Name: interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing
Uploaded: 2018-10-03T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing at JoVE.com

Bu eser İtalyan Milli Eğitim Bakanlığı ve üniversite bir hibe tarafından desteklenmiştir (CP için 2010P3S8BR_002).

1. İnşaat ORF Kütüphanesi (Şekil 1)
<ol><li>INSERT DNA hazırlanması
	<ol>
<li>
Sentetik veya genomik DNA parçaları hazırlık
		<ol>
<li>Özü/standart yöntemleri26kullanarak DNA arındırmak.</li>
			<li>DNA tarafından sonication parçası. Genel öneri başlangıç ile 30 s bakliyat % 100 olarak standart bir sonicator kullanarak güç çıkış. Not: Farklı güç ve sonication kez DNA hazırlık için en uygun koşu...

<ol>
	<li>Loman, N. J., Pallen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty+years+of+bacterial+genome+sequencing.">Twenty years of bacterial genome sequencing.</a> Nat Rev Microbiol. 13 (12), 787-794 (2015).</li><li>Jones, C. E., Brown, A. L., Baumann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+annotation+error+rate+of+curated+GO+database+sequence+annotations.">Estimating the annotation error rate of curated GO database sequence annotations.</a> BMC Bioinformatics. 8 (1), 170 (2007).</li><li>Andorf, C., Dobbs, D., Honavar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+inconsistencies+in+genome-wide+protein+function+annotations:+a+machine+learning+approach.">Exploring inconsistencies in genome-wide protein function annotations: a machine learning approach.</a> BMC Bioinformatics. 8 (1), 284 (2007).</li><li>Wong, W. -. C., Maurer-Stroh, S., Eisenhaber, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+Than+1,001+Problems+with+Protein+Domain+Databases:+Transmembrane+Regions,+Signal+Peptides+and+the+Issue+of+Sequence+Homology.">More Than 1,001 Problems with Protein Domain Databases: Transmembrane Regions, Signal Peptides and the Issue of Sequence Homology.</a> PLoS Comput Biol. 6 (7), e1000867 (2010).</li><li>Bioinformatics, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+correction+of+abnormal,+incomplete+and+mispredicted+proteins+in+public+databases.">Identification and correction of abnormal, incomplete and mispredicted proteins in public databases.</a> BMC Bioinformatics. 9 (9), (2008).</li><li>Phizicky, E., Bastiaens, P. I. H., Zhu, H., Snyder, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+analysis+on+a+proteomic+scale.">Protein analysis on a proteomic scale.</a> Nature. 422 (6928), 208-215 (2003).</li><li>DiDonato, M., Deacon, A. M., Klock, H. E., McMullan, D., Lesley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scaleable+and+integrated+crystallization+pipeline+applied+to+mining+the+Thermotoga+maritima+proteome.">A scaleable and integrated crystallization pipeline applied to mining the Thermotoga maritima proteome.</a> J Struct Funct Genomics. 5 (1-2), 133-146 (2004).</li><li>Nordlund, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+production+and+purification.">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li><li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+open+reading+frames+from+DNA.">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li><li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+interactome+profiling+by+massive+sequencing.">Rapid interactome profiling by massive sequencing.</a> Nucleic Acids Res. 38 (9), e110 (2010).</li><li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71 (Pt 11), 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+A+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: A Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2009).</li><li>Heger, A., Holm, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaustive+enumeration+of+protein+domain+families.">Exhaustive enumeration of protein domain families.</a> J Mol Biol. 328 (3), 749-767 (2003).</li><li>Zacchi, P., Sblattero, D., Florian, F., Marzari, R., Bradbury, A. R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+open+reading+frames+from+DNA.">Selecting open reading frames from DNA.</a> Genome Res. 13 (5), 980-990 (2003).</li><li>Faix, P. H., Burg, M. A., Gonzales, M., Ravey, E. P., Baird, A., Larocca, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phage+display+of+cDNA+libraries:+Enrichment+of+cDNA+expression+using+open+reading+frame+selection.">Phage display of cDNA libraries: Enrichment of cDNA expression using open reading frame selection.</a> Biotechniques. 36 (6), 1018-1029 (2004).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+&#945;-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+(RIDome).">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of &#945;-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li><li>Collins, M. O., Choudhary, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+multiprotein+complexes+by+affinity+purification+and+mass+spectrometry.">Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 324-330 (2008).</li><li>Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-hybrid+technologies+in+proteomics+research.">Two-hybrid technologies in proteomics research.</a> Curr Opin Biotechnol. 19 (4), 316-323 (2008).</li><li>Nakai, Y., Nomura, Y., Sato, T., Shiratsuchi, A., Nakanishi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+Drosophila+gene+coding+for+a+protein+containing+a+novel+phosphatidylserine-binding+motif.">Isolation of a Drosophila gene coding for a protein containing a novel phosphatidylserine-binding motif.</a> J Biochem. 137 (5), 593-599 (2005).</li><li>Deng, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+antibody+single-chain+variable+fragments+with+improved+carbohydrate+binding+by+phage+display.">Selection of antibody single-chain variable fragments with improved carbohydrate binding by phage display.</a> J Biol Chem. 269 (13), 9533-9538 (1994).</li><li>Danner, S., Belasco, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T7+phage+display:+A+novel+genetic+selection+system+for+cloning+RNA-binding+proteins+from+cDNA+libraries.">T7 phage display: A novel genetic selection system for cloning RNA-binding proteins from cDNA libraries.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (23), 12954-12959 (2001).</li><li>Gargir, A., Ofek, I., Meron-Sudai, S., Tanamy, M. G., Kabouridis, P. S., Nissim, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+chain+antibodies+specific+for+fatty+acids+derived+from+a+semi-synthetic+phage+display+library.">Single chain antibodies specific for fatty acids derived from a semi-synthetic phage display library.</a> Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1569 (1-3), 167-173 (2002).</li><li>Patrucco, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+novel+proteins+binding+the+AU-rich+element+of+&#945;-prothymosin+mRNA+through+the+selection+of+open+reading+frames+(RIDome).">Identification of novel proteins binding the AU-rich element of &#945;-prothymosin mRNA through the selection of open reading frames (RIDome).</a> RNA Biol. 12 (12), 1289-1300 (2015).</li><li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Protocols+in+Molecular+Biology.">Current Protocols in Molecular Biology.</a> Mol Biol. 1 (2), 146 (2003).</li><li>Sblattero, D., Bradbury, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+recombination+in+single+bacteria+to+make+large+phage+antibody+libraries.">Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries.</a> Nat Biotechnol. 18, 75-80 (2000).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10 (2011).</li><li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+:+architecture+and+applications.">BLAST+: architecture and applications.</a> BMC Bioinformatics. 10 (1), 421 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Quinlan, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BEDTools:+The+Swiss-Army+tool+for+genome+feature+analysis.">BEDTools: The Swiss-Army tool for genome feature analysis.</a> Curr Protoc Bioinforma. , (2014).</li><li>Skinner, M. E., Uzilov, A. V., Stein, L. D., Mungall, C. J., Holmes, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JBrowse:+A+next-generation+genome+browser.">JBrowse: A next-generation genome browser.</a> Genome Res. 19 (9), 1630-1638 (2009).</li><li>Gourlay, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selecting+soluble/foldable+protein+domains+through+single-gene+or+genomic+ORF+filtering:+Structure+of+the+head+domain+of+Burkholderia+pseudomallei+antigen+BPSL2063.">Selecting soluble/foldable protein domains through single-gene or genomic ORF filtering: Structure of the head domain of Burkholderia pseudomallei antigen BPSL2063.</a> Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 71, 2227-2235 (2015).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filtering+&amp;#34;genic&amp;#34;+open+reading+frames+from+genomic+DNA+samples+for+advanced+annotation.">Filtering &amp;#34;genic&amp;#34; open reading frames from genomic DNA samples for advanced annotation.</a> BMC Genomics. 12 (Suppl 1), S5 (2011).</li><li>Di Niro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+monoclonal+antibody+epitopes+by+filtered+gene+fragment+phage+display.">Characterizing monoclonal antibody epitopes by filtered gene fragment phage display.</a> Biochem J. 388 (Pt 3), 889-894 (2005).</li><li>D'Angelo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+celiac+disease+antibody+repertoire.">Profiling celiac disease antibody repertoire.</a> Clin Immunol. 148 (1), 99-109 (2013).</li></ol>

