Name: interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing
Uploaded: 2018-10-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing at JoVE.com

Detta arbete stöds av ett bidrag från italienska ministeriet för utbildning och universitet (2010P3S8BR_002 till CP).

1. konstruktion av ORF biblioteket (figur 1)
<ol><li>Beredning av Infoga DNA
	<ol>
<li>
Fragment förberedelse från syntetiska eller genomisk DNA
		<ol>
<li>Utdrag/rena DNA med hjälp av standardmetoder26.</li>
			<li>DNA-fragment av ultraljudsbehandling. Om använder en standard någon sonikator, allmänna förslag till att börja med 30 s pulser på 100% effekt. Obs: Pilot experiment bör göras med olika kraft och ultraljudsb...

<ol>
	<li>Loman, N. J., Pallen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+bacterial+genome+sequencing.">Twenty years of bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).</li><li>Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+annotation+error+rate+of+curated+GO+database+sequence+annotations.">Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations.</a> BMC Bioinformatics. 8 (1), 170 (2007).</li><li>Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+inconsistencies+in+genome-wide+protein+function+annotations:+a+machine+learning+approach.">Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach.</a> BMC Bioinformatics. 8 (1), 284 (2007).</li><li>Wong, W. -. C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+Than+1,001+Problems+with+Protein+Domain+Databases:+Transmembrane+Regions,+Signal+Peptides+and+the+Issue+of+Sequence+Homology.">More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology.</a> PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867 (2010).</li><li>Bioinformatics, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+correction+of+abnormal,+incomplete+and+mispredicted+proteins+in+public+databases.">Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases.</a> BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).</li><li>Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+on+a+proteomic+scale.">Protein analysis on a proteomic scale.</a> Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).</li><li>DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaleable+and+integrated+crystallization+pipeline+applied+to+mining+the+Thermotoga+maritima+proteome.">A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome.</a> J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).</li><li>Nordlund, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+open+reading+frames+from+DNA.">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li><li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interactome+profiling+by+massive+sequencing.">Rapid interactome profiling by massive sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 38 (9), e110 (2010).</li><li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).</li><li>Heger, A., Holm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaustive+enumeration+of+protein+domain+families.">Exhaustive enumeration of protein domain families.</a> J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).</li><li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+open+reading+frames+from+DNA.">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li><li>Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+of+cDNA+libraries:+Enrichment+of+cDNA+expression+using+open+reading+frame+selection.">Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection.</a> Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+&#945;-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+(RIDome).">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of &#945;-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li><li>Collins, M. O., Choudhary, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+multiprotein+complexes+by+affinity+purification+and+mass+spectrometry.">Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).</li><li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).</li><li>Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+Drosophila+gene+coding+for+a+protein+containing+a+novel+phosphatidylserine-binding+motif.">Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif.</a> J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).</li><li>Deng, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+antibody+single-chain+variable+fragments+with+improved+carbohydrate+binding+by+phage+display.">Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display.</a> J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).</li><li>Danner, S., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+phage+display:+A+novel+genetic+selection+system+for+cloning+RNA-binding+proteins+from+cDNA+libraries.">T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).</li><li>Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+chain+antibodies+specific+for+fatty+acids+derived+from+a+semi-synthetic+phage+display+library.">Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library.</a> Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+&#945;-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+(RIDome).">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of &#945;-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li><li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Protocols+in+Molecular+Biology.">Current Protocols in Molecular Biology.</a> Mol Biol. 1 (2), 146 (2003).</li><li>Sblattero, D., Bradbury, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+recombination+in+single+bacteria+to+make+large+phage+antibody+libraries.">Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries.</a> Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).</li><li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+:+architecture+and+applications.">BLAST+: architecture and applications.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 421 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+The+Swiss-Army+tool+for+genome+feature+analysis.">BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis.</a> Curr Protoc Bioinforma. , (2014).</li><li>Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBrowse:+A+next-generation+genome+browser.">JBrowse: A next-generation genome browser.</a> Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).</li><li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+monoclonal+antibody+epitopes+by+filtered+gene+fragment+phage+display.">Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display.</a> Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li></ol>

