Name: mouse models of helicobacter infection and gastric pathologies
Uploaded: 2018-10-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies at JoVE.com

המחברים רוצה להודות גב' א דה פאולי, גב' ג'ורג'י. ריי מקאן לקבלת סיוע טכני. המחברים להכיר השימוש במתקני וסיוע טכני של פלטפורמה היסטולוגיה מונש, המחלקה של האנטומיה, ביולוגיה התפתחותית, אוניברסיטת מונש. המעבדה נתמך על ידי מימון הלאומי לבריאות, המועצה למחקר רפואי (NHMRC) רוזה לוקסמבורג (APP1079930, APP1107930). רוזה לוקסמבורג נתמך על ידי מלגת מחקר בכיר מ NHMRC (APP1079904). KD ו- MC שניהם נתמכים על ידי מונש מלגות לתואר שני. KD נתמך גם על ידי המרכז מולדת חסינות, זיהומיות מחלות, מכון הדסון למחקר רפואי, בעוד MC יש מלגת לתארים מתקדמים הבינלאומי מן הפקולטה לרפואה, לסיעוד למדעי הבריאות, אוניברסיטת מונש. מחקר על הדסון המכון של המחקר הרפואי נתמך על ידי תוכנית תמיכה תשתיות מבצעיות של הממשלה ויקטוריאני.

1. צמיחה והכנה של חיידקי Inocula
<ol><li>הפשרת גליצרול המלאי של ה פילורי או חתול ה15 מ-80 מעלות צלזיוס ו תת-תרבות על פלטות אגר דם (HBA) סוס הכוללת: אגר דם בסיס מס ' 2 (ראה טבלה של חומרים); ששונה "אנטיביוטי בררני תוספת של Skirrow" (המורכב ואנקומיצין, 10 μg/mL; polymyxin B, ננוגרם למ"ל 25; וטר...

<ol>
	<li>Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Helicobacter+pylori+infection+and+public+health+implications.">Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications.</a> Helicobacter. 16, 1-9 (2011).</li><li>Montecucco, C., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+dangerously:+how+Helicobacter+pylori+survives+in+the+human+stomach.">Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).</li><li>Akopyants, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+the+cag+pathogenicity+island+of+Helicobacter+pylori.">Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori.</a> Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).</li><li>Censini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cag,+a+pathogenicity+island+of+Helicobacter+pylori,+encodes+type+I-specific+and+disease-associated+virulence+factors.">cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).</li><li>Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+innate+immunity+in+Helicobacter+pylori-induced+gastric+malignancy.">Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).</li><li>O'Rourke, J. L., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Helicobacter+pylori+infection+and+disease.">Animal models of Helicobacter pylori infection and disease.</a> Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).</li><li>Sakagami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrophic+gastric+changes+in+both+Helicobacter+felis+and+Helicobacter+pylori+infected+mice+are+host+dependent+and+separate+from+antral+gastritis.">Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis.</a> Gut. 39 (5), 639-648 (1996).</li><li>Correa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+and+gastric+carcinogenesis.">Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).</li><li>Enno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALToma-like+lesions+in+the+murine+gastric+mucosa+after+long-term+infection+with+Helicobacter+felis.+A+mouse+model+of+Helicobacter+pylori-induced+gastric+lymphoma.">MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma.</a> The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+mouse+model+of+Helicobacter+pylori+infection:+introducing+the+Sydney+strain.">A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain.</a> Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).</li><li>Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+colonizing+Helicobacter+pylori+strain+SS1+may+lack+a+functional+cag+pathogenicity+island.">The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island.</a> Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).</li><li>Israel, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+strain-specific+differences+in+genetic+content,+identified+by+microarray,+influence+host+inflammatory+responses.">Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).</li><li>Fox, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori-induced+gastritis+in+the+domestic+cat.">Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat.</a> Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).</li><li>Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+spiral-shaped+bacterium+from+the+cat+stomach.">Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach.</a> Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).</li><li>Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+Helicobacter-induced+gastric+cancer:+use+of+cocarcinogens.">Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens.</a> Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).</li><li>Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+of+specific-pathogen-free+mice+to+chronic+Helicobacter+pylori+(strain+SS1)+infection.">Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection.</a> Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).</li><li>Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+maintenance+of+Helicobacter+species.">Laboratory maintenance of Helicobacter species.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+host+genetic+background+on+immune+responses+to+Helicobacter+pylori+infection+and+therapeutic+vaccine+efficacy.">Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).</li><li>Nedrud, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+genetic+influence+on+the+innate+inflammatory+response+to+helicobacter+infection+of+the+gastric+mucosa.">Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+felis+eradication+restores+normal+architecture+and+inhibits+gastric+cancer+progression+in+C57BL/6+mice.">Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice.</a> Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).</li><li>Ferrero, R. L., Labigne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+expression+and+sequencing+of+Helicobacter+felis+urease+genes.">Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes.</a> Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).</li><li>Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Helicobacter+pylori+in+various+liquid+and+plating+media.">Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media.</a> Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).</li><li>Uotani, T., Graham, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+Helicobacter+pylori+using+the+rapid+urease+test.">Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test.</a> Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).</li><li>Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+murine+helicobacters+by+PCR+and+restriction+enzyme+analyses.">Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses.</a> Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).</li><li>Chaouche-Drider, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+commensal+Helicobacter+sp.+of+the+rodent+intestinal+flora+activates+TLR2+and+NOD1+responses+in+epithelial+cells.">A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells.</a> PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).</li><li>Fox, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+bilis:+bacterial+provocateur+orchestrates+host+immune+responses+to+commensal+flora+in+a+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease.</a> Gut. 56 (7), 898-900 (2007).</li><li>McGee, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+enhances+Helicobacter+pylori+resistance+to+antibiotics+and+LL-37.">Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).</li><li>Viala, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nod1+responds+to+peptidoglycan+delivered+by+the+Helicobacter+pylori+cag+pathogenicity+island.">Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island.</a> Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+PCR+method+to+detect+Helicobacter+felis+in+a+conventional+mouse+model.">A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).</li><li>Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Helicobacter+felis+colonization+in+male+129/Sv+mice+fails+to+suppress+gastritis.">Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis.</a> Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).</li><li>Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbred+mice+with+long-term+Helicobacter+felis+infection+develop+both+gastric+lymphoid+tissue+and+glandular+hyperplastic+lesions.">Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions.</a> The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).</li></ol>