Boru hattı tüm sonraki adımları etkileyecek bu yana, bir yüksek kaliteli son derece çeşitli ORFs filtre uygulanmış Kütüphane tüm prosedürü içinde belgili tanımlık ilk kritik adım oluşturulmasıdır.
Bizim Yöntem önemli bir avantajlı özelliği herhangi bir kaynak (intronless) DNA (cDNA, genomik DNA, elde edilen PCR veya sentetik DNA) kütüphane yapımı için uygun olmasıdır. Dikkate alınması gereken ilk pFILTER vektör klonlanmış DNA parçalarının uzunluğu geno...

Burada, inşaat ve kütüphanelerin katlanmış ve çözünür protein etki alanlarından herhangi bir genetik/genomik başlangıç kaynak yelpazesi için yüksek üretilen iş yöntemi açıklanmaktadır. Yaklaşım üç farklı teknolojileri birleştirir: faj ekran, bir katlama muhabir ve sonraki nesil sıralama (NGS) belirli web aracı ile kullanımı veri analizi için. Yöntemleri protein bazlı araştırma, birçok farklı bağlamlarda kullanılan kimlik ve ek açıklama yeni proteinler/protein etki alanlarının, yapısal ve işlevsel özellikleri bilinen proteinlerin yanı sıra tanımını karakterizasyonu için protein-etkileşim ağı.
Birçok açık sorular protein bazlı araştırma hala mevcut ve en iyi protein üretimi için yöntemler geliştirilmesi araştırma çeşitli alanları için önemli bir ihtiyaç. Örneğin, prokaryotik ve ökaryotik genleri1binlerce durumu rağmen göreli proteomes ilgili bir harita kodlu proteinleri ve peptidler doğrudan bir ek açıklama ile canlıların büyük çoğunluğu için yok. Tam proteomes kataloğu zaman ve kaynak açısından büyük bir çaba gerektiren zorlu bir hedef olarak ortaya çıkıyor. Deneysel ek açıklama için altın standart tüm açık okuma sözde "ORFeome" Bina çerçeveleri (ORFs) bir genomunun klonlama kalır. Homoloji bilinen faaliyet ilgili genlerle bağlı gen işlevi genellikle atanır ama bu yaklaşım birçok yanlış ek açıklamaları başvuru veritabanları2,3,4varlığı nedeniyle kötü doğru 5. Ayrıca, tespit ve açıklamalı bile için ek çalışmalar karakterizasyonu bolluk, yapısal ve işlevsel özellikleri de dahil olmak üzere farklı bağlamlarda ifade desen açısından elde etmek için gerekli proteinlerdir yanı sıra etkileşim ağları.
Ayrıca, farklı etki, her biri proteinler oluşur bu yana farklı protein işlevleri için katkı ve belirli özellikleri gösteren, çalışma ve bu etki alanlarının tam anlamını daha kapsamlı bir resim, her ikisi de tek izin verebilirsiniz Gen ve tam genom düzeyinde. Bu gerekli tüm bilgileri bir zorlu ve geniş alan protein bazlı araştırma yapar.
Bu açıdan tarafsız ve yüksek işlem hacmi yöntemlerle protein üretimi için önemli bir destek verilebilir. Ancak, bu tür yaklaşımlar, gerekli, önemli yatırım yanında başarısı yeteneği çözünür/stable protein yapıları üretmek için kullanır. Bu büyük bir sınırlayıcı faktör beri bu proteinlerin sadece yaklaşık % 30 başarılı bir şekilde dile getirdi ve deneysel olarak yararlı6,7,8olmak yeterli düzeylerde üretilen olduğunu tahmin ediyor. Bu sınırlamayı aşmak için bir yaklaşım birlikte bireysel genler örtüşen parçası gösterimini sağlar farklı polipeptitler üretmek için rasgele parçalanmış DNA kullanımına dayanır. Rasgele oluşturulmuş DNA parçalarının sadece küçük bir yüzdesi vardır fonksiyonel ORFs ederken bunların büyük çoğunluğu non-görev (stop kodon onların dizileri içinde varlığı) nedeniyle veya orijinal dışında bir çerçeve içinde un doğal (ORF) için kodlar polipeptitler biyolojik anlamı ile.
Bu sorunlara yönelik olarak bizim grup üzerinde genomik ölçek9,10,11,12-ebilmek var olmak kullanılmış bir yüksek-den geçerek protein ifade ve etkileşim analizi platform geliştirmiştir. Aşağıdaki teknikler bu platforma entegre: 1) koleksiyonları doğru katlanmış protein etki alanlarının herhangi bir organizma; kodlama DNA kısmından seçmek için bir yöntem 2) Ortaklar etkileşimlerin seçmek için fajının ekran teknolojisi; 3) NGS tamamen altında eğitim bütün interactome karakterize ve klonlar ilgi tanımlamak için; ve 4) veri analizi için kolay ve Kullanıcı dostu bir şekilde Interactome-Seq analizi yapmak herhangi bir Biyoinformatik veya programlama bilgisi olmayan kullanıcılar için bir web aracıdır.
Bu platform kullanımı araştırma alternatif stratejileri önemli avantaj sunar; Her şeyden önce tamamen tarafsız, yüksek-den geçerek ve sıra--dan tüm genom kadar tek bir gen çalışma için modüler bir yöntemdir. Boru hattı ilk adım altında eğitim, sonra derin NGS tarafından karakterize rastgele parçalanmış DNA kitaplıktan oluşturulmasıdır. Bu Kütüphane nerede genler/parçaları ilgi için protein salgılanması (yani, sn lideri) periplasmic uzaya bir sinyal serisi ve TEM1 β-lactamase gen arasında klonlanır mühendislik bir vektör kullanılarak oluşturulur. Füzyon proteini ampisilin direnç ve klonlanmış parçaları çerçeve varsa ampisilin baskı altında hayatta yeteneği görüşmek bu öğeleri ve elde edilen füzyon protein ile doğru katlanmış10,13 olduğunu ,14. Tüm klonlar klonlar sözde "filtre" antibiyotik seçimden sonra kurtarıldı, ORFs ve onları (% 80'den fazla) büyük bir çoğunluğu, gerçek genler9' dan türetilmiştir. Ayrıca, bu strateji gücünü tüm filtre ORF klonlar için doğru katlanmış/çözünür protein/etki alanları15Kodladığınız bulgular yer almaktadır. Gibi birçok klonlar, mevcut Kütüphane ve eşleme aynı bölge/etki alanında, farklı başlangıç ve bitiş noktaları, bu tarafsız, tek adım kimlik çözünür ürünlerinde sonuçlanması olası en küçük parçalar sağlar.
