Name: mouse models of helicobacter infection and gastric pathologies
Uploaded: 2018-10-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies at JoVE.com

Die Autoren möchten Frau A. De Paoli und Frau Georgie Wray-McCann für technische Unterstützung danken. Die Autoren erkennen Nutzung der Einrichtungen und technische Unterstützung von Monash Histologie Plattform, Institut für Anatomie und Entwicklungsbiologie, Monash University. Das Labor wird unterstützt durch Mittel aus der National Health and Medical Research Council (NHMRC) für RLF (APP1079930, APP1107930). RLF wird von einem Senior Research Fellowship von NHMRC (APP1079904) unterstützt. KD und MC sind beide von Monash Graduate Stipendien unterstützt. KD wird unterstützt vom Zentrum für angeborene Immunität und infektiöse Erkrankungen, Hudson Institute der medizinischen Forschung, während MC ein International Postgraduate Stipendium von der Fakultät für Medizin, Pflege und Gesundheitswissenschaften, Monash University hat. Forschung am Hudson Institute of Medical Research wird von der Staatsregierung betriebliche Infrastruktur Support-Programm unterstützt.

1. Wachstum und Vorbereitung der bakteriellen Impfkulturen
<ol><li>Tauen Sie Glycerin Bestände von H. Pylori oder H. Felis15 von-80 ° C und Subkultur auf Pferd BLUTAGAR (HBA) Platten bestehend aus: BLUTAGAR Base Nr. 2 (siehe Tabelle der Materialien); eine modifizierte "Skirrows Antibiotika selektive Ergänzung" (bestehend aus Vancomycin, 10 μg/mL; Polymyxin B, 25 ng/mL; Trimethoprim, 5 µg/mL; Amphotericin B, 2,5 μg/mL); und 5 – 10 % (V/V) Pferd Blut<sup ...

<ol>
	<li>Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Helicobacter+pylori+infection+and+public+health+implications.">Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications.</a> Helicobacter. 16, 1-9 (2011).</li><li>Montecucco, C., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+dangerously:+how+Helicobacter+pylori+survives+in+the+human+stomach.">Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).</li><li>Akopyants, N. 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A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma.</a> The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+mouse+model+of+Helicobacter+pylori+infection:+introducing+the+Sydney+strain.">A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain.</a> Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).</li><li>Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+colonizing+Helicobacter+pylori+strain+SS1+may+lack+a+functional+cag+pathogenicity+island.">The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island.</a> Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).</li><li>Israel, D. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+host+genetic+background+on+immune+responses+to+Helicobacter+pylori+infection+and+therapeutic+vaccine+efficacy.">Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).</li><li>Nedrud, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+genetic+influence+on+the+innate+inflammatory+response+to+helicobacter+infection+of+the+gastric+mucosa.">Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+felis+eradication+restores+normal+architecture+and+inhibits+gastric+cancer+progression+in+C57BL/6+mice.">Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice.</a> Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).</li><li>Ferrero, R. L., Labigne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+expression+and+sequencing+of+Helicobacter+felis+urease+genes.">Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes.</a> Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).</li><li>Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Helicobacter+pylori+in+various+liquid+and+plating+media.">Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media.</a> Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).</li><li>Uotani, T., Graham, D. 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R., Besch-Williford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+murine+helicobacters+by+PCR+and+restriction+enzyme+analyses.">Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses.</a> Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).</li><li>Chaouche-Drider, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+commensal+Helicobacter+sp.+of+the+rodent+intestinal+flora+activates+TLR2+and+NOD1+responses+in+epithelial+cells.">A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells.</a> PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).</li><li>Fox, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+bilis:+bacterial+provocateur+orchestrates+host+immune+responses+to+commensal+flora+in+a+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease.</a> Gut. 56 (7), 898-900 (2007).</li><li>McGee, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+enhances+Helicobacter+pylori+resistance+to+antibiotics+and+LL-37.">Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).</li><li>Viala, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nod1+responds+to+peptidoglycan+delivered+by+the+Helicobacter+pylori+cag+pathogenicity+island.">Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island.</a> Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+PCR+method+to+detect+Helicobacter+felis+in+a+conventional+mouse+model.">A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).</li><li>Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Helicobacter+felis+colonization+in+male+129/Sv+mice+fails+to+suppress+gastritis.">Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis.</a> Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).</li><li>Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbred+mice+with+long-term+Helicobacter+felis+infection+develop+both+gastric+lymphoid+tissue+and+glandular+hyperplastic+lesions.">Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions.</a> The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).</li></ol>

