Name: mouse models of helicobacter infection and gastric pathologies
Uploaded: 2018-10-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies at JoVE.com

Forfatterne ønsker å takke Ms. A. De Paoli og Ms. Georgie Wray-McCann for teknisk assistanse. Forfatterne erkjenner bruk av fasilitetene og teknisk assistanse av Monash Histology plattform, Institutt for anatomi og utviklingsbiologi, Monash University. Laboratoriet er støttet av finansiering fra National Health and Medical Research Council (NHMRC) til RLF (APP1079930, APP1107930). RLF støttes av en Senior Research Fellowship fra NHMRC (APP1079904). KD og MC støttes både av Monash Graduate stipender. KD er også støttet av Centre for medfødt immunitet og smittsomme sykdommer, Hudson Institute medisinsk forskning, mens MC har en internasjonal Postgraduate stipend fra fakultet, sykepleie og helsefag, Monash University. Forskning ved Hudson Institute for Medical Research støttes av den viktorianske regjeringen operative infrastruktur støtteprogrammet.

1. vekst og utarbeidelsen av bakteriell Inocula
<ol><li>Tine glyserol aksjer H. pylori eller H. felis15 -80 ° C og subkultur på hest blod agar (HBA) plater består av: blod Agar Base No.2 (se Tabell for materiale); en modifisert "Skirrows antibiotika selektiv supplement" (bestående av vancomycin, 10 μg/mL, polymyxin B, 25 ng/mL, trimethoprim, 5 µg/mL, amfotericin B, 2,5 μg/mL); og 5 – 10% (v/v) hesten blod15,<sup class...

<ol>
	<li>Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Helicobacter+pylori+infection+and+public+health+implications.">Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications.</a> Helicobacter. 16, 1-9 (2011).</li><li>Montecucco, C., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+dangerously:+how+Helicobacter+pylori+survives+in+the+human+stomach.">Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).</li><li>Akopyants, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+the+cag+pathogenicity+island+of+Helicobacter+pylori.">Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori.</a> Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).</li><li>Censini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cag,+a+pathogenicity+island+of+Helicobacter+pylori,+encodes+type+I-specific+and+disease-associated+virulence+factors.">cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).</li><li>Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+innate+immunity+in+Helicobacter+pylori-induced+gastric+malignancy.">Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).</li><li>O'Rourke, J. L., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Helicobacter+pylori+infection+and+disease.">Animal models of Helicobacter pylori infection and disease.</a> Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).</li><li>Sakagami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrophic+gastric+changes+in+both+Helicobacter+felis+and+Helicobacter+pylori+infected+mice+are+host+dependent+and+separate+from+antral+gastritis.">Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis.</a> Gut. 39 (5), 639-648 (1996).</li><li>Correa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+and+gastric+carcinogenesis.">Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).</li><li>Enno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALToma-like+lesions+in+the+murine+gastric+mucosa+after+long-term+infection+with+Helicobacter+felis.+A+mouse+model+of+Helicobacter+pylori-induced+gastric+lymphoma.">MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma.</a> The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+mouse+model+of+Helicobacter+pylori+infection:+introducing+the+Sydney+strain.">A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain.</a> Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).</li><li>Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+colonizing+Helicobacter+pylori+strain+SS1+may+lack+a+functional+cag+pathogenicity+island.">The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island.</a> Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).</li><li>Israel, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+strain-specific+differences+in+genetic+content,+identified+by+microarray,+influence+host+inflammatory+responses.">Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).</li><li>Fox, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori-induced+gastritis+in+the+domestic+cat.">Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat.</a> Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).</li><li>Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+spiral-shaped+bacterium+from+the+cat+stomach.">Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach.</a> Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).</li><li>Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+Helicobacter-induced+gastric+cancer:+use+of+cocarcinogens.">Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens.</a> Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).</li><li>Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+of+specific-pathogen-free+mice+to+chronic+Helicobacter+pylori+(strain+SS1)+infection.">Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection.</a> Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).</li><li>Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+maintenance+of+Helicobacter+species.">Laboratory maintenance of Helicobacter species.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+host+genetic+background+on+immune+responses+to+Helicobacter+pylori+infection+and+therapeutic+vaccine+efficacy.">Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).</li><li>Nedrud, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+genetic+influence+on+the+innate+inflammatory+response+to+helicobacter+infection+of+the+gastric+mucosa.">Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+felis+eradication+restores+normal+architecture+and+inhibits+gastric+cancer+progression+in+C57BL/6+mice.">Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice.</a> Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).</li><li>Ferrero, R. L., Labigne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+expression+and+sequencing+of+Helicobacter+felis+urease+genes.">Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes.</a> Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).</li><li>Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Helicobacter+pylori+in+various+liquid+and+plating+media.">Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media.</a> Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).</li><li>Uotani, T., Graham, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+Helicobacter+pylori+using+the+rapid+urease+test.">Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test.</a> Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).</li><li>Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+murine+helicobacters+by+PCR+and+restriction+enzyme+analyses.">Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses.</a> Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).</li><li>Chaouche-Drider, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+commensal+Helicobacter+sp.+of+the+rodent+intestinal+flora+activates+TLR2+and+NOD1+responses+in+epithelial+cells.">A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells.</a> PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).</li><li>Fox, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+bilis:+bacterial+provocateur+orchestrates+host+immune+responses+to+commensal+flora+in+a+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease.</a> Gut. 56 (7), 898-900 (2007).</li><li>McGee, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+enhances+Helicobacter+pylori+resistance+to+antibiotics+and+LL-37.">Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).</li><li>Viala, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nod1+responds+to+peptidoglycan+delivered+by+the+Helicobacter+pylori+cag+pathogenicity+island.">Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island.</a> Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+PCR+method+to+detect+Helicobacter+felis+in+a+conventional+mouse+model.">A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).</li><li>Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Helicobacter+felis+colonization+in+male+129/Sv+mice+fails+to+suppress+gastritis.">Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis.</a> Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).</li><li>Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbred+mice+with+long-term+Helicobacter+felis+infection+develop+both+gastric+lymphoid+tissue+and+glandular+hyperplastic+lesions.">Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions.</a> The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).</li></ol>