Skapandet av en hög kvalitet mycket skiftande ORFs filtrerade bibliotek är ett första viktigt steg i hela förfarandet eftersom det kommer att påverka alla efterföljande steg i rörledningen.
Ett viktigt fördelaktiga inslag i vår metod är att någon källa (intronless) DNA (cDNA, genomiskt DNA, PCR härrör eller syntetiskt DNA) är lämplig för bibliotek konstruktion. Den första parameter som bör beaktas är att längden på de DNA-fragment som klonade in pFILTER vektorn bör ge en...

Här beskriver vi en hög genomströmning metod för konstruktion och urval av bibliotek av vikta och lösligt protein domäner från någon genic/genomisk start källa. Metoden kombinerar tre olika tekniker: phage display, användningen av fällbara reporter och nästa generations sekvensering (NGS) med en särskild webb-verktyg för dataanalys. Metoderna kan användas i många olika sammanhang av proteinbaserade forskning, för identifiering och annotering av nya proteiner och protein domäner, karakterisering av strukturella och funktionella egenskaper av kända proteiner samt definition av protein-interaction network.
Många öppna frågor finns kvar i protein-baserad forskning och utveckling av metoder för optimal proteinproduktion är ett viktigt behov för flera fält av undersökningen. Till exempel, trots tillgång till tusentals prokaryota och eukaryota genomen1saknas en motsvarande karta över den relativa proteom med en direkt annotation kodade proteiner och peptider fortfarande för den stora majoriteten av organismer. Katalogen över komplett proteom framstår som ett utmanande mål som kräver en stor insats i form av tid och resurser. Guldmyntfoten för experimentell annotation förblir kloning av alla öppna läsning ramar (ORFs) av en genomet, bygga den så kallade ”ORFeome”. Geners funktion tilldelas vanligen baserat på homologi relaterade gener med känd aktivitet men detta tillvägagångssätt stämmer dåligt på grund av många felaktiga anteckningar i referens databaser2,3,4, 5. Dessutom även för proteiner som har identifierats och kommenterad, ytterligare studier är skyldiga att uppnå karakterisering i form av överflöd, uttrycksmönster i olika sammanhang, inklusive strukturella och funktionella egenskaper som interaktion-nätverk.
Dessutom eftersom proteiner består av olika domäner, var och en av dem visar särdrag och på olika sätt bidrar till protein funktioner, studien och den exakta definitionen av dessa domäner kan tillåta en mer heltäckande bild, både på inre gen och på nivån fullständiga genomet. All denna nödvändiga information gör protein-baserade forskning en bred och utmanande fältet.
I detta perspektiv kan ett viktigt bidrag ges av opartiska och hög genomströmning metoder för produktion av proteiner. Men bygger framgången för sådana metoder, bredvid de betydande investeringar som krävs, på förmågan att producera lösliga/stable protein konstruktioner. Detta är en stor begränsande faktor eftersom det har uppskattats att endast ca 30% av proteiner kan vara framgångsrikt uttryckt och produceras vid tillräckliga nivåer för att experimentellt användbar6,7,8. En strategi för att övervinna denna begränsning bygger på användning av slumpmässigt fragmenterade DNA för att producera olika polypeptider, som tillsammans ger överlappande fragment representation av enskilda gener. Endast en liten andel av de slumpmässigt genererade DNA-fragmenten är funktionella ORFs medan den stora majoriteten av dem är icke-funktionella (på grund av förekomst av stop kodon inuti deras sekvenser) eller koda för un-naturliga (ORF i en annan bildruta än originalet) polypeptider med ingen biologisk betydelse.
För att lösa alla dessa problem, har vår grupp utvecklat en hög genomströmning protein uttryck och interaktion analysplattform som kan användas på en genomisk skala9,10,11,12. Denna plattform integrerar följande tekniker: 1) en metod att välja samlingar av korrekt vikta protein domäner från den kodande delen av DNA från någon organism; (2) den phage display tekniken för att välja partners av interaktioner; (3) NGS helt karakterisera den hela interactome under studien och identifiera klonerna av intresse. och 4) en webbverktyg för dataanalys för användare utan bioinformatik eller programmeringskunskaper att utföra Interactome-Seq analys på ett enkelt och användarvänligt sätt.
