Name: mouse models of helicobacter infection and gastric pathologies
Uploaded: 2018-10-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Ms. A. De Paoli og Ms. Georgie Wray-McCann for teknisk bistand. Forfatterne anerkender brugen af faciliteter og tekniske bistand Monash histologi Platform, Institut for anatomi og udviklingsmæssige biologi, Monash University. Laboratoriet er støttet af midler fra National sundhed og Medical Research Rådet (NHMRC) til RLF (APP1079930, APP1107930). RLF understøttes af en Senior Research Fellowship fra NHMRC (APP1079904). KD og MC understøttes både af Monash ph.d. stipendier. KD er også støttet af centret for medfødt immunitet og smitsom sygdomme, Hudson Institute of Medical Research, mens MC har en International Postgraduate Scholarship fra Faculty of Medicine, sygepleje og sundhedsvidenskab, Monash University. Forskning ved Hudson Institute for Medical Research er støttet af den victorianske regering operationelle infrastruktur Support Program.

1. vækst og forberedelse af bakteriel Inocula
<ol><li>Tø glycerol bestandene af H. pylori eller H. felis15 fra-80 ° C og subkultur på hest blod agar (HBA) plader bestående af: blod Agar Base No.2 (Se Tabel af materialer); en modificeret "Skirrows antibiotika selektiv supplement" (bestående af vancomycin, 10 μg/mL, polymyxin B, 25 ng/mL, trimethoprim, 5 µg/mL, amphotericin B, 2,5 μg/mL); og 5-10% (v/v) hest blod15,<sup...

<ol>
	<li>Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Helicobacter+pylori+infection+and+public+health+implications.">Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications.</a> Helicobacter. 16, 1-9 (2011).</li><li>Montecucco, C., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+dangerously:+how+Helicobacter+pylori+survives+in+the+human+stomach.">Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).</li><li>Akopyants, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+the+cag+pathogenicity+island+of+Helicobacter+pylori.">Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori.</a> Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).</li><li>Censini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cag,+a+pathogenicity+island+of+Helicobacter+pylori,+encodes+type+I-specific+and+disease-associated+virulence+factors.">cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).</li><li>Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+innate+immunity+in+Helicobacter+pylori-induced+gastric+malignancy.">Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).</li><li>O'Rourke, J. L., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Helicobacter+pylori+infection+and+disease.">Animal models of Helicobacter pylori infection and disease.</a> Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).</li><li>Sakagami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrophic+gastric+changes+in+both+Helicobacter+felis+and+Helicobacter+pylori+infected+mice+are+host+dependent+and+separate+from+antral+gastritis.">Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis.</a> Gut. 39 (5), 639-648 (1996).</li><li>Correa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+and+gastric+carcinogenesis.">Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).</li><li>Enno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALToma-like+lesions+in+the+murine+gastric+mucosa+after+long-term+infection+with+Helicobacter+felis.+A+mouse+model+of+Helicobacter+pylori-induced+gastric+lymphoma.">MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma.</a> The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+mouse+model+of+Helicobacter+pylori+infection:+introducing+the+Sydney+strain.">A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain.</a> Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).</li><li>Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+colonizing+Helicobacter+pylori+strain+SS1+may+lack+a+functional+cag+pathogenicity+island.">The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island.</a> Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).</li><li>Israel, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+strain-specific+differences+in+genetic+content,+identified+by+microarray,+influence+host+inflammatory+responses.">Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).</li><li>Fox, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori-induced+gastritis+in+the+domestic+cat.">Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat.</a> Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).</li><li>Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+spiral-shaped+bacterium+from+the+cat+stomach.">Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach.</a> Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).</li><li>Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+Helicobacter-induced+gastric+cancer:+use+of+cocarcinogens.">Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens.</a> Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).</li><li>Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+of+specific-pathogen-free+mice+to+chronic+Helicobacter+pylori+(strain+SS1)+infection.">Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection.</a> Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).</li><li>Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+maintenance+of+Helicobacter+species.">Laboratory maintenance of Helicobacter species.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+host+genetic+background+on+immune+responses+to+Helicobacter+pylori+infection+and+therapeutic+vaccine+efficacy.">Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).</li><li>Nedrud, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+genetic+influence+on+the+innate+inflammatory+response+to+helicobacter+infection+of+the+gastric+mucosa.">Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+felis+eradication+restores+normal+architecture+and+inhibits+gastric+cancer+progression+in+C57BL/6+mice.">Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice.</a> Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).</li><li>Ferrero, R. L., Labigne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+expression+and+sequencing+of+Helicobacter+felis+urease+genes.">Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes.</a> Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).</li><li>Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Helicobacter+pylori+in+various+liquid+and+plating+media.">Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media.</a> Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).</li><li>Uotani, T., Graham, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+Helicobacter+pylori+using+the+rapid+urease+test.">Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test.</a> Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).</li><li>Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+murine+helicobacters+by+PCR+and+restriction+enzyme+analyses.">Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses.</a> Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).</li><li>Chaouche-Drider, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+commensal+Helicobacter+sp.+of+the+rodent+intestinal+flora+activates+TLR2+and+NOD1+responses+in+epithelial+cells.">A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells.</a> PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).</li><li>Fox, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+bilis:+bacterial+provocateur+orchestrates+host+immune+responses+to+commensal+flora+in+a+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease.</a> Gut. 56 (7), 898-900 (2007).</li><li>McGee, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+enhances+Helicobacter+pylori+resistance+to+antibiotics+and+LL-37.">Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).</li><li>Viala, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nod1+responds+to+peptidoglycan+delivered+by+the+Helicobacter+pylori+cag+pathogenicity+island.">Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island.</a> Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+PCR+method+to+detect+Helicobacter+felis+in+a+conventional+mouse+model.">A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).</li><li>Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Helicobacter+felis+colonization+in+male+129/Sv+mice+fails+to+suppress+gastritis.">Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis.</a> Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).</li><li>Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbred+mice+with+long-term+Helicobacter+felis+infection+develop+both+gastric+lymphoid+tissue+and+glandular+hyperplastic+lesions.">Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions.</a> The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).</li></ol>