פרוטוקול זה מתאר את השימוש מודל העכבר ויוו זיהום הליקובקטר . השלבים הקריטיים של ההליך הם: 1) הכנת הליקובקטר inocula המכיל חיידקים קיימא תאי; 2) משלוח של המספרים המתאימים של חיידקים העכבר באמצעות intragastric gavage; 3) גילוי של זיהום חיידקי המושבה סופר ו/או PCR; . ו-4) עיבוד של רקמות הקיבה כדי לא...

הליקובקטר פילורי הוא. בצורת ספירלה, גראם שליליים, אנושי קיבה חיידק נוכח כל האוכלוסיות ברחבי העולם, עם זיהום המחירים במדינות מתפתחות מוערך לפי 80%1. למרות שרוב ח פילורי-אנשים נגועים הם אסימפטומטיים, יש לפתח מחלות חמורות יותר, ועד סרטן קיבה2כיב פפטי. ח פילורי-סרטן הקשורים בהרחבה מאופיינים על-ידי שינויים ממאירים בתאי אפיתל (GECs) או היווצרות של רקמות הלימפה קטרי במיוחד בבטן, וכתוצאה מכך אדנוקרצינומה קיבה או רירית הקשורים הלימפה לימפומה רקמות (מאלט), בהתאמה. ח פילורי מותאמת במיוחד כדי לשרוד גומחה אקולוגית קשה של הקיבה בשל נוכחותם של הגורמים התקפה אלימה ומנגנונים שונים להקל על הדבקות שלה, גדילה וחילוף החומרים במקצוע הזה. בפרט, ארסית זני ה פילורי להחזיק את 40 kb חטיבתי פתוגניות איילנד (חטיבתיפאי) מקודד כ 30 גנים הדרושים לייצור סוג 4 הפרשת מערכת (T4SS)3,4 . חטיבתי פאי-חיוביות ח פילורי זנים משויכים אינדוקציה של רמות גבוהות של דלקת כרונית במארח, אשר היה מעורב כמו קודמן חיוני של אדנוקרצינומה קיבה5.
In vivo מודלים בעלי חיים, במיוחד עכברים, היה מאוד אינפורמטיבי על ידי ומאפשר לחוקרים לחקור את התרומה של המארח, גורמים חיידקי וסביבתיים על ה פילורי זיהום, מחלת התוצאה6. מחקרים בעבר הראו כי ממושך ח פילורי זיהום של עכברים על הרקע הגנטי C57BL/6 תוצאות בפיתוח של גסטריטיס כרונית של בלוטת להתנוון, שניהם ההיכר של ה פילורי זיהום7. יתר על כן, זיהום עם המין חיידקי קשורים חתולים/כלב, חתול ה', הוכח כדי לעודד היווצרות מאלט בעכברים עם התקדמות המחלה כפי שניתן לראות ב-8,לימפומה מאלט האנושי9מחלות דומות. הנפוץ ביותר בשימוש ח פילורי בידוד במחקרים קולוניזציה העכבר הוא "סידני המתח 1" (SS1) זן10, אשר חטיבתיפאי+ אך יש של T4SS שאינם פונקציונליים (T4SS−)11. זנים אחרים בשימוש נרחב כוללים ח פילורי B128 7.13 (חטיבתיפאי+/T4SS+)12 ו- X47-2AL (חטיבתיפאי–/T4SS−)13. ה חתול זיהומים, המתח CS1 ("החתול ספירלה 1", חטיבתיפאי–/T4SS−) נמצא בשימוש בדרך כלל14.
במסמך זה, אנו מספקים פרוטוקול המתאר את הכנת הליקובקטר inocula ויוו זיהום, נוהל gavage intragastric של עכברים, כמו גם שיטות עיבוד רקמות לחקר שינויים histopathological בבטן. בפרט, מאמר זה יתמקד השיטות היסטולוגית נהגו להמחיש מושבת חיידקים להעריך שינויים histopathological, כולל היווצרות מאלט, רירית קיבה של עכברים נגועים. חלק מהשיטות המתוארות כאן עשוי להיות מותאם לחדר העבודה של פתוגנים במעיים אחרים כגון ס Typhimurium או rodentium ג.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacteriological reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxoid Blood Agar Base No.2</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>CM0271B</td>
			<td>Dissolve in deinonized water prior to sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Defibrinated Horse blood</td>
			<td>Australian Ethical Biologicals</td>
			<td>PDHB100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Brain Heart Infusion Broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>237500</td>
			<td>Dissolve in deinonized water prior to sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CampyGen gas packs</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>CN0035A/CN0025A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute alcohol, 100% Denatured</td>
			<td>ChemSupply</td>
			<td>AL048-20L-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-propanol)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene (sulphur free)</td>
			<td>ChemSupply</td>
			<td>XT003-20L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s Haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>&#160;MH-1L</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin, Aqueous Stain</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>EOCA-1L</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright-Giemsa Stain, modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WG80-2.5L</td>
			<td>Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>11031/5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.00579.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;M8291</td>
			<td>Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39028</td>
			<td>Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Univar (Ajax Fine Chemicals)</td>
			<td>A475-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulphate Heptahydrate</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>MA048-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V2002-1G</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4932-5MU</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim (&#8805;98% HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>Dissolve in 100% (absolute) Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Amresco (Astral Scientific)</td>
			<td>E437-100MG</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacitracin from Bacillus licheniformis</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0125</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naladixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N8878</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyflurane (Pentrhox)</td>
			<td>Medical Developments International</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Paraplast Plus, Leica Biosystems</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxoid Anaerobic Jars</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HP0011/HP0031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAN Pasteur Pipettes</td>
			<td>Interpath Services</td>
			<td>200CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23g precision glide needle</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>301805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis, VWR</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portex fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>800/100/200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic feeding catheters</td>
			<td>Instech&#160; Laboratories</td>
			<td>FTP20-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml tuberculin luer slip disposable syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z317314</td>
			<td>Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACs Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M Tubes (orange cap)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>30-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic loop</td>
			<td>LabServ</td>
			<td>LBSLP7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6</td>
			<td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td>
			<td>4124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek III Uni-Casette System</td>
			<td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td>
			<td>4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome, Leica RM2235</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged SuperFrost Plus glass slides</td>
			<td>Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4951PLUS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse models of helicobacter infection and gastric pathologies