Denne protokollen beskriver bruken av en i vivo musemodell for Helicobacter infeksjon. Kritisk trinnene av fremgangsmåten er den: 1) utarbeidelse av Helicobacter inocula som inneholder levedyktig og motile bakterier; 2) levering av passende antallet bakterier til musen via intragastric gavage; 3) oppdagelsen av bakteriell infeksjon av kolonien teller og/eller PCR; og 4) behandling av mage vev å aktivere vurdering av histopatologi i infisert mager. Ytterligere forslag til endringer, feilsøkin...

Helicobacter pylori er en spiral-formet, Gram-negative, menneskelige mage patogen i alle befolkninger over hele verden, med infeksjon priser i utviklingsland anslått til i 80%1. Selv om de fleste H. pylori-infiserte individer er asymptomatisk, noen utvikler mer alvorlige sykdommer, mellom magesår magekreft2. H. pylori-tilknyttede kreft er generelt preget ved ondartet endringer i epitelceller (GECs) eller dannelsen av ekstra knutepunktet lymfoid vev i magen, resulterer i mage adenocarcinoma eller mucosa-assosiert lymfoid vev (MALT) lymfom, henholdsvis. H. pylori er svært tilpasset for å overleve i den harde nisje i magen av ulike virulens faktorer og mekanismer tilrettelegge sin tilslutning, vekst og metabolisme i denne nisje. Spesielt har virulente stammer av H. pylori 40 kb cag virusets Island (cagPAI) som koder ca 30 gener kreves for produksjonen av en Type 4 sekresjon system (T4SS)3,4 . CAG PAI-positive H. pylori stammer er forbundet med induksjon av høyere nivåer av kronisk betennelse i verten, som har vært innblandet som en viktig forløper mage adenocarcinoma5.
I vivo dyr modeller, spesielt mus, har vært svært informativ ved å tillate forskere å undersøke den relative bidrag av verten, bakteriell og miljømessige faktorer på H. pylori infeksjon og sykdom resultatet6. Studier har tidligere vist som langvarig H. pylori infeksjon av mus på C57BL/6 genetisk bakgrunn resultatene i utviklingen av kronisk gastritt og kjertel atrofi, begge kjennetegnene av H. pylori infeksjon7. Videre har smitte med relaterte feline/hjørnetann bakteriell arter, H. felis, blitt vist å skape MALT i mus med lignende patologi og sykdomsprogresjon sett i menneskelig MALT lymfom8,9. De mest brukte H. pylori isolere i musen kolonisering studier er "Sydney belastningen 1" (SS1) belastning10, som er cagPAI+ men har en ikke-fungerende T4SS (T4SS−)11. Andre brukte stammer inkluderer H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 og X47-2AL (cagPAI-/T4SS−)13. For H. felis infeksjoner, belastningen CS1 ("Cat Spiral 1" cagPAI-/T4SS−) er normalt brukt14.
Her gir vi en protokoll som beskriver utarbeidelse av Helicobacter inocula i vivo infisert, prosedyren for intragastric gavage av mus og metoder for behandling av vev for å studere histopathological endringer i magen. Spesielt vil denne artikkelen fokusere på histologiske metodene som brukes til å visualisere bakteriell kolonisering og vurdere histopathological endringer, inkludert MALT formasjon, i mage mucosa i infiserte mus. Noen av metodene som er beskrevet her kan tilpasses til studiet av andre gut patogener som S. Typhimurium eller C. rodentium.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacteriological reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxoid Blood Agar Base No.2</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>CM0271B</td>
			<td>Dissolve in deinonized water prior to sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Defibrinated Horse blood</td>
			<td>Australian Ethical Biologicals</td>
			<td>PDHB100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Brain Heart Infusion Broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>237500</td>
			<td>Dissolve in deinonized water prior to sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CampyGen gas packs</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>CN0035A/CN0025A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute alcohol, 100% Denatured</td>
			<td>ChemSupply</td>
			<td>AL048-20L-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-propanol)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene (sulphur free)</td>
			<td>ChemSupply</td>
			<td>XT003-20L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s Haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>&#160;MH-1L</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin, Aqueous Stain</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>EOCA-1L</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright-Giemsa Stain, modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WG80-2.5L</td>
			<td>Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>11031/5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.00579.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;M8291</td>
			<td>Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39028</td>
