо биоинформатики или навыков программирования для выполнения анализа Interactome-Seq в простым и удобным способом.
Использование этой платформы обеспечивает важные преимущества по сравнению альтернативных стратегий расследования; Прежде всего этот метод полностью беспристрастной, высокой пропускной способности и модульные для исследования, начиная от одного гена до всего генома. Первый шаг конвейера является создание библиотеки от случайно фрагментированных ДНК исследуемых, который характеризуется затем глубоко NGS. Эта библиотека генерируется с использованием вектора инженерии где генов/фрагменты интерес клонируются между последовательность сигнала для секреции белков в Периплазматическое пространство (т.е., лидер Sec) и гена β-лактамаз ТЭМ1. Синтез белка будет наделять ампициллин сопротивления и способность выжить под давлением ампициллин, только в том случае, если клонированные фрагменты в кадр с этими элементами и результате синтез белка является правильно сложенные10,13 ,14. Все клоны спасли после антибиотика выбора, так называемые «фильтруют клонов», ORFs, подавляющее большинство из них (более 80%) и являются производными от реальных генов9. Кроме того сила этой стратегии заключается в выводах, что все клоны фильтрации ORF кодирования для правильно сложить/растворимые белки/домены15. Как много клонов, присутствует в библиотеке и картирования в том же регионе или домена, имеют разные начальные и конечные точки, это позволяет беспристрастной, единый этапа идентификации минимальная фрагментов, которые могут привести к растворимых продуктов.
Дальнейшее совершенствование технологии предоставляется с помощью NGS характеризуют библиотеки. Сочетание этой платформы и конкретных веб-инструмент для анализа данных дает важные объективную информацию на точное нуклеотидных последовательностей и расположение выбранных ORFs на ссылку ДНК исследуемых без необходимости дальнейших обширных анализов или экспериментальные работы.
Domainome библиотеки могут передаваться в контекст выделения и используется в качестве универсального инструмента для выполнения функциональных исследований. Высок объём белка выражение и взаимодействие анализ платформы что мы интегрированы и что мы называли Interactome-Seq использует преимущества технологий отображения Фаговые путем передачи фильтрованного ORF в phagemid вектор и создания ФАГ ORF Библиотека. После повторного клонирован в контекст отображения фага, белка, домены отображаются на поверхности частиц M13; Таким образом domainome библиотек можно непосредственно выбрать для фрагментов гена кодирования домены с конкретными ферментативную деятельность или привязки свойств, позволяя interactome сети профилирования. Этот подход был первоначально описан Zacchi соавт. 16 и позднее используется в нескольких других контексте13,17,18.
По сравнению с другими технологиями, используется для изучения взаимодействия протеин протеина (включая дрожжей два гибридной системы и масс-спектрометрии19,20), одно из главных преимуществ является усиление связывание партнера, что происходит во время ФАГ Отображение нескольких раундов выделения. Это увеличивает выбор чувствительности, таким образом позволяя выявление низкой обильные связывания белков доменов присутствует в библиотеке. Эффективность отбора выступал с ORF-фильтрации библиотеки далее увеличивается из-за отсутствия нефункциональные клонов. Наконец технология позволяет выбор выполняться против белков и не протеинового приманки21,,2223,24,25.
Фаговые выборки с использованием библиотеки domainome ФАГ может производиться с использованием антител, исходя из сыворотки больных с различных патологических состояний, например аутоиммунных заболеваний13, рака или инфекции заболеваний как приманку. Этот подход используется для получения так называемого «антитело подпись» болезни под исследования, позволяющие массово идентифицировать и охарактеризовать антигены/epitopes конкретно признаны больных антител в то же время. По сравнению с другими методами использование фага дисплей позволяет идентификации как линейной, так и конформационные антигенных эпитопам. Выявление конкретных подписи потенциально может иметь важное значение для понимания патогенеза, новый дизайн вакцины, выявление новых терапевтических целей и развития новых и конкретных инструментов, диагностические и прогностические. Кроме того когда исследование сосредоточено на инфекционные заболевания, основным преимуществом является, что открытие иммуногенных белков зависит от выращивания патогена.
Наш подход подтверждает, что складной журналистам может использоваться в геномной масштабе для выбора «domainome»: коллекция правильно сложенные, хорошо выраженной, растворимые белки доменов от кодирования части ДНК или cDNA от любого организма. Когда изолированные фрагменты белка полезны для многих целей, предоставляя основные экспериментальной информации для гена аннотации, а что касается структурных исследований, антитела epitope сопоставления, выявления антигена, и т.д. Полнота высок объём данных, предоставленных NGS позволяет анализ сложных образцов, таких как Фаговые отображения библиотек и имеет потенциал, чтобы обойти традиционной трудоемкой собирание и тестирование отдельных Фаговые спасли клонов.
В то же время благодаря функции отфильтрованных библиотеки и крайняя чувствительность и мощности NGS анализа можно определить ответственность каждого взаимодействия непосредственно на начальном экране, без необходимости создания домена протеина дополнительные библиотеки для каждого неизбежно белка. NGS позволяет получить всеобъемлющее определение всей domainome любого генно/геномной начиная источника и данных анализа веб-инструмент позволяет получение весьма специфические характеристики с качественной и количественной точки зрения interactome белки доменов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1817px;" width="1817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sonopuls&#160; ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:444px;">Bandelin</td>
			<td style="width:423px;">HD2070</td>
			<td style="width:557px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0321</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0311</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Molecular Biology Agarose</td>
			<td style="width:444px;">BioRad</td>
			<td style="width:423px;">161-3102</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Green Gel Plus</td>
			<td style="width:444px;">Fisher Molecular Biology</td>
			<td style="width:423px;">FS-GEL01</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">R0611</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28704</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Quick Blunting Kit</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">E1201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:393px;">NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">S1420S</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">EcoRV</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0195L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Antarctic Phosphatase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sodium Acetate 3M pH5.2</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ethanol for molecular biology</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:423px;">E7023</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DH5aF&#39; bacteria cells</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,2 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">1,5 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,1 cm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:444px;">Biosigma</td>
			<td style="width:423px;">4905020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Electroporator 2510</td>
			<td style="width:444px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">2x YT medium</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DreamTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EP0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">96-well thermal cycler (with heated lid)</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">150 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">100 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BssHII</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0199L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NheI</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M13KO7 Helper Phage</td>
			<td style="width:444px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>27-1524-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Cloride (NaCl)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagnaRack Magnetic Separation Rack</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonfat dried milk powder</td>
			<td style="width:444px;">EuroClone</td>
			<td>EMR180500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KAPA HiFi HotStart ReadyMix&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Kapa Biosystems, Fisher Scientific</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP beads&#160;</td>
			<td>Agencourt, Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nextera XT dual Index&#160; Primers&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Illumina</td>
			<td>FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq or Hiseq2500&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotomer</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent Bioanalyzer or TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>&#160;5&#8217; TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAGCAAGCGGCGCGCATGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGATTGGTTTGCCGCTAGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing

Складной журналисты являются белки с легко идентифицировать фенотипы, например антибиотикам, складные и функции которого нарушается, когда сливается с плохо складывания белки или случайных открытом чтения фреймов. Мы разработали стратегию, где, используя ТЭМ-1 β-лактамаз (фермент, присвоении ампициллин сопротивления) в геномной масштабе, мы можем выбрать коллекции правильно сложенный протеин доменов из кодирования части ДНК любой intronless генома. Фрагменты белка, полученные на этот подход, так называемые «domainome», будет хорошо выражена и растворимые, что делает их пригодными для структурно функциональных исследований.
Клонирование и отображение «domainome» непосредственно в систему отображения фага, мы показали, что это можно выбрать конкретные белка домены с желаемой привязки свойств (например, другие белки или антитела), обеспечивая тем самым важным экспериментальной информации для идентификации генов аннотации или антигена.
Выявление наиболее обогащенного клонов в выбранной поликлональных населения может быть достиган с использованием Роман секвенирование нового поколения технологий (НГС). По этим причинам мы представляем глубокую последовательности анализа самой библиотеки и выбора мероприятий предоставлять полную информацию о разнообразии, изобилия и точное сопоставление каждого выбранного фрагмента. Протоколы, представленные здесь показать основные шаги для строительства библиотеки, характеристик и проверки.

Метод фильтрации схематизируются на рисунке 1. Каждый вид intronless ДНК может использоваться. На рисунке 1A представлена первая часть фильтрации подхода: после загрузки на геле агарозы или bioanalyzer, хороший фрагментация ДНК интерес появляется...

Watch this Scientific Journal Video about Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing at JoVE.com

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: Протокол для строительства Domainome Библиотека, проверки и отбора Фаговые отображения и следующего поколения последовательности

Протоколы, описанные разрешить строительство, характеристика и выбор (против целевого выбора) из любого источника ДНК библиотеки «domainome». Это достигается путем исследования трубопровода, который сочетает в себе различные технологии: фага дисплей, складной репортером и следующего поколения последовательности с веб-инструмент для анализа данных.