Teknoloji daha fazla bir düzelme NGS kullanımı ile Kütüphane karakterize etmek için verilir. Kombinasyonu bu platform ve veri analizi için belirli web aracının altında eğitim daha geniş analizleri, gerek kalmadan başvuru DNA üzerinde önemli tarafsız bilgi tam nükleotit dizileri ve seçili ORFs konumunu verir veya Deneysel çaba.
Domainome kütüphaneler bir seçim bağlam içine transfer ve fonksiyonel çalışmalar gerçekleştirmek için evrensel bir araç olarak kullanılan. Biz entegre ve Interactome-Seq aradık fajının ekran teknolojisi süzülmüş ORF phagemid vektör aktarmak ve faj ORF oluşturma yararlanır yüksek üretilen iş protein ifade ve etkileşim analizi platformu Kütüphane. Bir kez bir fajının görüntü içeriği, etki alanları M13 parçacıklar; yüzeyinde görüntülenir protein içine yeniden klonlanmış Bu şekilde domainome kütüphaneler doğrudan etki alanları belirli enzimatik faaliyetleri ile kodlama veya bağlama özellikleri, interactome ağlar profil oluşturma sağlayan gen parçaları için seçilebilir. Bu yaklaşım başlangıçta Zacchi vd tarafından tanımlanmıştır 16 ve daha sonra birkaç diğer içerik13,17,18içinde kullanılır.
Protein-protein etkileşim (Maya iki hibrid sistemi ve kütle spektrometresi19,20dahil) çalışma için kullanılan diğer teknolojileri ile karşılaştırıldığında, bir büyük avantaj sağlıyor fajının sırasında oluşur bağlama ortak amplifikasyon birden fazla mermi seçimi görüntüler. Bu böylece düşük bol bağlayıcı proteinler etki alanları Kitaplığı'nda tanımlaması izin seçim hassasiyeti artar. ORF filtre kitaplığı ile yapılan seleksiyonun verimini daha da işlevsel olmayan klonlar yokluğu nedeniyle artar. Son olarak, teknoloji protein ve protein yemler21,22,23,24,25karşı gerçekleştirilecek seçim sağlar.
Domainome-fajının kütüphaneyi kullanan fajının seçimleri farklı patolojik koşulları olan hastalarda, Örneğin otoimmün hastalıklar13, kanser ya da enfeksiyon hastalıkları sera yem olarak gelen antikorlar kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu yaklaşım altında ağır tanımlamak ve özellikle aynı anda hastaların antikorlar tarafından tanınan antijenleri/epitopları karakterize etmek için izin vererek eğitim hastalığının sözde "antikor imza" elde etmek için kullanılır. Kullanımı diğer yöntemlerine göre faj doğrusal ve konformasyon antijenik epitopları tanımlaması görüntülenmesine izin verir. Belirli bir imza tanımlaması potansiyel olarak anlayış Patogenez, yeni aşı tasarım, yeni tedavi hedefleri tanımlaması ve belirli tanılama ve prognostik araçları gelişimi için önemli bir etkisi olabilir. Ayrıca, çalışma bulaşıcı hastalıklar üzerinde odaklanmış zaman immünojenik proteinler keşfi patojen ekimi bağımsızdır bir büyük avantaj sağlıyor.
Yaklaşımımız katlama gazetecilere genomik bir ölçekte "domainome" seçmek için kullanılabilir onaylar: doğru katlanmış, iyi ifade, çözünür protein etki DNA'ın kodlama bölümünden ve/veya herhangi bir organizmadan cDNA topluluğudur. Bir kez izole protein parçaları gen ek açıklama için de yapısal çalışmalar, antikor epitope eşleme, antijen tanıma, vbgelince gerekli deneysel bilgi veren birçok amaç için yararlıdır. NGS tarafından sağlanan yüksek üretilen iş veri bütünlüğü analiz fajının görüntü kitaplıkları gibi son derece karmaşık örnekleri sağlar ve geleneksel zahmetli malzeme çekme ve bireysel fajının kurtarıldı klonları test kaçınmak için potansiyele sahiptir.
Filtre uygulanmış Kütüphanesi ve aşırı duyarlılık ve güç NGS analiz özellikleri sayesinde aynı anda her etkileşimi doğrudan oluşturmak zorunda kalmadan bir başlangıç ekranı, sorumlu protein etki alanını tanımlamak mümkündür her biri için ek kütüphaneler protein bağlı. NGS sağlar herhangi bir genetik/genomik başlangıç kaynak tüm domainome kapsamlı bir tanımını almak için ve veri çözümleme web aracı çok özel alan nitelik özellikleri her iki açıdan bir nitel ve nicel elde sağlar interactome protein etki alanları.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1817px;" width="1817">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sonopuls&#160; ultrasonic homogenizer</td>
			<td style="width:444px;">Bandelin</td>
			<td style="width:423px;">HD2070</td>
			<td style="width:557px;">or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0321</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">GeneRuler 1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">SM0311</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Molecular Biology Agarose</td>
			<td style="width:444px;">BioRad</td>
			<td style="width:423px;">161-3102</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Green Gel Plus</td>
			<td style="width:444px;">Fisher Molecular Biology</td>