Användningen av denna plattform erbjuder viktiga fördelar över alternativa strategier av utredning. metoden är framförallt helt opartisk, hög genomströmning och modulära för studien som sträcker sig från en enda gen upp till en hela genomet. Det första steget av rörledningen är skapandet av ett bibliotek från slumpmässigt fragmenterade DNA under studien, som kännetecknas sedan djupt av NGS. Detta bibliotek genereras med en konstruerad vektor där gener/fragment av intresse klonade mellan en signal sekvens för protein sekretion i periplasmic utrymme (dvs, en s-ledare) och TEM1 β-laktamas gen. Proteinet fusion kommer att ge ampicillin-resistens och förmåga att överleva under ampicillin tryck endast om klonade fragment är i-frame med både dessa element och den resulterande fusionsprotein är korrekt vikta10,13 ,14. Alla kloner räddade efter antibiotika urval, den så kallade ”filtreras kloner”, ORFs och en stor majoritet av dem (mer än 80%), härrör från riktiga gener9. Dessutom ligger kraften i denna strategi i resultaten att alla ORF filtreras kloner kodning för korrekt vikta/lösliga proteiner/domäner15. Som många kloner, närvarande i biblioteket och kartläggning i samma region/domän, har olika start- och slutpunkter, tillåter detta opartisk, singel-steg identifiering av minsta fragment som sannolikt kommer att resultera i vattenlösliga produkter.
En ytterligare förbättring i tekniken ges genom användning av NGS att karakterisera biblioteket. Kombinationen av denna plattform och en särskild webb-verktyg för dataanalys ger viktig opartisk information om de exakta nukleotidsekvenser och på platsen för valda ORFs om hänvisningen DNA under studien utan behov av ytterligare omfattande analyser eller experimentella försök.
Domainome bibliotek kan överföras in i ett urval sammanhang och används som ett universellt instrument för att utföra funktionella studier. Hög genomströmning protein uttryck och interaktion analys plattformen att vi integrerat och som vi kallade Interactome-Seq tar fördel av phage displayteknik genom att överföra den filtrerade ORF i en phagemid vektor och skapa en phage-ORF bibliotek. En gång åter klonade in ett phage display sammanhang, protein domäner visas på ytan av M13 partiklar; på detta sätt kan domainome bibliotek direkt väljas för genen fragment kodning domäner med specifika enzymatiska aktiviteter eller bindande egenskaper, så att interactome networks profilering. Denna strategi beskrevs ursprungligen av Zacchi o.a. 16 och senare användas i flera andra sammanhang13,17,18.
En stor fördel jämfört med andra tekniker som används för att studera protein-protein interaktioner (inklusive jäst två hybridsystem och masspektrometri19,20), och är förstärkning av den bindande partner som uppstår under phage Visa flera rundor av urval. Detta ökar urval känsligheten således möjliggör identifiering av låg rikligt bindningsproteiner domäner finns i biblioteket. Markeringen utförs med ORF-filtrerad bibliotek effektivitet ökar ytterligare på grund av avsaknad av icke-funktionella kloner. Slutligen, tekniken gör markeringen till utföras mot både protein och icke-protein beten21,22,23,24,25.
Phage val med hjälp av domainome-phage biblioteket kan utföras med hjälp av antikroppar kommer från sera hos patienter med olika sjukdomstillstånd, t ex autoimmuna sjukdomar13, cancer eller infektion sjukdomar som bete. Denna metod används för att få den så kallade ”antikropp signaturen” sjukdomen enligt studien gör det möjligt att massivt identifiera och karaktärisera den antigener/epitoper uttryckligen erkänts av patienternas antikroppar på samma gång. Jämfört med andra metoder för användning av phage display möjliggör identifiering av både linjära och konfirmerande antigena epitoper. Identifiering av en specifik signatur kan potentiellt ha stor betydelse för förståelse patogenes, nya vaccin design, identifiering av nya terapeutiska mål och utveckling av nya och specifika diagnostiska och prognostiska verktyg. Dessutom när studien är inriktad på smittsamma sjukdomar, är en stor fördel att upptäckten av immunogent proteiner är oberoende från patogen odling.
Vår metod bekräftar att fällbara reportrar kan användas på genomisk nivå välja den ”domainome”: en samling av korrekt vikta, väl uttryckt, lösligt protein domäner från den kodande delen av DNA och/eller cDNA från någon organism. En gång isolerade protein fragment är användbara för många ändamål, att tillhandahålla väsentliga experimentella information för gen-kommentar samt när det gäller strukturella studier, antikropp epitop kartläggning, antigen identifiering, etc. Fullständighet i hög genomströmning som tillhandahålls av NGS möjliggör analys av komplexa prover, såsom phage display bibliotek, och har potential att kringgå traditionella mödosamma plockning och provning av individuella phage räddade kloner.