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von einem in-Vivo -Mausmodell für Helicobacter -Infektion. Die entscheidenden Schritte des Verfahrens sind die: 1) Vorbereitung der Helicobacter Inokula, lebensfähige und bewegliche Bakterien; (2) Lieferung der entsprechenden Zahl von Bakterien an die Maus über eines-Magensonde; (3) Nachweis von bakteriellen Infektionen durch koloniezahlbestimmung und/oder PCR; und 4) Verarbeitung von Magen Gewebe ermöglichen die Beurteilung der Histopathologie in ...

Helicobacter Pylori ist eine spiralförmige, Gramnegative, menschlichen Magen Erreger vorhanden in allen Bevölkerungsgruppen auf der ganzen Welt, mit Infektionsraten in den Entwicklungsländern, die voraussichtlich in der Größenordnung von 80 %1. Obwohl die meisten H. Pylori-infizierte Personen asymptomatisch sind, einige schwere Krankheiten, Magenkrebs2von Verdauungs-Geschwüre bis zu entwickeln. H. Pylori-assoziierten Krebsarten im großen und ganzen zeichnen sich durch bösartige Veränderungen in Epithelzellen (GECs) oder durch die Bildung von extra nodal lymphatischen Gewebe im Magen, wodurch Magen Adenokarzinom oder Schleimhaut-assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT) Lymphom, beziehungsweise. H. Pylori ist sehr angepasst, um zu überleben in der rauen ökologische Nische des Magens durch die Anwesenheit von verschiedenen Virulenzfaktoren und Mechanismen, die Erleichterung der Einhaltung, Wachstum und Stoffwechsel in dieser Nische. Insbesondere besitzen virulente Stämme von H. Pylori 40 kb Cag Pathogenität Insel (CagPAI), die ungefähr 30 Gene für die Produktion einer Typ 4-Sekretion System (T4SS)3,4 erforderlichen kodiert . CAG PAI-positiven H. Pylori -Stämme sind verbunden mit der Induktion von höheren Ebenen der chronischen Entzündung in der Hostie, die als ein wesentlicher Vorläufer der Magen Adenokarzinom5verwickelt hat.
In Vivo Tiermodellen, insbesondere Mäuse wurden dadurch, dass Forscher untersuchen die relativen Beiträge der Host, bakterielle und umweltbedingten Faktoren auf H. Pylori -Infektion und Krankheit Ergebnis6sehr informativ. Studien haben bisher gezeigt, die verlängerte H. Pylori Infektion der Mäuse C57BL/6 genetischen Hintergrund Ergebnisse bei der Entwicklung von chronischer Gastritis und Drüse verkümmert, beide Kennzeichen von H. Pylori -Infektion-7. Infektion mit den verwandten Bakterienarten Katze/Hund, H. Felis, ist darüber hinaus nachweislich induzieren Malz Bildung bei Mäusen mit ähnlichen Pathologie und Fortschreiten der Krankheit wie im menschlichen MALT-Lymphom8,9zu sehen. Die am häufigsten verwendeten H. Pylori Isolat in Studien an Mäusen Kolonisation ist die "Sydney Sorte 1" (SS1) Belastung10, die CagPAI+ , sondern hat ein nicht-funktionale T4SS (T4SS−)11. Andere weit verbreiteten Sorten sind H. Pylori B128 7.13 (CagPAI+/T4SS+)12 und X47-2AL (CagPAI–/T4SS−)13. Für H. Felis Infektionen, die Belastung CS1 ("Cat Spirale 1", CagPAI–/T4SS−) ist in der Regel verwendete14.
Hier bieten wir ein Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Helicobacter Impfkulturen für in-Vivo -Infektion, das Verfahren für die eines-Magensonde von Mäusen, sowie Methoden für die Verarbeitung von Gewebe für die Untersuchung von histopathologischen Veränderungen in den Magen. Insbesondere konzentriert sich dieser Artikel auf die histologischen Methoden zur bakteriellen Besiedelung zu visualisieren und histopathologische Veränderungen, einschließlich der Malz-Bildung in der Magenschleimhaut von infizierten Mäusen zu beurteilen. Einige der hier beschriebenen Methoden kann das Studium der andere Darm-Erreger wie S. angepasst werden. Typhimurium oder C. Rodentium.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacteriological reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxoid Blood Agar Base No.2</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>CM0271B</td>
			<td>Dissolve in deinonized water prior to sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Defibrinated Horse blood</td>
			<td>Australian Ethical Biologicals</td>
			<td>PDHB100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Brain Heart Infusion Broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>237500</td>
			<td>Dissolve in deinonized water prior to sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CampyGen gas packs</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>CN0035A/CN0025A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute alcohol, 100% Denatured</td>
			<td>ChemSupply</td>
			<td>AL048-20L-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-propanol)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene (sulphur free)</td>
			<td>ChemSupply</td>
			<td>XT003-20L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s Haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>&#160;MH-1L</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin, Aqueous Stain</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>EOCA-1L</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright-Giemsa Stain, modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WG80-2.5L</td>
			<td>Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>11031/5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.00579.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;M8291</td>
			<td>Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39028</td>
			<td>Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Univar (Ajax Fine Chemicals)</td>
			<td>A475-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulphate Heptahydrate</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>MA048-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V2002-1G</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4932-5MU</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim (&#8805;98% HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>Dissolve in 100% (absolute) Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Amresco (Astral Scientific)</td>
			<td>E437-100MG</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacitracin from Bacillus licheniformis</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0125</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naladixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N8878</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyflurane (Pentrhox)</td>
			<td>Medical Developments International</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Paraplast Plus, Leica Biosystems</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxoid Anaerobic Jars</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HP0011/HP0031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAN Pasteur Pipettes</td>
			<td>Interpath Services</td>
			<td>200CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23g precision glide needle</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>301805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis, VWR</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portex fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>800/100/200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic feeding catheters</td>
			<td>Instech&#160; Laboratories</td>
			<td>FTP20-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml tuberculin luer slip disposable syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z317314</td>
			<td>Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACs Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M Tubes (orange cap)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>30-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic loop</td>
			<td>LabServ</td>
			<td>LBSLP7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6</td>
			<td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td>
			<td>4124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek III Uni-Casette System</td>
			<td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td>
			<td>4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome, Leica RM2235</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged SuperFrost Plus glass slides</td>
			<td>Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4951PLUS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse models of helicobacter infection and gastric pathologies