			<td style="width:423px;">FS-GEL01</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">6x DNA Loading Dye</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">R0611</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28704</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Quick Blunting Kit</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">E1201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:393px;">NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">ND-2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;">4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Streptavidin Magnetic Beads</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:423px;">S1420S</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">QIAquick PCR purification Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td style="width:423px;">28104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">EcoRV</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0195L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Antarctic Phosphatase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0289S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>M0202T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Sodium Acetate 3M pH5.2</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ethanol for molecular biology</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:423px;">E7023</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DH5aF&#39; bacteria cells</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,2 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">1,5 ml tubes</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">0,1 cm electroporation cuvettes</td>
			<td style="width:444px;">Biosigma</td>
			<td style="width:423px;">4905020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Electroporator 2510</td>
			<td style="width:444px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:423px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">2x YT medium</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Ampicillin sodium salt</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>C0378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">DreamTaq DNA Polymerase</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>EP0702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>N0447S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">96-well thermal cycler (with heated lid)</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">150 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:393px;">100 mm plates</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BssHII</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0199L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NheI</td>
			<td style="width:444px;">New England Biolabs</td>
			<td>R0131L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:444px;">Qiagen</td>
			<td>27104</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M13KO7 Helper Phage</td>
			<td style="width:444px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>27-1524-01&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyethylene glycol (PEG)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Cloride (NaCl)</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10003D</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MagnaRack Magnetic Separation Rack</td>
			<td style="width:444px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tween 20</td>
			<td style="width:444px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonfat dried milk powder</td>
			<td style="width:444px;">EuroClone</td>
			<td>EMR180500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KAPA HiFi HotStart ReadyMix&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Kapa Biosystems, Fisher Scientific</td>
			<td>7958935001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AMPure XP beads&#160;</td>
			<td>Agencourt, Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nextera XT dual Index&#160; Primers&#160;</td>
			<td style="width:444px;">Illumina</td>
			<td>FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MiSeq or Hiseq2500&#160;</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spectrophotomer</td>
			<td>Nanodrop</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent Bioanalyzer or TapeStation</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse PCR primer</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forward primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>&#160;5&#8217; TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAGCAAGCGGCGCGCATGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Reverse primer for NGS</td>
			<td style="width:444px;">general lab supplier</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217; GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGATTGGTTTGCCGCTAGC 3&#8217;;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