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в исследованиях на основе белка, таких как аннотация новых белков или белковых доменов, характеристика структурных и функциональных свойств известных белков, определение сетей взаимодействия белков или подписей антигенных антител в различных условиях. Основным преимуществом этой техники является то, что она является абсолютно беспристрастной, высокой пропускной способностью и модульной для любого вида исследования, начиная от одного гена до целого генома. Строительство библиотеки domainone очень полезно для функциональных исследований.Он может быть передан в контекст фагового отображения и использоваться для отбора против различных целей, таких как связывающие белки или очищенные антитела. Связь с NGS позволяет чрезвычайно чувствительный и мощный анализ. В то же время, веб-инструменты, специально разработанные дает точную характеристику всего domainome и interactome.Чтобы построить библиотеку ORF во-первых, sonicate ДНК с 30 секунд импульсов на 100% выход. После соникации загрузите лестницу и звуковую ДНК на гель 1.5%agarose. Затем запустите электрофорезный блок на пять вольт в течение 15 минут.Электрофорез агарозного геля показывает наличие мазка ДНК, подтверждающего сонику. Это по сравнению с твердой полосой, полученной из ДНК, не подвергаемой соникации. Затем вырезать гель часть с фрагментированной мазок ДНК и очистить с помощью колонки на основе геля извлечения комплекта.Измерьте концентрацию очищенной ДНК в УФ-спектрофотометре. Затем следуйте инструкциям производителя и обработать пять микрограммов вставки одним микролитером быстрой притупляем ферментной смеси. Затем инактивировать ферментную смесь при 70 градусах по Цельсию в течение 10 минут.Чтобы подготовить вектор фильтрации, сначала переварите пять микрограммов очищенного вектора клонирования с ферментом ограничения EcoRV. Затем загрузите переваренные и непереваренные векторы и молекулярный маркер на гель 1%agarose. Затем нагрейте инактивировать фермент ограничения при температуре 80 градусов по Цельсию в течение 20 минут.Далее фосфорилат переваренный вектор с пятью единицами фермента фосфатазы и 1/10 тома 10X фосфатазы буфера. Затем инкубировать смесь при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут. Затем инактивировать фермент фосфатазы при 65 градусах цельсия в течение пяти минут.Затем извлекайте плазмиду из геля и очищаете ДНК. Затем измерьте концентрацию ДНК в УФ-спектрофотометре. Для выполнения реакции перевязки добавьте 400 нанограммов фосфорилированных вставок в один микрограмм переваренного вектора, буфер ДНК-лигазы 10X T4 и липсию ДНК T4 к окончательному объему в 100 микролитров.Затем инкубировать реакцию перевязки при 16 градусах по Цельсию на ночь. На следующий день, тепло инактивировать лигазы при температуре 65 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Далее добавьте 1/10 тома трех ацетат молярного натрия при рН 5,2 и 2,5 тома 100% этанола для осаждения перевязки продукта.Чтобы вызвать ДНК, смешайте реагенты и заморозить при температуре минус 80 градусов по Цельсию в течение 20 минут. Через 20 минут центрифуга на максимальной скорости в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия. После центрифугации изгнать супернатанта.К гранулам добавьте 500 микролитров холодного 70%этанола и снова центрифугу. Откажитесь от супернатанта в конце центрифугации. Как только гранулы высушиваются, растворяйте осажденную ДНК в 10 микролитров воды.Перед выполнением электропорации организуйте соответствующее количество микроцентрифуговых трубок и 0,1 сантиметра электропорации кюветов на льду. Затем добавьте один микролитер очищенного продукта перевязки в 25 микролитров клеток. Затем пипетка ДНК, клеточная смесь к холодной электропорации cuvette и Флик трубки.Затем протрите воду с внешней стороны кюветта и поместите в электропорацию и ударяет импульс. После электропорации, быстро добавить один миллилитр жидкости 2X YT среды без каких-либо антибиотиков в клетках в кювете. Затем перенесите клеточную смесь в 10 миллилитровую трубку.Оставьте трубку на шейкере при 220 оборотов в минуту при 37 градусах по Цельсию в течение часа. Плита разбавления библиотеки на 10 сантиметров 2X YT агар пластины дополнены хлорамфеникол, ампициллин и только хлорамфеникол. Это необходимо для получения одиночных колоний для тестирования ПЦР и выполнения титрова.Далее пластины преобразованы компетентные клетки на 15 сантиметров 2X YT агар пластины дополнены хлорамфеникол и ампициллин. Затем инкубировать пластины при 30 градусах по Цельсию на ночь. На следующий день подсчитайте колонии, выбирающих разбавление там, где они подсчитываются.Затем вычислите размер библиотеки. Размер библиотеки рассчитывается следующим образом, среднее время разбавления коэффициента библиотеки общего объема библиотеки. Размер библиотеки должен быть порядка 10 до власти шести клонов.