הליקובקטר פילורי הוא. חיידק קיבה נוכח חצי מהאוכלוסייה הכללית, היא הגורם המשמעותי התחלואה והתמותה בבני אדם. מספר מודלים העכבר של זיהום הליקובקטר בקיבה פותחו כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים הסלולר לפיה ח פילורי חיידקים ליישב את הבטן של בני-אדם כפונדקאים, לגרום למחלות. במסמך זה, אנו מתארים פרוטוקולים: 1) להתכונן המתלים חיידקי הזיהום ויוו של עכברים ויה intragastric gavage; 2) לקבוע את רמות מושבת חיידקים ברקמות קיבה העכבר, על ידי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) וספירת קיימא; ו 3) להעריך שינויים פתולוגיים, מאת היסטולוגיה. כדי ליצור Helicobacter זיהום בעכברים, חיות (SPF) ללא פתוגן מסוים קודם מחוסנים עם המתלים (מכיל ≥ 105 המושבה יוצרי יחידות, CFUs) של העכבר-להמדינות זני גם הליקובקטר פילורי או אחרים spp. הליקובקטר בקיבה של חיות, כגון הליקובקטר חתול. -זיהום שלאחר זמן מתאים-נקודות, קיבות טוחנות, גזור sagittally לתוך רקמות שווה שני קטעים, אחד המרכיבים את האזורים antrum וגוף. אחד של קטעים אלה משמש לאחר מכן או ספירה מעשית או הפקת דנ א, ואילו השני הוא נתון לעיבוד היסטולוגית. מושבת חיידקים ושינויים histopathological בבטן עשויים להידרש באופן שגרתי בסעיפים רקמת קיבה מוכתם Warthin-כוכביים, Giemsa או Haematoxylin, אאוזין (H & E) כתמים, לפי הצורך. ניתוחים נוספים אימונולוגי עשוי להתבצע גם על ידי אימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence על העכבר רקמת קיבה חלקים. הפרוטוקולים המתוארים להלן נועדו במיוחד כדי לאפשר את ההערכה בעכברים של פתולוגיות קיבה דמוי אלה הקשורות האדם ח פילורי מחלות, כולל דלקת, ניוון בלוטת הלימפה זקיק היווצרות. Inoculum הכנה והפרוטוקולים intragastric gavage עשוי גם להיות מותאם ללמוד בפתוגנזה של אחרים המעית האנושי גורמי מחלה לישוב עכברים, כגון סלמונלה Typhimurium או Citrobacter rodentium.

פרוטוקול זה מתאר שיטת gavage דרך הפה כדי להשיג זיהום intragastric עם ה פילורי או ה חתול עכבר מאתר דגמים (איור 1). לאחר המתת חסד, קיבות הוסר, שקל, מחולק ל 2 חצאים שווים הכוללת את antrum, הגוף ואזורים שאינם הבלוטות של רקמות הקיבה (איור 2). האזור הלא-הבלוטות מוסר לפני ב?...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies at JoVE.com

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

העכבר מודלים של זיהום הליקובקטר , פתולוגיות קיבה

עכברים מייצגים מודל לא בפז ויוו ללמוד זיהום מחלות הנגרמות על ידי מיקרואורגניזמים במערכת העיכול. כאן, אנו מתארים את השיטות המשמשות ללימוד מושבת חיידקים ושינויים histopathological העכבר מודלים של הליקובקטר פילורי-הקשורים למחלה.