interactome-seq: a protocol for domainome library construction, validation and selection by phage display and next generation sequencing

Katlama gazetecilere olan katlama ve işlev tehlikeye kötü proteinler veya rasgele açık okuma çerçevesi katlama için erimiş zaman antibiyotik direnci gibi kolayca tanımlanabilen fenotipleri ile proteinlerdir. Biz nerede, TEM-1 β-lactamase (ampisilin direnci veriyor enzim) genomik bir ölçekte kullanarak, biz koleksiyonları doğru katlanmış protein etki alanlarının herhangi bir intronless genom DNA kodlama bölümünden seçebilirsiniz bir strateji geliştirdik. "Domainome" olarak adlandırılan, bir yaklaşım elde edilen protein parçaları de ifade ve çözünür, yapısal/fonksiyonel çalışmalar için uygundur.
Klonlama ve "domainome" bir fajının görüntüleme sistemi içinde görüntüleyerek, biz böylece temel sağlamak istediğiniz bağlama özellikleri (Örneğin, diğer proteinler veya antikor), ile belirli protein etki alanlarını seçmek mümkün olduğunu göstermiştir deneysel bilgi için gen ek açıklama ya da antijen tanıma.
Seçili poliklonal popülasyonda en zenginleştirilmiş klonlar kimliği roman yeni nesil sıralama teknolojileri (NGS) kullanarak elde edilebilir. Bu nedenlerden dolayı biz derin sıralama Analizi kitaplığın kendisi ve çeşitlilik, bereket ve kesin haritalama her seçili parçasının üzerinde tam bilgi sağlamak için seçim çıkışlarını tanıtmak. Burada sunulan protokolleri Kütüphane inşaat, karakterizasyonu ve doğrulama için anahtar adımlar gösterir.