Denne protokol beskriver brugen af en i vivo musen model for Helicobacter infektion. De kritiske trin af proceduren er det: 1) forberedelse af Helicobacter inocula som indeholder levedygtige og motile bakterier; 2) levering af den passende antal bakterier til musen via gastrisk sonde; 3) påvisning af bakteriel infektion af kolonien optælling og/eller PCR; og 4) behandling af gastrisk væv til at muliggøre vurdering af histopatologisk i inficeret maver. Yderligere forslag til ændringer, fejl...

Helicobacter pylori er en spiralformet, gramnegative, menneskelige gastrisk patogen til stede i alle befolkninger i hele verden med smittede i udviklingslandene skønnes for at være i størrelsesordenen 80%1. Selv om de fleste H. pylori-smittede personer er asymptomatiske, nogle udvikle mere alvorlige sygdomme, lige fra peptisk ulceration til gastrisk kræft2. H. pylori-associeret kræftformer er bredt karakteriseret ved maligne forandringer i epitelceller (GECs) eller ved dannelse af ekstra nodal lymfoide væv i maven, resulterende i gastrisk adenokarcinom eller slimhinde-associerede lymfoide væv (MALT) lymfom, henholdsvis. H. pylori er stærkt tilpasset til at overleve i den barske økologiske niche af maven på grund af tilstedeværelsen af forskellige virulens faktorer og mekanismer lette dens overholdelse, vækst og stofskifte i denne niche. Især besidder virulente stammer af H. pylori 40 kb cag patogenicitet ø (cagPAI) der koder ca 30 gener kræves til produktionen af en Type 4 sekretion system (T4SS)3,4 . CAG PAI-positive H. pylori stammer er forbundet med induktion af højere niveauer af kronisk betændelse i den vært, som har været impliceret som en vigtig forløber for gastrisk adenokarcinom5.
In vivo dyremodeller, især mus, har været yderst informativ ved at lade forskere at undersøge de relative bidrag af værten, bakteriel og miljømæssige faktorer på H. pylori -infektion og sygdom resultat6. Undersøgelser har tidligere vist, at langvarig H. pylori infektion af mus på C57BL/6 genetiske baggrund resulterer i udvikling af kronisk gastritis og kirtel atrofi, begge kendetegnende for H. pylori infektion7. Derudover har infektion med den relaterede katte/hunde bakteriearter, H. felis, vist sig at fremkalde MALT dannelse i mus med lignende patologi og sygdomsprogression, som set i menneskelige MALT lymfom8,9. De mest almindeligt anvendte H. pylori isolat i mus kolonisering undersøgelser er "Sydney stamme 1" (SS1) stamme10, som er cagPAI+ , men har en ikke-funktionel T4SS (T4SS−)11. Andre udbredte stammer omfatter H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 og X47-2AL (cagPAI-/T4SS−)13. For H. felis infektioner, stamme CS1 ("kat Spiral 1" cagPAI-/T4SS−) er generelt brugt14.
Heri, giver vi en protokol, der beskriver forberedelse af Helicobacter inocula for i vivo infektion, proceduren for gastrisk sonde af mus, samt metoder til behandling af væv til undersøgelse af histopatologiske forandringer i maven. Især vil denne artikel fokusere på de histologiske metoder bruges til at visualisere bakteriel kolonisering og vurdere histopatologiske forandringer, herunder MALT dannelse, i maveslimhinden af inficerede mus. Nogle af de metoder, der beskrives her kan tilpasses til studiet af andre gut patogener som S. Typhimurium eller C. rodentium.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacteriological reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxoid Blood Agar Base No.2</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>CM0271B</td>
			<td>Dissolve in deinonized water prior to sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Defibrinated Horse blood</td>
			<td>Australian Ethical Biologicals</td>
			<td>PDHB100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Brain Heart Infusion Broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>237500</td>
			<td>Dissolve in deinonized water prior to sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CampyGen gas packs</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>CN0035A/CN0025A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute alcohol, 100% Denatured</td>
			<td>ChemSupply</td>
			<td>AL048-20L-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-propanol)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene (sulphur free)</td>
			<td>ChemSupply</td>
			<td>XT003-20L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s Haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>&#160;MH-1L</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin, Aqueous Stain</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>EOCA-1L</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright-Giemsa Stain, modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WG80-2.5L</td>
			<td>Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>11031/5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.00579.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;M8291</td>
			<td>Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39028</td>