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום הגסטרואנטרולוגיה על ההשפעה של חברי המיקרוביוטה, במיוחד אלה של הסוג הליקובקטר, על דלקת וסרטן. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת את המחקר של זיהום הליקובקטר והשפעתו על הבטן בתנאים פיזיולוגיים. ההשלכות של טכניקה זו להרחיב לקראת פיתוח של טיפולים למניעה או חיסול של זיהום הליקובקטר או ההשלכות שלה, כולל אנטיביוטיקה, תרופות, או חיסונים.שיטות אלה מספקות תובנה ספציפית לפתוגנזה של זיהום הליקובקטר. עם זאת, כמה טכניקות עשוי להיות מותאם לחקר פתוגנים אחרים במערכת העיכול. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו עם הכנת אינוקולום חיידקי המסוגל ליצור זיהום בעכברים.זה הכרחי כי המבודדים הליקובקטר ידועים עכבר קולוניזציה זנים שלא עברו תת תרבות נרחבת במבחנה. בנוסף, יש לתעד את מספר תת-התת-ת-תים במבחנה עבור זנים אלה. הוסיפו מתלים חיידקיים לצינורות פוליסטירן 15 מיליליטר, ולהשתמש בלולאת פלסטיק כדי להעביר טיפה אחת של 10 עד 20 מיקרוליטר מכל תרבות לשקופיות מיקרוסקופ זכוכית בודדות.לאחר מכן, להעריך את הכדאיות ואת תנועתיות של החיידקים תחת מיקרוסקופיה ניגודיות פאזה בהגדלה 100 פעמים. השתמשו באנוקולה H.pylori רק אם לרוב החיידקים יש צורת מרה. H.felis אינוקולה צריך בעיקר להכיל חיידקים בצורת סם.ולטעון את האנוקולה למזרקים בודדים, חד פעמיים, מיליליטר. לצייד כל מזרק עם מחט 23-מד, ולהשתמש בסרט פרפין פלסטיק לחבר קטטר פוליאתילן חד פעמי לכל מחט. לאחר מכן, רסן ידנית עכבר בן שישה עד שמונה שבועות ללא פתוגן ועכבר נטול הליקובקטר על ידי עורף הצוואר והזנב, והכנס קטטר אחד למרכז הלסת הפתוחה.מדריך קטטר caudal לכיוון הוושט, הארכת הצוואר של העכבר כדי לאפשר קלות גישה לקיבה דרך הוושט הרחק קנה הנשימה עד רוב או כל הקטטר כבר לא נראה והתנגדות מורגשת. לאחר מכן, לספק לפחות פעם אחת 10 לחיידקים החמישי כדי להבטיח קולוניזציה אופטימלית ופתולוגיה של המחלה. בסוף הניסוי, השתמש במספריים דקים ומעוקלים כדי לפתוח את חלל הבטן לכרסום בבטן.חותכים את הבטן לאורך העקמומיות הגדולה יותר, ושוטפים בעדינות את האיבר פעמיים בצינור אחד של 50 מיליליטר של PBS טרי לכל שטיפה כדי להסיר כל מזון שיורית. לאחר הכביסה השנייה, מניחים את הרקמה לתוך תבשיל פטרי מפלסטיק מוכתם באורך שישה ס"מ כדי לתעד את המשקל הרטוב. לאחר שיטוח הקיבה, חצי את הדגימה בשטויות לשני שברי רקמות שווים המרכיבים את אזורי הנמלים, הגוף והפורטנום הלא-בלוטות.הסר את האזור שאינו הבלוטות, ולשקול מחצית מכל קיבה לפני אחסון פיסת הרקמה בתתפיסה המתאימה לניתוח במורד הזרם המתוכנן. מוסיפים את החצי השני של רקמת הקיבה לצינור חרוט 15 מיליליטר המכיל 10% פורמלין, משטח את הרקמות נגד הצדדים העליונים של הצינורות לאחר 10 שניות. כאשר הרקמות הפכו מודבקות על קירות הצינור, לטבול מחדש את הדגימות בפורמלין לפחות 24 שעות.