På samma gång tack vare funktionerna av filtrerade biblioteket och till extrema känslighet och kraften i NGS analysen är det möjligt att identifiera domänen protein ansvarig för varje interaktion direkt i en startskärm, utan att behöva skapa ytterligare bibliotek för varje bunden protein. NGS tillåter för att erhålla en heltäckande definition av den hela domainome av någon genic/genomisk start källa och dataanalysverktyget web obtainmenten av en mycket specifik karakterisering både från en kvalitativ och kvantitativ synvinkel av den interactome proteiner domäner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1817px;" width="1817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sonopuls&#160; ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:444px;">Bandelin</td>
			<td style="width:423px;">HD2070</td>
			<td style="width:557px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0321</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0311</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Molecular Biology Agarose</td>
			<td style="width:444px;">BioRad</td>
			<td style="width:423px;">161-3102</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Green Gel Plus</td>
			<td style="width:444px;">Fisher Molecular Biology</td>
			<td style="width:423px;">FS-GEL01</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">R0611</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28704</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Quick Blunting Kit</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">E1201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:393px;">NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">S1420S</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">EcoRV</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0195L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Antarctic Phosphatase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sodium Acetate 3M pH5.2</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ethanol for molecular biology</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:423px;">E7023</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DH5aF&#39; bacteria cells</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,2 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">1,5 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,1 cm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:444px;">Biosigma</td>
			<td style="width:423px;">4905020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Electroporator 2510</td>
			<td style="width:444px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">2x YT medium</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DreamTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EP0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">96-well thermal cycler (with heated lid)</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">150 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">100 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BssHII</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0199L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NheI</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M13KO7 Helper Phage</td>
			<td style="width:444px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>27-1524-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Cloride (NaCl)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagnaRack Magnetic Separation Rack</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonfat dried milk powder</td>
			<td style="width:444px;">EuroClone</td>
			<td>EMR180500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KAPA HiFi HotStart ReadyMix&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Kapa Biosystems, Fisher Scientific</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP beads&#160;</td>
			<td>Agencourt, Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nextera XT dual Index&#160; Primers&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Illumina</td>
			<td>FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq or Hiseq2500&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotomer</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent Bioanalyzer or TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>&#160;5&#8217; TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAGCAAGCGGCGCGCATGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGATTGGTTTGCCGCTAGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing

Fällbara reportrar är proteiner med lättidentifierbara fenotyper, såsom antibiotikaresistens, vars vikning och funktion äventyras när smält på dåligt fällbara proteiner eller slumpmässiga öppen läsning ramar. Vi har utvecklat en strategi där, genom att använda TEM-1 β-laktamas (enzymet ger ampicillin-resistens) på genomisk nivå, vi kan välja samlingar av korrekt vikta protein domäner från den kodande delen av DNA i någon intronless genomet. Protein fragment erhålls genom detta tillvägagångssätt, de så kallade ”domainome”, kommer att vara väl uttryckta och vattenlösliga, vilket gör dem lämpliga för strukturella/funktionella studier.
Genom kloning och visar den ”domainome” direkt i ett phage displaysystem, har vi visat att det är möjligt att välja specifikt protein domäner med önskad bindande egenskaper (t.ex. till andra proteiner eller antikroppar), vilket ger väsentliga experimentella uppgifter för genen anteckning eller antigen identifiering.
Identifiering av de mest berikat klonerna i en valda polyklonala population kan uppnås med hjälp av romanen nästa generations sekvensering teknik (NGS). Av dessa skäl införa vi djupsekvensering analys av själva biblioteket och urval utgångarna att ge fullständig information om mångfald, överflöd och exakt kartläggning av varje av de utvalda fragmenten. De protokoll som presenteras här visar de viktigaste stegen för bibliotek konstruktion, karakterisering och validering.