			<td>Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Univar (Ajax Fine Chemicals)</td>
			<td>A475-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulphate Heptahydrate</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>MA048-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V2002-1G</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4932-5MU</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim (&#8805;98% HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>Dissolve in 100% (absolute) Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Amresco (Astral Scientific)</td>
			<td>E437-100MG</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacitracin from Bacillus licheniformis</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0125</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naladixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N8878</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyflurane (Pentrhox)</td>
			<td>Medical Developments International</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Paraplast Plus, Leica Biosystems</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxoid Anaerobic Jars</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HP0011/HP0031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAN Pasteur Pipettes</td>
			<td>Interpath Services</td>
			<td>200CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23g precision glide needle</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>301805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis, VWR</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portex fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>800/100/200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic feeding catheters</td>
			<td>Instech&#160; Laboratories</td>
			<td>FTP20-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml tuberculin luer slip disposable syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z317314</td>
			<td>Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACs Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M Tubes (orange cap)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>30-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic loop</td>
			<td>LabServ</td>
			<td>LBSLP7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6</td>
			<td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td>
			<td>4124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek III Uni-Casette System</td>
			<td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td>
			<td>4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome, Leica RM2235</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged SuperFrost Plus glass slides</td>
			<td>Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4951PLUS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse models of helicobacter infection and gastric pathologies

Helicobacter pylori er en gastrisk patogen, der er til stede i halvdelen af verdens befolkning og er en væsentlig årsag til morbiditet og mortalitet hos mennesker. Flere musemodeller af gastrisk Helicobacter infektion har udviklet for at studere molekylære og cellulære mekanismer hvorved H. pylori bakterier kolonisere maven i menneskelige værter og forårsage sygdom. Heri, vi beskriver protokollerne til: 1) forberede bakteriel suspensioner i vivo infektion af mus via gastrisk sonde; 2) bestemme bakteriel kolonisering niveauer i mus gastrisk væv, ved polymerase kædereaktion (PCR) og levedygtige optælling; og 3) vurdere patologiske ændringer af histologi. For at etablere Helicobactøh infektion i mus, specifikt patogenfri (SPF) dyr podes først med suspensioner (indeholdende ≥105 kolonidannende enheder, CFUs) af mus-koloniserer stammer af enten Helicobacter pylori eller andre gastrisk Helicobacter spp. fra dyr, som f.eks Helicobacter felis. På passende tidspunkter efter infektionen, er maver skåret ud og dissekeret sagittally i to lige store væv fragmenter, hver bestående af regionerne antrum og krop. En af disse fragmenter er derefter bruges til enten levedygtigt optælling eller DNA-ekstraktion, mens den anden er udsat for histologiske behandling. Bakteriel kolonisering og histopatologiske forandringer i maven kan vurderes rutinemæssigt i gastrisk væv sektioner farves med Warthin-stjernehimmel, Giemsa eller Haematoxylin og Eosin (H & E) pletter, som passende. Yderligere immunologiske analyser kan også varetages af Immunhistokemi eller immunfluorescens på musen gastrisk væv sektioner. De protokoller er beskrevet nedenfor er specielt designet til at muliggøre vurdering i mus af gastrisk patologier ligner dem i menneskelige-relaterede H. pylori sygdomme, herunder betændelse, kirtel atrofi og lymfoide follikel dannelse. Inokulum forberedelse og gastrisk sonde protokoller kan også tilpasses studere patogenesen af andre enteriske menneskelige patogener, at koloniser mus, såsom Salmonella Typhimurium eller Citrobacter rodentium.