כדי לספור את מספר H.pylori קיימא בקיבה לאחר זיהום, הומוגניזציה דגימות הקיבה המאוחסנים BHI, ולבצע דילול סדרתי כפול של הומוגנטים קיבה וכתוצאה מכך מרק טרי, סטרילי. לחלק אגר דם סוס מיובש מראש, או HBA, צלחות בתוספת אנטיביוטיקה נוספת לשלושה או ארבעה קטעים, ו, באמצעות התאמה של טכניקת מיילס ומיסה, להוסיף 10 עד 100 microliters של כל דילול הומוגני בקיבה על קטע של כל צלחת אגר. מורחים את ההומוגנים בלולאות פלסטיק סטריליות ומאפשרים לצלחות להתייבש.לאחר מכן, מניחים את הצלחות במצב הפוך בצנצנות גז אנארובה המכילות צלחת פטרי של מים וחבילת גז. לאחר מכן, הדגירה את הצנצנות ב 37 מעלות צלזיוס במשך ארבעה עד שבעה ימים. כאשר ניתן לצפות במושבות, למנות את המקטעים המכילים בין 10 ל 100 מושבות מבודדות.לאחר המתת חסד, הקיבה נקצרת מבעלי החיים ומשקלו. האזור הלא בלוטות מוסר, והקיבה מחולקת לשני חצאים שווים המרכיבים את הנמלים והגוף. קולוניזציה מוצלחת מאושרת בדרך כלל על ידי ביצוע ספירה בת קיימא וספירה עוקבת של מושבות בודדות מהומוגנטים קיבה מפוספס על לוחות HBA.שים לב כי נוכחות של חיידקים מזהמים מן microbiota קיבה העכבר או מספר גדול של מושבות H.pylori יכול לסבך את ספירת H.pylori CFUs. לחלופין, PCR ניתן להשתמש כדי לאמת זיהום באמצעות פריימרים מאומתים ספציפיים מכוונים לאזור זוג 325 בסיס של H.felis ו H.pylori ureB גנים. בניסוי מייצג זה, עכברים מסוג פראי C57 Black-6 הראו סימנים מתונים של דלקת, כולל היפרפלזיה ניוון בלוטה בשישה חודשים לאחר ההדבקה עם H.felis, כמו גם חדירה תאית של submucosa.דלקת חמורה יותר נצפתה בעכברים נוקאאוט באותו זמן נקודה, עם נוכחות נוספת של זקיקי הלימפה נצפתה בסמיכות חדירות הסלולר. חיידקי H.felis ניתן גם לדמיין בחלקים מוכתמים Giemsa של רקמת קיבה עכבר נגוע. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות כמו PCR כמותי, אימונוהיסטוכימיה או immunofluorescence כדי לענות על שאלות נוספות על סוגי התגובות המארח המושרה במהלך זיהום הליקובקטר.לאחר התפתחותה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום המיקרוביולוגיה וגסטרואנטרולוגיה לחקור את התפקיד הסיבתי של הליקובקטר פילורי במחלות קיבה בבני אדם. לאחר צפייה בסרטון זה, אתה צריך הבנה טובה של איך להדביק עכברים להתרבות עם מיני הליקובקטר וללמוד את הפתולוגיה הקשורה לזיהום. אל תשכח כי זני הליקובקטר המשמשים בפרוטוקול זה הם זיהומיות, ולכן נהלים biosafety סטנדרטי תמיד צריך להיות אחריו תוך כדי עבודה עם חיידקים אלה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