Helicobacter Pylori ist ein Magen-Erreger, die in der Hälfte der Weltbevölkerung vorhanden ist und ist eine wesentliche Ursache für Morbidität und Mortalität beim Menschen. Mehrere Maus-Modellen der Magen Helicobacter -Infektion wurden entwickelt, um die molekularen und zellulären Mechanismen zu untersuchen, wobei die H. Pylori -Bakterien besiedeln den Magen des menschlichen Wirte und Krankheiten verursachen. Hier beschreiben wir Protokolle: 1) bereiten Sie bakterielle Aufhängungen für die in-Vivo -Infektion von Mäusen über eines-Magensonde; (2) bestimmen Sie bakterienbesiedlung in Maus Magen Gewebe, durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und tragfähige zählen; und 3) krankhafte Veränderungen durch Histologie zu beurteilen. Um Helicobactäh Infektion bei Mäusen zu etablieren, bestimmten Pathogen-freies (SPF) Tiere sind zunächst mit Suspensionen (mit ≥105 koloniebildenden Einheiten KBE) der Maus besiedeln entweder Helicobacter Pylori -Stämme beimpft oder andere Magen Helicobacter spp. von Tieren, wie z. B. Helicobacter Felis. Zu den entsprechenden Zeitpunkten nach der Infektion sind Mägen ausgeschnitten und seziert sagittal in zwei gleich gewebefragmente, jeweils bestehend aus den Regionen Antrum und Körper. Eines dieser Fragmente wird verwendet für tragfähige zählen oder DNA-Extraktion, während die anderen histologischen Verarbeitung unterliegt. Bakterielle Besiedlung und histopathologische Veränderungen im Magen können routinemäßig im Magen Gewebeschnitte gebeizt mit Warthin-Starry, Giemsa oder Hämatoxylin und Eosin (H & E) Flecken, entsprechend bewertet werden. Zusätzliche immunologische Analysen darf auch von Immunohistochemistry oder Immunfluoreszenz auf Maus Magen Gewebeschnitte vorgenommen werden. Die nachfolgend beschriebenen Protokolle sind speziell für die Beurteilung bei Mäusen der gastrischen Krankheiten ähnlich denen in Mensch-im Zusammenhang mit H. Pylori ermöglichen Krankheiten, einschließlich Entzündung, Atrophie der Drüse und lymphoide Follikel Bildung. Das Inokulum Vorbereitung und eines-Magensonde Protokolle können auch an die Pathogenese der anderen magensaftresistenten humanpathogene Erreger zu studieren, die Mäuse, wie Salmonella Typhimurium oder Citrobacter Rodentiumbesiedeln angepasst werden.

Dieses Protokoll beschreibt eine orale Magensonde Technik um eines-Infektion mit H. Pylori oder H. Felis in murinen Mausmodellen (Abbildung 1) zu erreichen. Nach Euthanasie Mägen sind entfernt, gewogen und geteilt in 2 gleiche Hälften bestehend aus Antrum, Körper und nicht-Drüsen Regionen der Magen Gewebe (Abbildung 2). Nicht glanduläre Region wird entfernt, bevor Sie irgendwelche Analysen durchführen.
Erfolgre...

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Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Maus-Modellen der Helicobacter -Infektion und Magen-Erkrankungen

Mäuse sind ein unschätzbares in Vivo -Modell, Infektionen und Krankheiten, die durch Magen-Darm-Mikroorganismen zu studieren. Hier beschreiben wir die Methoden zur Untersuchung der bakteriellen Besiedelung und histopathologische Veränderungen in Mausmodellen von Helicobacter Pylori-Krankheiten.