Denne protokol beskriver en mundtlig sonde teknik for at opnå gastrisk infektion med H. pylori eller H. felis i murine musemodeller (figur 1). Efter eutanasi, maver fjernet, vejes og opdelt i 2 lige store halvdele bestående af antrum, krop og ikke-glandulær regioner af gastrisk væv (figur 2). Ikke-glandulær regionen er fjernet inden du udfører nogen analyser.
Vellykket kolonisering af dyr er typisk bekræftet v...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies at JoVE.com

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Musemodeller af Helicobacter infektion og gastrisk patologier

Mus repræsenterer en uvurderlig i vivo model til at studere infektion og sygdomme forårsaget af gastrointestinale mikroorganismer. Her, vi beskriver de metoder, der anvendes til at studere bakteriel kolonisering og histopatologiske forandringer i musemodeller af Helicobacter pylori-relateret sygdom.

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i gastroenterologi området om virkningen af medlemmer af mikrobiota, specielt dem af slægten Helicobacter, på inflammation og kræft. Den største fordel ved denne teknik er, at det giver mulighed for undersøgelse af Helicobacter infektion og dens indvirkning på maven under fysiologiske forhold. Konsekvenserne af denne teknik strækker sig mod udviklingen af behandlinger til forebyggelse eller eliminering af Helicobacter infektion eller dens konsekvenser, herunder antibiotika, narkotika, eller vacciner.Disse metoder giver indsigt, der er specifik for patogenesen af Helicobacter infektion. Flere af teknikkerne kan dog tilpasses til studiet af andre gastrointestinale patogener. Generelt, personer nye til denne metode vil kæmpe med udarbejdelsen af en bakteriel inoculum i stand til at etablere en infektion i mus.Det er bydende nødvendigt, at Helicobacter isolater er kendt mus-koloniserende stammer, der ikke har gennemgået omfattende subkultur in vitro. Desuden skal antallet af in vitro-subkulturer for disse stammer registreres. Tilføj bakterielle suspensioner til 15-milliliter polystyren rør, og bruge en plast løkke til at overføre en 10-til 20-mikroliter dråbe fra hver kultur på de enkelte glas mikroskop dias.Derefter vurdere levedygtighed og motilitet af bakterier under fase-kontrast mikroskopi på en 100 gange forstørrelse. Brug kun H.pylori-inokulen, hvis størstedelen af bakterierne har en bacillær form. H.felis inocula bør primært indeholde spiralformede bakterier.Og læg inocula i individuelle, engangs-, en-milliliter sprøjter. Udstyr hver sprøjte med en 23-gauge nål, og brug plast paraffin film til at fastgøre en engangs polyethylen kateter til hver nål. Dernæst manuelt begrænse en seks-til otte uger gamle specifikke-patogen-fri og Helicobacter-fri mus ved scruff af hals og hale, og indsætte et kateter i midten af den åbne kæbe.Før kateteret i en halelinje mod spiserøret, der strækker musens hals for at give nem adgang til maven gennem spiserøret og væk fra luftrøret, indtil det meste af eller hele kateteret ikke længere er synligt, og der mærkes modstand. Derefter levere mindst én gange 10 til den femte bakterier for at sikre en optimal kolonisering og sygdom patologi. I slutningen af forsøget, bruge fine, buede saks til at åbne bughulen for excision af maven.Skær maven langs den større krumning, og vask forsigtigt orglet to gange i et 50-milliliterrør frisk PBS pr. vask for at fjerne eventuelle restprodukter. Efter den anden vask, placere vævet i en tjæret, seks-centimeter, plast petriskål til at registrere den våde vægt. Efter udfladning af maven, bisect prøven sagittally i to lige væv fragmenter bestående af antrum, krop, og ikke-kirtel skovfora regioner.Fjern den ikke-kirtelregion, og afveje den ene halvdel af hver mave, før du opbevarer stykke væv i den relevante opløsning til den planlagte downstream analyse. Tilsæt den anden halvdel af mavevæv til en 15-milliliter konisk rør, der indeholder 10% formalin, udfladning væv mod de øverste sider af rørene efter 10 sekunder. Når vævene er blevet fastgjort til rørvæggene, nedsænkes prøverne i formalin i mindst 24 timer.For at tælle antallet af levedygtige H.pylori i maven efter infektion, homogenisere maveprøver gemt i BHI, og udføre