			<td>Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Univar (Ajax Fine Chemicals)</td>
			<td>A475-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulphate Heptahydrate</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>MA048-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V2002-1G</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4932-5MU</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim (&#8805;98% HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>Dissolve in 100% (absolute) Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Amresco (Astral Scientific)</td>
			<td>E437-100MG</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacitracin from Bacillus licheniformis</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0125</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naladixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N8878</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyflurane (Pentrhox)</td>
			<td>Medical Developments International</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Paraplast Plus, Leica Biosystems</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxoid Anaerobic Jars</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HP0011/HP0031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAN Pasteur Pipettes</td>
			<td>Interpath Services</td>
			<td>200CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23g precision glide needle</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>301805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis, VWR</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portex fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>800/100/200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic feeding catheters</td>
			<td>Instech&#160; Laboratories</td>
			<td>FTP20-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml tuberculin luer slip disposable syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z317314</td>
			<td>Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACs Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M Tubes (orange cap)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>30-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic loop</td>
			<td>LabServ</td>
			<td>LBSLP7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6</td>
			<td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td>
			<td>4124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek III Uni-Casette System</td>
			<td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td>
			<td>4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome, Leica RM2235</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged SuperFrost Plus glass slides</td>
			<td>Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4951PLUS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse models of helicobacter infection and gastric pathologies

Helicobacter pylori er en mage patogen som finnes i halvparten av den globale befolkningen og er en vesentlig årsak til sykelighet og dødelighet hos mennesker. Flere musen modeller av mage Helicobacter infeksjon er utviklet for å studere molekylære og cellulære mekanismer der H. pylori bakterien kolonisere magen av menneskelige verter og forårsake sykdom. Her beskriver vi protokoller til: 1) forberede bakteriell suspensjoner i vivo infeksjon av mus via intragastric gavage; 2) bestemme bakteriell kolonisering nivåer i musen mage vev, av polymerasekjedereaksjons (PCR) og levedyktig teller; og 3) vurdere patologiske forandringer, ved histology. For å etablere Helicobacteh infeksjon i mus, bestemte patogen-fri (SPF) dyrene er først inokulert med suspensjoner (inneholder ≥105 colony-forming enheter, CFUs) av mus-kolonisere stammer av enten Helicobacter pylori eller andre gastrisk Helicobacter spp. fra dyr, som Helicobacter felis. På riktig tidspunkt etter infeksjon, mager forbrukeravgift og dissekert sagittally i to like vev fragmenter, hver bestående av regionene antrum og kroppen. En av disse fragmentene brukes deretter for levedyktig teller eller DNA utvinning, mens den andre er utsatt for histologiske behandling. Bakteriell kolonisering og histopathological endringer i magen kan vurderes rutinemessig i mage vev delene med Warthin-stjernehimmelen, Giemsa eller Haematoxylin og Eosin (H & E) flekker, etter behov. Ekstra immunologiske analyser kan også gjennomføres av immunohistochemistry eller immunofluorescence på musen mage vev deler. Protokollene beskrevet nedenfor er spesielt designet for å aktivere vurdering i mus mage patologi som ligner de i menneske-relaterte H. pylori sykdommer, inkludert betennelse, kjertel atrofi og lymfoide hårsekken formasjon. Inoculum forberedelse og intragastric gavage protokoller kan også tilpasses til å studere patogenesen av andre enteric human patogener som koloniser mus, for eksempel Salmonella Typhimurium eller Citrobacter rodentium.