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Gastroenterologie über die Auswirkungen der Mitglieder der Mikrobiota, insbesondere die der Gattung Helicobacter, auf Entzündungen und Krebs zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass es die Untersuchung von Helicobacter-Infektion und seine Auswirkungen auf den Magen unter physiologischen Bedingungen ermöglicht. Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Entwicklung von Therapien zur Vorbeugung oder Eliminierung von Helicobacter-Infektionen oder deren Folgen, einschließlich Antibiotika, Medikamenten oder Impfstoffen.Diese Methoden liefern Spezifische Einblicke in die Pathogenese der Helicobacter-Infektion. Jedoch, mehrere der Techniken können an die Untersuchung von anderen Magen-Darm-Erregern angepasst werden. Im Allgemeinen, Personen neu zu dieser Methode wird mit der Vorbereitung eines bakteriellen Inokulum in der Lage, eine Infektion bei Mäusen zu etablieren kämpfen.Es ist zwingend erforderlich, dass die Helicobacter Isolate bekannt sind Maus-kolonisierende Stämme, die nicht umfangreiche Subkultur in vitro durchlaufen haben. Darüber hinaus sollte die Anzahl der In-vitro-Subkulturen für diese Stämme erfasst werden. Fügen Sie 15-Milliliter-Polystyrol-Röhren bakterielle Suspensionen hinzu und übertragen Sie mit einer Kunststoffschlaufe ein 10-bis 20-Mikroliter-Tröpfchen aus jeder Kultur auf einzelne Glasmikroskop-Dias.Bewerten Sie dann die Lebensfähigkeit und Beweglichkeit der Bakterien unter Phasenkontrastmikroskopie bei einer 100-fachen Vergrößerung. Verwenden Sie die H.pylori-Inocula nur, wenn die Mehrheit der Bakterien eine bacilläre Form hat. H.felis Inocula sollte in erster Linie helical-förmige Bakterien enthalten.Und laden Sie die Inocula in einzelne Einweg- und Ein-Milliliter-Spritzen. Legen Sie jede Spritze mit einer 23-Spur-Nadel aus und verwenden Sie Eine Kunststoff-Paraffinfolie, um einen Einweg-Polyethylenkatheter an jeder Nadel zu befestigen. Als nächstes halten Sie eine sechs bis acht Wochen alte spezifisch pathogenfreie und helicobacterfreie Maus manuell an Hals und Schwanz zurück und legen Sie einen Katheter in die Mitte des offenen Kiefers ein.Führen Sie den Katheter in einem Kaudal in Richtung der Speiseröhre, den Hals der Maus zu verlängern, um einen einfachen Zugang zum Magen durch die Speiseröhre und weg von der Luftröhre zu ermöglichen, bis der größte oder der gesamte Katheter nicht mehr sichtbar ist und ein Widerstand zu spüren ist. Dann, liefern Sie mindestens ein mal 10 an die fünften Bakterien, um eine optimale Besiedlung und Krankheitspathologie zu gewährleisten. Verwenden Sie am Ende des Experiments eine feine, gekrümmte Schere, um die Bauchhöhle für die Exzision des Magens zu öffnen.Schneiden Sie den Magen entlang der größeren Krümmung, und waschen Sie das Organ vorsichtig zwei Mal in einem 50-Milliliter-Rohr mit frischem PBS pro Wäsche, um Restnahrung zu entfernen. Nach der zweiten Wäsche das Gewebe in eine geteerte, sechs Zentimeter große Petrischale aus Kunststoff legen, um das Nassgewicht aufzuzeichnen. Nach der Abflachung des Magens, bisect die Probe sagittal in zwei gleiche Gewebefragmente, die die Antrum, Körper, und nicht-drüsense Vorstomach Regionen.Entfernen Sie den nichtdrüsenseen Bereich und wiegen Sie die Hälfte jedes Magens, bevor Sie das Gewebestück in der geeigneten Lösung für die geplante nachgelagerte Analyse aufbewahren. Fügen Sie die andere Hälfte des Magengewebes in ein 