dublerede serielle fortyndinger af den resulterende gastrisk homogenater i frisk, steril bouillon. Opdel fortørret hesteblod agar, eller HBA, plader suppleret med yderligere antibiotika i tre eller fire segmenter, og ved hjælp af en tilpasning af Miles og Misra teknik, tilføje 10 til 100 mikroliter af hver mave homogen fortynding på et segment af hver agar plade. Spred homogenates med sterile, plast sløjfer, og lad pladerne til tørre.Derefter placeres pladerne i en omvendt position i anaerobe gaskruker, der indeholder en petriskål med vand og en gaspakke. Derefter inkubere krukker på 37 grader Celsius i fire til syv dage. Når kolonier kan observeres, optælle de segmenter, der indeholder mellem 10 og 100 isolerede kolonier.Efter aktiv dødshjælp høstes maven fra dyrene og vejes. Den ikke-kirtel region er fjernet, og maven er opdelt i to lige store halvdele bestående af antrum og krop. Vellykket kolonisering bekræftes typisk ved at udføre levedygtig optælling og efterfølgende optælling af individuelle kolonier fra gastrisk homogenater stribet på HBA plader.Bemærk, at tilstedeværelsen af forurenende bakterier fra musen gastrisk mikrobiota eller et stort antal H.pylori kolonier kan komplicere optællingen af H.pylori CFUs. Alternativt kan PCR anvendes til at verificere infektion ved hjælp af specifikke validerede primere rettet mod en 325-base par region af H.felis og H.pylori ureB gener. I dette repræsentative eksperiment viste vilde type C57 Black-6 mus moderate tegn på betændelse, herunder hyperplasi og kirtelatrofi efter seks måneder efter infektion med H.felis, samt cellulær infiltration af submucosa.Mere alvorlig inflammation er observeret i knockout mus på samme tidspunkt, med den ekstra tilstedeværelse af lymfoide follikler observeret i nærheden af cellulære infiltrater. H.felis bakterier kan også visualiseres i Giemsa-farvede dele af inficerede mus mavevæv. Efter denne procedure, andre metoder som kvantitative PCR, immunohistochemistry, eller immunofluorescens kan udføres for at besvare yderligere spørgsmål om de typer af vært svar induceret under Helicobacter infektion.Efter sin udvikling, denne teknik banede vejen for forskere inden for mikrobiologi og gastroenterologi at udforske den forårsagende rolle Helicobacter pylori i mavesygdom hos mennesker. Efter at have set denne video, bør du have en god forståelse af, hvordan man reproducerbart inficere mus med Helicobacter arter og studere patologi forbundet med infektionen. Glem ikke, at Helicobacter stammer, der anvendes i denne protokol er smitsomme, og derfor standard biosikkerhed procedurer bør altid følges, mens du arbejder med disse bakterier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration af rekombinant influenzavacciner i kimære musemodeller at studere slimhindeimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids som model for infektionssygdomme: Kultur i humane og murine mave Organoids og Mikroinjektion af Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intratrakeal administration<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; I musemodeller at studere Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Et-trins Negativ kromatografisk oprensning af<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofilaktiverende protein overudtrykt i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; I Batch Mode

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Mus - og menneske-afledte primære gastrisk epitelial éncellelag kultur for studiet af regenerering

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Intrakranielle Subarachnoidal rute for infektion for at undersøge roller af Streptococcus suis biofilm i Meningitis i en musemodel infektion

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

CRISPR-Cas9-baseret genom Engineering til at generere Jurkat Reporter modeller for HIV-1 infektion med udvalgte Proviral Integration websteder

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models

Kronisk, akut, og reaktiveret HIV-infektion i humaniserede immundefekt musemodeller

Humanized NOD/SCID/IL-2 receptor &#947;-chainnull mice recapitulate some features of human immunity, which can be exploited in basic and pre-clinical ...