Denne protokollen beskriver en muntlig gavage teknikk for å oppnå intragastric infeksjon med H. pylori eller H. felis i murine musen modeller (figur 1). Etter dødshjelp, mager fjernes, veid og delt inn i 2 like halvdeler bestående av antrum, kropp og ikke-kjertel regioner av mage vev (figur 2). Ikke-kjertel regionen er fjernet før du utfører noen analyser.
Vellykket kolonisering av dyr er vanligvis bekreftet ve...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies at JoVE.com

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Musen modeller av Helicobacter infeksjon og mage patologi

Mus representerer en uvurderlig i vivo modell å studere infeksjoner og sykdommer forårsaket av gastrointestinal mikroorganismer. Her beskriver vi metoder brukt for å studere bakteriell kolonisering og histopathological endringer i musen modeller av Helicobacter pylori-relatert sykdom.

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i gastroenterologifeltet om virkningen av medlemmer av mikrobiota, spesielt de av slekten Helicobacter, på betennelse og kreft. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater studiet av Helicobacter infeksjon og dens innvirkning på magen under fysiologiske forhold. Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot utvikling av terapier for forebygging eller eliminering av Helicobacter infeksjon eller dens konsekvenser, inkludert antibiotika, narkotika, eller vaksiner.Disse metodene gir innsikt som er spesifikk for patogenesen av Helicobacter-infeksjon. Imidlertid kan flere av teknikkene tilpasses studiet av andre gastrointestinale patogener. Generelt vil personer som er nye på denne metoden, slite med utarbeidelsen av et bakteriell inokutum som er i stand til å etablere en infeksjon hos mus.Det er viktig at Helicobacter isolater er kjente muskolonisering stammer som ikke har gjennomgått omfattende subkultur in vitro. I tillegg bør det registreres antall in vitro-subkulturer for disse stammene. Legg til bakterielle suspensjoner til 15-milliliter polystyrenrør, og bruk en plastsløyfe til å overføre en 10-til 20-mikroliterdråpe fra hver kultur til individuelle glassmikroskopsklier.Deretter vurderer du bakterienes levedyktighet og motilitet under fasekontrastmikroskopi ved en 100 ganger forstørrelse. Bruk bare H.pylori inokucula hvis de fleste bakteriene har en bacillary form. H.felis inocula bør primært inneholde spiralformede bakterier.Og legg inoculaen i individuelle, disponible, enmillersprøyter. Utstyr hver sprøyte med en 23-gauge nål, og bruk plast parafin film for å feste en engangs polyetylen kateter til hver nål. Deretter begrenser du manuelt en seks til åtte uker gammel spesifikk patogenfri og Helicobacter-fri mus ved scruff i nakken og halen, og sett ett kateter inn i midten av den åpne kjeven.Guide kateteret i en caudal mot spiserøret, utvide halsen på musen for å tillate enkel tilgang til magen gjennom spiserøret og bort fra luftrøret til de fleste eller hele kateteret er ikke lenger synlig og en motstand er følt. Deretter leverer minst en ganger 10 til de femte bakteriene for å sikre en optimal kolonisering og sykdomspatologi. På slutten av forsøket, bruk fin, buet saks for å åpne bukhulen for eksisjon i magen.Skjær magen langs større krumning, og vask forsiktig orgelet to ganger i ett 50-milliliter rør med fersk PBS per vask for å fjerne restmat. Etter den andre vasken, legg vevet i en tjærete, seks centimeter, plast Petriskål for å registrere den våte vekten. Etter å ha flatet ut magen, bisect prøven sagittally i to like vev fragmenter bestående av antrum, kropp, og ikke-kjertel forestomach regioner.Fjern ikke-kjertelområdet, og veie halvparten av hver mage før du lagrer vevet i riktig løsning for den planlagte nedstrøms analysen. Tilsett den andre halvdelen av magevevet til et 15-milliliter konisk rør som inneholder 10% formalin, flater vevet mot de øverste sidene av rørene etter 10 sekunder. Når vevet har blitt festet til rørveggene, senk prøvene i formalinen igjen i minst 24 timer.For å telle antall levedyktige H.pylori i magen etter infeksjonen, homogenisere mageprøver lagret i BHI, og utføre dupliserte seriell fortynning av de resulterende