אינדוקציה Transurethral של דלקת בדרכי השתן עכבר

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice

אבחון חיצוני ו Endoparasites בחולדות מעבדה ועכברים

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids כמודל למחלות זיהומיות: התרבות של האדם וOrganoids הקיבה Murine וMicroinjection של הליקובקטר פילורי

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

מנהל Intra-קנה נשימה של<em&gt; אינפלואנזה המופילוס</em&gt; בעכברי מודל לחקר Airway דלקת

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

צעד אחד טיהור זיהוי תכונות חומרים שלילית של<em&gt; הליקובקטר פילורי</em&gt; חלבון נויטרופילים-הפעלת ביתר<em&gt; Coli Escherichia</em&gt; במצב אצווה

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

העכבר ואת האדם-נגזר תרבות ראשי קיבה אפיתל חד שכבתי לצורך המחקר של התחדשות

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Subarachnoidal תוך-גולגולתי, תוואי זיהום עבור חוקרים התפקידים של סטרפטוקוקוס suis Biofilms ב דלקת קרום המוח במודל זיהום של עכברים

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

CRISPR-Cas9 מבוססי הגנום הנדסה ליצירת מודלים Jurkat כתב להידבקות ב- HIV-1 עם אתרים שנבחרו אינטגרציה Proviral

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models

כרונית, חריפה, ו-HIV ההפעלה מופעל מודלים העכבר חיסוני הומניזציה

Humanized NOD/SCID/IL-2 receptor &#947;-chainnull mice recapitulate some features of human immunity, which can be exploited in basic and pre-clinical ...