Metoden med filtrering är schematized i figur 1. Varje typ av intronless DNA kan användas. Den första delen av metoden filtrering representeras i figur 1A : efter lastning på en agarosgel eller en bioanalyzer, en bra fragmentering av DNA av intresse visas som ett utstryk av fragment med en längd fördelning i önskad storlek av 150-750 bp. En representativ virtuella gel bild av fragmenterade DNA erhålls ges. Fragment som la...

Watch this Scientific Journal Video about Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing at JoVE.com

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: Ett protokoll för Domainome bibliotek konstruktion, validering och urval av Phage Display och nästa generations sekvensering

De protokoll som beskrivs kan konstruktion, karakterisering och urval (mot målet för val) av ett ”domainome” bibliotek från någon DNA-källa. Detta uppnås genom en forskning pipeline som kombinerar olika tekniker: phage display, fällbara reporter och nästa generations sekvensering med en webb-verktyg för dataanalys.

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor i den proteinbaserade forskningen såsom annotering av nya proteiner eller proteindomäner, karakterisering av strukturella och funktionella egenskaper hos kända proteiner, definition av nätverk för proteininteraktion eller antigenantikroppssignaturer i olika förhållanden. Den största fördelen med denna teknik är att den är helt opartisk, hög genomströmning och modulär för någon form av studie som sträcker sig från en enda gen upp till en hel genom. Byggandet av ett domainone bibliotek är mycket användbart för funktionella studier.Det kan överföras till en display sammanhang och används för urvalet mot olika mål såsom bindande proteiner eller renat antikroppar. Kopplingen med NGS möjliggör en extremt känslig och kraftfull analys. Samtidigt ger de webbverktyg som utvecklats specifikt en exakt karakterisering av hela domänomet och interactomet.För att konstruera ORF biblioteket först, sonicate DNA med 30 sekunders pulser på 100%-utdata. Efter ultraljudsbehandling, ladda stegen och sonicated DNA på en 1,5%agarosgel. Starta sedan elektroforesenheten vid fem volt per centimeter i 15 minuter.Agaros gelen elektrofores visar förekomsten av DNA-utstryket bekräftar ultraljudsbehandling. Detta är i jämförelse med den fasta band som erhållits från ett DNA som inte utsätts för ultraljudsbehandling. Skär sedan geldelen med det fragmenterade DNA-utstryket och rena med hjälp av kolonnbaserad gelextraktionssats.Mät koncentrationen av det renade DNA i UV-spektrofotometern. Följ sedan tillverkarens instruktioner och behandla fem mikrogram av insatsen med en mikroliter av snabb avtrubbning enzym mix. Inaktivera sedan enzymblandningen vid 70 grader Celsius i 10 minuter.För att förbereda filtreringsvektorn, först smälta fem mikrogram av den renade kloning vektorn med EcoRV begränsningsenzym. Ladda sedan de smälta och osmälta vektorerna och den molekylära markören på en 1%agarose gel. Värm sedan inaktivera restriktionsenzymet vid 80 grader Celsius i 20 minuter.Därefter fosforylera den rötade vektorn med fem enheter fosfatasenzym och 1/10 volym av 10X fosfatasbufferten. Sedan inkubera blandningen vid 37 grader Celsius i 15 minuter. Inaktivera sedan fosfatasenzymet vid 65 grader Celsius i fem minuter.Därefter extraherar plasmiden från gelen och rena DNA: t. Mät sedan DNA:ns koncentration i UV-spektrofotometern. För att utföra ligeringsreaktionen, tillsätt 400 nanogram av fosforylerade skär till ett mikrogram smält vektor, 10X T4 DNA ligase buffert och T4 DNA ligase till en slutlig volym på 100 mikroliter.Sedan inkubera ligering reaktion vid 16 grader Celsius för natten. Nästa dag, värme inaktivera ligase vid 65 grader Celsius i 10 minuter. Därefter tillsätt 1/10 volym av tre molar natriumacetat vid pH 5.2 och 2.5 volymer av 100%etanol för att fälla ut ligering produkten.För att fälla ut DNA, blanda reagenserna och frys vid minus 80 grader Celsius i 20 minuter. Efter 20 minuter, centrifug vid högsta hastighet i 20 minuter vid fyra grader Celsius. Efter centrifugeringen, utvisa supernatanten.Till pelleten, tillsätt 500 mikroliter av kall 70%etanol och återigen centrifug. Kassera supernatanten i slutet av centrifugeringen. När pelleten är lufttorkad, lös upp det utfällda DNA i 10 mikroliter vatten.Innan du utför elektroporation, ordna för lämpligt antal mikrocentrifugrör och 0,1 centimeter elektroporation cuvettes på is. Tillsätt sedan en mikroliter av den renade ligeringsprodukten till 25 mikroliter av cellerna. Sedan pipettera DNA, cellblandning till den kalla elektroporationen cuvette och snärta röret.Torka sedan vattnet från utsidan av cuvette och placera i elektroporationsenheten och slå puls. Efter att elektroporationen är över, tillsätt snabbt en milliliter vätska 2X YT medium utan antibiotikum till cellerna i cuvette. Överför sedan cellulära blandningen till ett 10 milliliter rör.Lämna röret på en shaker på 220 varv per minut vid 37 grader Celsius i en timme. Plate utspädningarna av biblioteket på 10 centimeter 2X YT agar plattor kompletterat med kloramfenikol, ampicillin och endast kloramfenikol. Detta för att erhålla enstaka kolonier som ska testas av PCR och för att utföra titrering.Därefter platta