gastriske homogenater i frisk, steril kjøttkraft. Del pre-tørket hest blod agar, eller HBA, plater supplert med ekstra antibiotika i tre eller fire segmenter, og ved hjelp av en tilpasning av Miles og Misra teknikk, legge 10 til 100 mikroliter av hver mage homogenere fortynning på et segment av hver agar plate. Spre homogenatene med sterile plastløkker, og la platene tørke.Deretter plasserer platene i en invertert posisjon i anaerobegasskrukker som inneholder en petriskål med vann og en gasspakke. Deretter inkubere krukkene ved 37 grader Celsius i fire til syv dager. Når kolonier kan observeres, nummerer segmentene som inneholder mellom 10 og 100 isolerte kolonier.Etter eutanasi høstes magen fra dyrene og veies. Den ikke-glandulære regionen fjernes, og magen er delt inn i to like halvdeler bestående av antrum og kropp. Vellykket kolonisering er vanligvis bekreftet ved å utføre levedyktig telling og påfølgende opplisting av individuelle kolonier fra gastriske homogenater stripete på HBA plater.Merk at tilstedeværelsen av forurensende bakterier fra musen gastrisk mikrobiota eller et stort antall H.pylori kolonier kan komplisere opplisting av H.pylori CFUer. Alternativt kan PCR brukes til å verifisere infeksjon ved hjelp av spesifikke validerte primere rettet mot en 325-base parregion av H.felis og H.pylori ureB gener. I dette representative eksperimentet viste wild-type C57 Black-6 mus moderate tegn på betennelse, inkludert hyperplasi og kjertelatrofi ved seks måneder etter infeksjon med H.felis, samt cellulær infiltrasjon av submucosa.Mer alvorlig betennelse observeres i knockoutmus samtidig, med ytterligere tilstedeværelse av lymfoide follikler observert i nærheten av cellulære infiltrater. H.felis bakterier kan også visualiseres i Giemsa-farget deler av infisert mus magevev. Etter denne prosedyren kan andre metoder som kvantitativ PCR, immunohistochemistry eller immunofluorescens utføres for å svare på flere spørsmål om hvilke typer vertsresponser som induseres under Helicobacter-infeksjon.Etter utviklingen banet denne teknikken vei for forskere innen mikrobiologi og gastroenterologi for å utforske den forårsakende rollen til Helicobacter pylori hos magesykdom hos mennesker. Etter å ha sett denne videoen, bør du ha en god forståelse av hvordan du reaktivt infiserer mus med Helicobacter-arter og for å studere patologien forbundet med infeksjonen. Ikke glem at Helicobacter-stammene som brukes i denne protokollen er smittsomme, og derfor bør standard biosikkerhetsprosedyrer alltid følges mens du arbeider med disse bakteriene.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administrering av rekombinant influensavaksiner i Chimerisk musemodeller for å studere slimhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids som modell for Infectious Diseases: Culture of Human og Murine Mage Organoids og Mikroinjeksjon av Helicobacter pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administrasjon av<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; I musemodeller for å studere Airway betennelse

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Ett-trinns Negativ kromatografiske rensing i<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofilaktiverende Protein overuttrykkes i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; I batch-modus

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Mus - og menneske-avledet primære mage Epithelial Monolayer kultur for studier av gjenfødelse

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Intrakranielt Subarachnoidal ruten infeksjon for undersøker rollene Streptococcus suis biofilm i hjernehinnebetennelse i en mus infeksjon modell

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

CRISPR-Cas9-baserte genomet Engineering generere Jurkat Reporter modeller for HIV-1 smitte med valgte Proviral integrasjon nettsteder

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models

Kronisk, akutt, og reaktivert HIV infeksjon i Humanisert Immunodeficient Mouse modeller

Humanized NOD/SCID/IL-2 receptor &#947;-chainnull mice recapitulate some features of human immunity, which can be exploited in basic and pre-clinical ...