Если концентрация ампициллина оптимальна для выполнения более фильтрации, число клонов уменьшается до одного до 20, что получено в отсутствие этого антибиотика. Чтобы проверить положительные колонии, используйте наконечник, чтобы забрать около 15 до 20 одиночных колоний. Затем разбавить колонии 100 микролитров 2X YT среды без антибиотиков.Далее, PCR усиливают 0,5 микролитр культуры в качестве шаблона ДНК с полимеразой Taq DNA. Во время ПЦР запустите 25 циклов усиления с использованием температуры 55 градусов по Цельсию и времени продления на 40 секунд при температуре 72 градуса по Цельсию. Убедитесь, что длина вставки находится в ожидаемом диапазоне от 150 до 750 базовых пар.И что различные колонии представляют различные вставки с разным размером. Это свидетельствует о хорошей подготовке библиотеки с точки зрения изменчивости. Затем добавьте три миллилитров свежей среды 2X YT к 150-миллиметровым пластинам для сбора бактерий.Затем урожай бактерий с помощью стерильного скребка. После тщательного смешивания добавьте 20%глицерол и оставьте в минус 80 градусов по Цельсию в алицитах для дальнейшего использования. Для немедленного использования выполните набор для извлечения плазмидной плазмиды на основе столбца, чтобы очистить плазмидную ДНК от одной из алицитов библиотеки перед добавлением глицерола.Измерьте концентрацию ДНК в ультрафиолетовом спектрофотометре, а затем храните образцы при температуре минус 20 градусов по Цельсию до их использования. Используйте 2,5 микролитера библиотеки в качестве шаблона ДНК для усиления ПЦР. Установите условия термоциклера и начните бег.Далее используйте набор индексных ПЦР для выполнения индексного ПЦР. Это позволит секвенировать двойные индексы библиотек в мультиплексных работает Illumina. Затем установите условия термоциклера и начните бег.После очистки бисером AMPure XP, чтобы проверить размер, запустите один микролитер от одного до 10 разбавления окончательной библиотеки на биоанализе. Затем количественно, выбрав область окончательного следа библиотеки. Эти схематические представления демонизируют, что после клонирования в вектор фильтра P, только колонии, соответствующие ORFs производят функциональную бета-лактамазу в присутствии антибиотиков.После фильтрации ожидается уменьшение числа клонов в 20 раз. С хорошей папкой ORFs растет при более высоких концентрациях антибиотиков. Кроме того, фрагменты ORF можно легко восстановить из фильтрованной библиотеки.Фагемид ORF библиотека построена для выполнения выбора фагов дисплей против целевых белков или антител. Все библиотеки и полученные результаты затем глубоко анализируются NGS. NGS предоставляет полную информацию о разнообразии библиотек, изобилии и точном отображении каждого из выбранных фрагментов.Наконец interactome искать webtool разработан генерирует сырья секвенирования читает, начиная со списка осядой доменов с геномными аннотациями. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание того, как построить и проверить библиотеку domainome из желаемого источника ДНК. И для выполнения высокой пропускной способности скрининга библиотеки следующего поколения последовательности.Мы оптимизировали секвенирование библиотек фильтрации ORF с платформами Illumina и разработали веб-инструмент, который позволяет анализ такого рода данных без необходимости навыков программирования.

Research

JoVE Journal

Biology

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Primer-Свободное выделение аптамер Использование случайных библиотеки ДНК

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Пептидов из библиотеки Показать Фаг Модуляция экспрессии генов в клетки и мезенхимальные Потенцирует остеогенез в Unicortical костных дефектов

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Флуоресценции микроскопии Скрининг и следующего поколения секвенирования: Полезные инструменты для идентификации генов, вовлеченных в органелл Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Протокол для фагов и Affinity выделение с помощью рекомбинантного белка Приманки

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Следующее поколение Секвенирование 16S рибосомальной РНК генов ампликонов

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Целевые метилирования ДНК Анализ Следующее поколение Секвенирование

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Amplification, следующего поколения Секвенирование и геномную ДНК Mapping ретровирусных интеграции сайты

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

3' конца последовательности подготовки библиотека с A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Характеристика микрофлора клеща, следующего поколения 16S рРНК ампликон последовательности

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Анализ микробиоты с использованием двухступенчатого ПЦР и секвенирования гена нового поколения 16S rRNA

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...