Filtreleme yaklaşım Şekil 1' de kapsamlıdır. İntronless DNA her tür-ebilmek var olmak kullanılmış. Şekil 1A ' filtreleme yaklaşım ilk bölümünü temsil edilir: 150-750 BP istenen boyutunda bir uzunluğu dağıtım ile parçalarının bir smear olarak ilgi DNA'ın iyi bir parçalanma bir özel jel veya bir bioanalyzer yükledikten sonra görünür. Elde parçalanmış DNA'ın bir temsilcisi sanal jel görüntüsü v...

Watch this Scientific Journal Video about Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing at JoVE.com

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Interactome-Seq: Domainome kitaplığı inşaat, doğrulama ve seçim fajının görüntü ve sonraki nesil sıralama için bir protokol

Açıklanan protokollere izin ver inşaat, karakterizasyonu ve DNA, herhangi bir kaynaktan yapılan bir "domainome" kitaplığının (karşı seçim hedef) seçimi. Bu farklı teknolojileri bir araya getiren bir araştırma boru hattı tarafından sağlanır: faj ekran, katlama muhabir ve sonraki nesil sıralama veri analizi için bir web aracı ile.

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

Bu yöntem, yeni proteinlerin veya protein alanadlarının ek gösterimi, bilinen proteinlerin yapısal ve fonksiyonel özelliklerinin karakterizasyonu, protein etkileşim ağlarının tanımı veya farklı koşullarda antijen antikor imzaları gibi protein bazlı araştırmalardaki anahtar soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, tek bir genden bütün bir genoma kadar her türlü çalışma için tamamen tarafsız, yüksek iş sahibi ve modüler olmasıdır. Domainone kütüphanesinin inşası fonksiyonel çalışmalar için çok yararlıdır.Bir faj görüntüleme bağlamına aktarılabilir ve bağlayıcı proteinler veya saflaştırılmış antikorlar gibi farklı hedeflere karşı seçim için kullanılabilir. NGS ile bağlantı son derece hassas ve güçlü bir analiz sağlar. Aynı zamanda, özellikle geliştirilen web araçları tüm domainome ve etkileşimom kesin bir karakterizasyonu verir.Önce ORF kütüphanesini inşa etmek için DNA'yı %100 çıkışta 30 saniyelik darbelerle sonicate edin. Sonication sonra, merdiven ve sonicated DNA yük 1.5% agarose jel. Daha sonra elektroforez ünitesini 15 dakika boyunca santimetre başına beş volta başlatın.Agarose jel elektroforezi sonication doğrulayan DNA yayma varlığını gösterir. Bu, sonication tabi olmayan bir DNA elde edilen katı bant ile karşılaştırıldığında. Sonra parçalanmış DNA yayma ile jel kısmını kesin ve kolon bazlı jel çıkarma kiti kullanarak arındırın.UV spektrofotometredeki saflaştırılmış DNA konsantrasyonuna dikkat edin. Daha sonra üreticinin talimatlarına uyun ve bir mikrolitre hızlı körelme enzim karışımı ile kesici uçbeş mikrogramı tedavi edin. Sonra enzim karışımını 70 derecede 10 dakika süreyle inaktive edin.Filtreleme vektörü hazırlamak için, ilk ecorv restriksiyon enzimi ile saflaştırılmış klonlama vektörünün beş mikrogramını sindirin. Daha sonra sindirilmiş ve sindirilmemiş vektörleri ve moleküler belirteci %1'lik agarose jelüzerine yükleyin. Sonra ısı 80 santigrat derecede 20 dakika boyunca restriksiyon enzimini inaktive eder.Daha sonra, sindirilmiş vektörü beş birim fosfataz enzimi ve 10X fosfataz tamponunun 1/10 hacmi ile fosforilasyon. Sonra karışımı 37 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra fosfataz enzimini 65 derecede 5 dakika süreyle inaktive edin.Sonra, jel den plazmid ayıklayın ve DNA arındırın. Sonra UV spektrofotometre DNA konsantrasyonu ölçmek. Ligasyon reaksiyonunu gerçekleştirmek için, sindirilmiş vektörün bir mikrogramına fosforilize kesici uçlardan 400 nanogram, 10X T4 DNA ligaz tamponu ve T4 DNA ligazını 100 mikrolitrelik son hacmine ekleyin.Sonra bir gecede ligasyon reaksiyonunu 16 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, ısı 10 dakika boyunca 65 santigrat derecede ligaz inaktive. Daha sonra, ligasyon ürünçöktürmek için pH 5.2 ve% 100 etanol 2.5 hacimli üç molar sodyum asetat 1/10 hacmi ekleyin.DNA'yı çökeltmek için reaktifleri karıştırın ve eksi 80 derecede 20 dakika dondurun. 