de omvandlade kompetenta cellerna på 15 centimeter 2X YT agar plattor kompletterade med kloramfenikol och ampicillin. Sedan inkubera plattorna vid 30 grader Celsius för övernattning. Nästa dag, räkna kolonierna väljer utspädning där de är uppr ännbara.Beräkna sedan biblioteksstorleken. Biblioteksstorlek beräknas enligt följande, medelkoloni antal gånger utspädningsfaktor gånger totala biblioteksvolymen. Biblioteksstorleken bör vara i storleksordningen 10 till kraften av sex kloner.Om ampicillinkoncentrationen är optimal för att utföra mer filtrering, klontalet minskar till en till 20 av det som erhålls i avsaknad av detta antibiotikum. För att testa för de positiva kolonierna, använd ett tips för att plocka upp runt 15 till 20 enstaka kolonier. Späd sedan kolonierna med 100 mikroliter av 2X YT-medium utan antibiotika.Därefter förstärker PCR 0,5 mikroliter av kulturen som DNA-mall med Taq DNA-polymeras. Under PCR, kör 25 cykler av förstärkningar med glödgning temperatur på 55 grader Celsius och en förlängningstid på 40 sekunder vid 72 grader Celsius. Kontrollera att insatsens längd ligger i det förväntade intervallet 150 till 750 baspar.Och att olika kolonier presenterar olika skär med olika storlek. Detta indikerar en bra biblioteksförberedelse vad gäller variabilitet. Därefter lägger du till tre milliliter färskt 2X YT-medium till 150 millimetersplattorna för att samla bakterierna.Sedan skörda bakterierna med hjälp av en steril skrapa. Efter blandning noggrant, tillsätt 20%glycerol och lämna i minus 80 grader Celsius i alikvoter för framtida bruk. För omedelbar användning, utför kolumn baserad plasmid extraktion kit för att rena plasmid DNA från en av alikvoterna i biblioteket innan du lägger glycerol.Mät DNA-nas koncentration i UV-spektrofotometern och förvara sedan proverna i minus 20 grader Celsius tills användning. Använd 2,5 mikroliter av biblioteket som DNA-mall för PCR-förstärkning. Ställ in termocykleringsförhållandena och starta körningen.Därefter använder ett index PCR-kit för att utföra index PCR. Detta kommer att sekvens de dubbla indexerade biblioteken inom multiplexed Illumina körs. Ställ sedan in termocykleringsförhållandena och starta körningen.Efter rening med AMPure XP pärlor, för att verifiera storleken, kör en mikroliter av en till 10 utspädning av det slutliga biblioteket på bioanalyzer. Kvantifiera sedan genom att välja region för den slutliga biblioteksspårningen. Dessa schematiska representationer demonstate att efter kloning i P filter vektor, endast kolonier som motsvarar ORFs producera funktionella betalaktamas i närvaro av antibiotika.Efter filtrering en minskning av klonen antalet 20-faldig förväntas. Med bra-mapp ORFs växer vid högre antibiotika koncentrationer. Dessutom kan ORF-fragmenten enkelt återställas från det filtrerade biblioteket.Ett fagmid ORF-bibliotek är konstruerat för att utföra val av fagvisning mot målproteiner eller antikroppar. Alla bibliotek och de utgångar som erhålls analyseras sedan djupt av NGS. NGS ger en fullständig information om bibliotekets mångfald, överflöd och exakt kartläggning av vart och ett av de utvalda fragmenten.Slutligen interactome söka webtool utvecklas genererar rå sekvensering läser sträcker sig till listan över förmodade domäner med genomiska anteckningar. Efter att ha sett den här videon bör du ha en god förståelse för hur man konstruerar och validerar ett domainome-bibliotek från en önskad DNA-källa. Och att utföra en hög genomströmning screening av biblioteket genom nästa generations sekvensering.Vi har optimerat sekvensering av ORF filtrering bibliotek med Illumina plattformar och utvecklat en webtool som gör möjligt analys av denna typ av data utan något behov av programmeringskunskaper.

Research

JoVE Journal

Biology

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Primer-Free aptamer Val användning av ett slumpmässigt DNA-bibliotek

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Peptider från Phage Display Library modulera genuttryck i mesenkymala celler och potentiera Osteogenesis i Unicortical bendefekter

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Fluorescens-mikroskopi Screening och nästa generations sekvensering: Användbara verktyg för identifiering av gener involverade i Organell Integrity

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Ett protokoll för Fag Display och Affinity val med rekombinanta protein Beten

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

Nästa generations sekvensering av 16S ribosom RNA Gene amplicons

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Riktade DNA-metylering analys av Nästa generations sekvense

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Förstärkning, Nästa generations sekvensering, och Genomic DNA Kartläggning av retroviral integration webbplatser

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

3' slutet sekvensering bibliotek förberedelser med A-seq2

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Tickande mikrobiomet karakterisering av nästa generations 16S rRNA amplikon sekvensering

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Microbiota analys med två steg PCR och nästa generations 16S rRNA Gene sekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...