15-Milliliter konisches Rohr mit 10% Formalin, Abflachen des Gewebes gegen die Oberseite der Röhren nach 10 Sekunden. Wenn das Gewebe an den Rohrwänden befestigt wurde, tauchen Sie die Proben für mindestens 24 Stunden wieder in das Formalin ein.Um die Anzahl der lebensfähigen H.pylori im Magen nach der Infektion zu zählen, homogenisieren Magenproben in BHI gespeichert, und führen doppelte serielle Verdünnungen der resultierenden Magenhomogenate in frischer, steriler Brühe. Vorgetrocknete Pferdeblutagar oder HBA, Platten mit zusätzlichen Antibiotika ergänzt in drei oder vier Segmente, und fügen Sie mit einer Anpassung der Miles und Misra Technik 10 bis 100 Mikroliter jedes Magen homogenate Verdünnung auf ein Segment jeder Agarplatte. Die Homogenate mit sterilen Kunststoffschlaufen verteilen und die Platten trocknen lassen.Legen Sie die Platten dann in eine umgekehrte Position in anaerobe Gasgefäße, die eine Petrischale mit Wasser und eine Gaspackung enthalten. Dann bebrüten die Gläser bei 37 Grad Celsius für vier bis sieben Tage. Wenn Kolonien beobachtet werden können, zählen Sie die Segmente auf, die zwischen 10 und 100 isolierte Kolonien enthalten.Nach der Euthanasie wird der Magen von den Tieren geerntet und gewogen. Der nichtdrüsensee Bereich wird entfernt, und der Magen ist in zwei gleiche Hälften unterteilt, die das Antrum und den Körper umfassen. Eine erfolgreiche Kolonisation wird in der Regel durch eine lebensfähige Zählung und nachfolgende Aufzählung einzelner Kolonien aus Magenhomogenaten bestätigt, die auf HBA-Platten gestreift sind.Beachten Sie, dass das Vorhandensein von kontaminierenden Bakterien aus der Magenmikrobiota der Maus oder einer großen Anzahl von H.pylori-Kolonien die Aufzählung von H.pylori KBE erschweren kann. Alternativ kann PCR verwendet werden, um Infektionen mit spezifischen validierten Primern zu überprüfen, die auf eine 325-Basis-Paarregion der H.felis- und H.pylori ureB-Gene gerichtet sind. In diesem repräsentativen Experiment zeigten Wildtyp C57 Black-6-Mäuse moderate Anzeichen einer Entzündung, einschließlich Hyperplasie und Drüsenatrophie bei sechs Monaten nach der Infektion mit H.felis, sowie zelluläre Infiltration der Submucosa.Schwerere Entzündungen werden bei Knockout-Mäusen gleichzeitig beobachtet, wobei die zusätzliche Anwesenheit von Lymphfollikel in unmittelbarer Nähe der zellulären Infiltrate beobachtet wird. H.felis Bakterien können auch in Giemsa-befleckten Abschnitten des infizierten Mausmagengewebes visualisiert werden. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie quantitative PCR, Immunhistochemie oder Immunfluoreszenz durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen über die Arten von Wirtsreaktionen zu beantworten, die während einer Helicobacter-Infektion induziert werden.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Mikrobiologie und Gastroenterologie, um die ursächliche Rolle von Helicobacter pylori bei Magenerkrankungen beim Menschen zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Mäuse mit Helicobacter-Arten reproduzierbar infizieren und die mit der Infektion verbundene Pathologie untersuchen können. Vergessen Sie nicht, dass die Helicobacter-Stämme, die in diesem Protokoll verwendet werden, infektiös sind, und daher sollten Standard-Biosicherheitsverfahren immer bei der Arbeit mit diesen Bakterien befolgt werden.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Transurethrale Induktion von Maus Harnwegsinfekt