20 dakika sonra, dört santigrat derecede 20 dakika boyunca en yüksek hızda santrifüj. Santrifüjden sonra, süpernatant'ı kovun.Pelet için, soğuk 500 mikrolitre ekleyin 70%etanol ve tekrar santrifüj. Santrifüjün sonundaki süpernatant'ı atın. Pelet hava kurutulduktan sonra çökelmiş DNA'yı 10 mikrolitre suda çözün.Elektroporasyon yapmadan önce, uygun sayıda mikrosantrifüj tüpü ve buz üzerinde 0,1 santimetre elektroporasyon küratörleri ayarlayın. Daha sonra hücrelerin 25 mikrolitre saflaştırılmış ligasyon ürünü bir mikrolitre ekleyin. Sonra pipet DNA, hücre karışımı soğuk elektroporasyon cuvette ve tüp flick.Sonra cuvette dış su silin ve elektroporasyon ünitesinde yer ve darbe vurdu. Elektroporasyon bittikten sonra, hızlı bir şekilde cuvette hücrelere herhangi bir antibiyotik olmadan sıvı 2X YT orta bir mililitre ekleyin. Sonra hücresel karışımı 10 mililitrelik bir tüpe aktarın.Bir saat boyunca 37 santigrat derece dakikada 220 devrimleri bir shaker üzerinde tüp bırakın. Plaka 10 santimetre 2X YT agar plakaları kloramfenikol, ampisilin ve sadece kloramfenikol ile desteklenen kütüphanenin seyreltme. Bu PCR tarafından test edilecek tek koloniler elde etmek ve titrasyon gerçekleştirmektir.Sonra, plaka 15 santimetre 2X YT agar plakaları kloramfenikol ve ampisilin ile takviye dönüştürülmüş yetkili hücreleri. Sonra tabakları bir gecede 30 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, kolonileri sayar.Ardından kitaplık boyutunu hesaplayın. Kitaplık boyutu aşağıdaki gibi hesaplanır, ortalama koloni sayısı sayısı seyreltme faktörü kat ları toplam kitaplık hacmi. Kütüphane boyutu altı klonların gücü 10 sırada olmalıdır.Ampisilin konsantrasyonu daha fazla filtreleme gerçekleştirmek için en uygun ise, klon sayısı bu antibiyotik yokluğunda elde edilen bir ila 20 azaltır. Pozitif koloniler için test etmek için, yaklaşık 15-20 tek koloniler almak için bir ipucu kullanın. Sonra antibiyotik olmadan 2X YT orta 100 mikrolitre ile koloniler seyreltin.Daha sonra, PCR Taq DNA polimeraz ile DNA şablonu olarak kültürün 0,5 mikrolitre yükseltmek. PCR sırasında, 55 santigrat derece tavlama sıcaklığı ve 72 santigrat derece 40 saniye uzatma süresi kullanarak amplifikasyon25 döngüleri çalıştırın. Kesici uç uzunluğunun beklenen 150 ile 750 baz çifti aralığında olup olmadığını kontrol edin.Ve farklı koloniler farklı boyutlarda farklı ekler mevcut. Bu değişkenlik açısından iyi bir kütüphane hazırlık gösterir. Daha sonra, bakterileri toplamak için 150 milimetrelik plakalara üç mililitre taze 2X YT orta ekleyin.Sonra steril bir kazıyıcı kullanarak bakteri hasat. Iyice karıştırdıktan sonra, 20% gliserol ekleyin ve eksi 80 derece santigrat gelecek kullanım için aliquots bırakın. Hemen kullanım için, gliserol eklemeden önce kütüphanenin aliquots birinden plazmid DNA arındırmak için sütun tabanlı plazmid çıkarma kiti gerçekleştirin.UV spektrofotometredeki DNA konsantrasyonu ölçün ve numuneleri kullanıma kadar eksi 20 derecede saklayın. PCR amplifikasyon için DNA şablonu olarak kitaplığın 2,5 mikrolitresini kullanın. Termocycler koşullarını ayarlayın ve koşmaya başlayın.Ardından, dizin PCR gerçekleştirmek için bir dizin PCR kiti kullanın. Bu, çok katlı Illumina çalıştırmaları içinde çift dizilimli kitaplıkları sıralar. Sonra termocycler koşullarını ayarlayın ve koşmaya başlayın.AMPure XP boncukları ile saflaştırma sonra, boyutunu doğrulamak için, bioanalyzer son kütüphanenin bir ila 10 seyreltme bir mikrolitre çalıştırın. Ardından, son kitaplık izleme sinin bölgesini seçerek ölçün. Bu şematik temsiller, P filtre vektörü içine klonlama sonra, sadece ORFs karşılık koloniler antibiyotik varlığında fonksiyonel beta-laktamaz üretmek demonstate.Filtreden sonra klon sayısında 20 kat azalma beklenmektedir. Yüksek antibiyotik konsantrasyonlarında büyüyen iyi klasör ORFs ile. Ayrıca, ORF parçaları filtrelenmiş kitaplıktan kolayca kurtarılabilir.Hedef proteinlere veya antikorlara karşı faj görüntüleme seçimi yapmak için fajmid ORF kütüphanesi oluşturulur. Elde edilen tüm kütüphaneler ve çıktılar NGS tarafından derinlemesine analiz edilmektedir. NGS, seçilen parçaların her birinin kütüphane çeşitliliği, bolluğu ve kesin haritalaması hakkında tam bir bilgi sağlar.Son olarak etkileşimom webtool geliştirmek ham sıralama genomik ek açıklamalar ile putatif etki alanları listesine değişen okur üretir. Bu videoyu izledikten sonra, nasıl oluşturmak ve istenilen BIR DNA kaynağından bir domainome kütüphane doğrulamak için iyi bir anlayışa sahip olmalıdır. Ve yeni nesil sıralama ile kütüphanenin yüksek bir iş bölümü tarama gerçekleştirmek için.ORF filtreleme kütüphanelerinin Illumina platformları ile dizilişi optimize ettik ve programlama becerilerine ihtiyaç duymadan bu tür verilerin analizini mümkün kılmış bir web aracı geliştirdik.

Research

JoVE Journal

Biology

Primer-Free Aptamer Selection Using A Random DNA Library

Rastgele bir DNA Kütüphane Kullanımı Primer-Aptamer Seçimi

Aptamers are highly structured oligonucleotides (DNA or RNA) that can bind to targets with affinities comparable to antibodies 1. They are identified ...

Peptides from Phage Display Library Modulate Gene Expression in Mesenchymal Cells and Potentiate Osteogenesis in Unicortical Bone Defects

Bakteriyofaj Görüntüleme Kütüphane Peptitler Mezenkimal Hücreler Gen ekspresyonunu modüle ve Unicortical Kemik Hastalıkları Osteogenezi potansiyalize

Two novel synthetic peptides accelerate bone formation and can be delivered using a collagen matrix. The aim of this study was to investigate the effects ...

Fluorescence-microscopy Screening and Next-generation Sequencing: Useful Tools for the Identification of Genes Involved in Organelle Integrity

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

This protocol describes a fluorescence microscope-based screening of Arabidopsis seedlings and describes how to map recessive mutations that alter the ...

A Protocol for Phage Display and Affinity Selection Using Recombinant Protein Baits

Rekombinant Protein Yemler Kullanarak Phage Ekran ve Affinity seçimi için Protokol

Using  recombinant phage as a scaffold to present various protein portions encoded by  a directionally cloned cDNA library to immobilized bait molecules ...

Next-generation Sequencing of 16S Ribosomal RNA Gene Amplicons

16S Ribozomal RNA Gen amplikonlarının nesil Sıralama

One of the major questions in microbial ecology is &#8220;who is there?&#8221; This question can be answered using various tools, but one of the ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

DNA Metilasyon Analizi nesil Dizilimine tarafından hedef

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

A-seq2 ile kütüphane hazırlık sıralama 3' ucu

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

Tick Microbiome Characterization by Next-Generation 16S rRNA Amplicon Sequencing

Kene Microbiome karakterizasyonu tarafından yeni nesil 16S rRNA Amplicon sıralama

In recent decades, vector-borne diseases have re-emerged and expanded at alarming rates, causing considerable morbidity and mortality worldwide. Effective ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...