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice

Diagnose von Ekto-und Endoparasiten in Laborratten und Labormäusen

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Die intranasale Verabreichung von rekombinantem Influenza Vaccines in chimären Maus-Modelle zu Mucosale Immunität Studieren

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoide als Modell für Infektionskrankheiten: Kultur von humanen und murinen Magen Organoide und Mikroinjektion von Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intratracheale Verabreichung von<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; In Mausmodelle zur Untersuchung Atemwegsentzündung

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Ein-Schritt-Negative chromatographischer Reinigung von<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrophil-aktivierendes Protein überexprimiert in<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Im Batch-Modus

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Abgeleitet von Maus und Mensch primäre gastrische Epithelzellen Monolayer Kultur for the Study of Regeneration

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Intrakranielle Subarachnoidal Route der Infektion für die Untersuchung Rollen von Streptococcus Suis Biofilmen in Meningitis in einem Mausmodell der Infektion

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

CRISPR-Cas9-basierte Genom Engineering Jurkat Reporter Modelle für HIV-1-Infektion mit ausgewählten proviralen Integration Websites generieren

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models

Chronische, akute und reaktivierte HIV-Infektion in humanisierten immundefizienten Mausmodellen

Humanized NOD/SCID/IL-2 receptor &#947;-chainnull mice recapitulate some features of human immunity, which can be exploited in basic and pre-clinical ...