Name: mouse models of helicobacter infection and gastric pathologies
Uploaded: 2018-10-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies at JoVE.com

Los autores desean agradecer a la Sra. A. De Paoli y la Sra. Georgie Wray-McCann para asistencia técnica. Los autores reconocen el uso de las instalaciones y asistencia técnica de Monash plataforma de histología, Departamento de anatomía y Biología del desarrollo, Universidad de Monash. El laboratorio es apoyado por el financiamiento de la salud nacional y el Consejo de investigación médica (NHMRC) a RLF (APP1079930, APP1107930). RLF es apoyado por una beca de investigación Senior de la NHMRC (APP1079904). KD y MC son apoyados por becas de postgrado de Monash. KD también es apoyado por el centro para la inmunidad innata y la infecciosa enfermedades, del Instituto Hudson de investigación médica, mientras que MC tiene una beca de Postgrado Internacional de la Facultad de medicina, enfermería y Ciencias de la salud, Universidad de Monash. Investigación en el Instituto de investigación médica de Hudson es apoyado por el programa de apoyo a infraestructura operacional del gobierno victoriano.

1. crecimiento y preparación de inóculos bacterianos
<ol><li>Descongelar las existencias de glicerol de H. pylori o H. felis15 de-80 ° C y el subcultivo en placas de agar sangre (HBA) de caballo compuesto por: Base de Agar sangre No.2 (véase Tabla de materiales); la "Suplemento selectivo antibiótico de Skirrow" (compuesto por vancomicina, 10 μg/mL; polimixina B, 25 ng/mL, trimetoprim, 5 μg/mL, anfotericina B, 2.5 μg/mL); y 5 a 10% (v/v) caballo sangre<s...

<ol>
	<li>Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Helicobacter+pylori+infection+and+public+health+implications.">Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications.</a> Helicobacter. 16, 1-9 (2011).</li><li>Montecucco, C., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+dangerously:+how+Helicobacter+pylori+survives+in+the+human+stomach.">Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).</li><li>Akopyants, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+the+cag+pathogenicity+island+of+Helicobacter+pylori.">Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori.</a> Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).</li><li>Censini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cag,+a+pathogenicity+island+of+Helicobacter+pylori,+encodes+type+I-specific+and+disease-associated+virulence+factors.">cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).</li><li>Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. 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A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma.</a> The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+mouse+model+of+Helicobacter+pylori+infection:+introducing+the+Sydney+strain.">A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain.</a> Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).</li><li>Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+colonizing+Helicobacter+pylori+strain+SS1+may+lack+a+functional+cag+pathogenicity+island.">The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island.</a> Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).</li><li>Israel, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+strain-specific+differences+in+genetic+content,+identified+by+microarray,+influence+host+inflammatory+responses.">Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).</li><li>Fox, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori-induced+gastritis+in+the+domestic+cat.">Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat.</a> Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).</li><li>Lee, A., Hazell, S. 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M., Huerre, M., Labigne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+of+specific-pathogen-free+mice+to+chronic+Helicobacter+pylori+(strain+SS1)+infection.">Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection.</a> Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).</li><li>Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+maintenance+of+Helicobacter+species.">Laboratory maintenance of Helicobacter species.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+host+genetic+background+on+immune+responses+to+Helicobacter+pylori+infection+and+therapeutic+vaccine+efficacy.">Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).</li><li>Nedrud, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+genetic+influence+on+the+innate+inflammatory+response+to+helicobacter+infection+of+the+gastric+mucosa.">Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+felis+eradication+restores+normal+architecture+and+inhibits+gastric+cancer+progression+in+C57BL/6+mice.">Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice.</a> Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).</li><li>Ferrero, R. L., Labigne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+expression+and+sequencing+of+Helicobacter+felis+urease+genes.">Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes.</a> Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).</li><li>Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Helicobacter+pylori+in+various+liquid+and+plating+media.">Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media.</a> Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).</li><li>Uotani, T., Graham, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+Helicobacter+pylori+using+the+rapid+urease+test.">Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test.</a> Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).</li><li>Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+murine+helicobacters+by+PCR+and+restriction+enzyme+analyses.">Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses.</a> Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).</li><li>Chaouche-Drider, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+commensal+Helicobacter+sp.+of+the+rodent+intestinal+flora+activates+TLR2+and+NOD1+responses+in+epithelial+cells.">A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells.</a> PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).</li><li>Fox, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+bilis:+bacterial+provocateur+orchestrates+host+immune+responses+to+commensal+flora+in+a+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease.</a> Gut. 56 (7), 898-900 (2007).</li><li>McGee, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+enhances+Helicobacter+pylori+resistance+to+antibiotics+and+LL-37.">Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).</li><li>Viala, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nod1+responds+to+peptidoglycan+delivered+by+the+Helicobacter+pylori+cag+pathogenicity+island.">Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island.</a> Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+PCR+method+to+detect+Helicobacter+felis+in+a+conventional+mouse+model.">A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).</li><li>Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Helicobacter+felis+colonization+in+male+129/Sv+mice+fails+to+suppress+gastritis.">Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis.</a> Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).</li><li>Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbred+mice+with+long-term+Helicobacter+felis+infection+develop+both+gastric+lymphoid+tissue+and+glandular+hyperplastic+lesions.">Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions.</a> The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).</li></ol>

Este protocolo describe el uso de un modelo de ratón en vivo para la infección por Helicobacter . Los pasos críticos del procedimiento son el: 1) preparación de los inóculos de Helicobacter que contiene bacterias viables y móviles; 2) la entrega de los números apropiados de bacterias para el ratón mediante sonda intragástrica; 3) detección de infección bacteriana por recuento de colonias o PCR; y 4) procesamiento de los tejidos gástricos para permitir la evaluación de la histopatol...

Helicobacter pylori es un patógeno gástrico en forma de espiral, Gram-negativo, humano presente en todas las poblaciones en todo el mundo, con tasas de infección en países en desarrollo que se estima en el orden de 80%1. Aunque la mayoría H. pylori-individuos infectados son asintomáticos, algunos desarrollan enfermedades más severas, entre ulceración péptica y cáncer gástrico2. H. pylori-cánceres asociados ampliamente se caracterizan por la formación de tejidos linfoides extra nodales en el estómago, dando como resultado adenocarcinoma gástrico o asociado a mucosa linfoide o cambios malignos en las células epiteliales (GECs) linfoma de tejido (Malta), respectivamente. H. pylori está altamente adaptado para sobrevivir en el nicho ecológico áspero del estómago debido a la presencia de diversos factores de virulencia y mecanismos que facilitan su adherencia, el crecimiento y el metabolismo en este nicho. En particular, las cepas virulentas de H. pylori poseen el 40 kb cag isla de patogenicidad (cagPAI) que codifica aproximadamente 30 genes necesarios para la producción de un tipo 4 secreción sistema (T4SS)3,4 . CAG PAI-positivo las cepas de H. pylori se asociado con la inducción de niveles más altos de inflamación crónica en la hostia, que se ha implicado como un precursor esencial de adenocarcinoma gástrico5.
En vivo los modelos animales, especialmente ratones, han sido altamente informativos por permitiendo a los investigadores a investigar las contribuciones relativas de host, factores bacterianos y ambientales en la infección por H. pylori y enfermedad resultado6. Los estudios han demostrado previamente que prolongada H. pylori infección de ratones en los resultados de genética de C57BL/6 en el desarrollo de gastritis crónica y de las glándulas se atrofian, ambas características distintivas del H. pylori infección7. Además, la infección con la especie bacteriana relacionada canino/felino, H. felis, se ha demostrado para inducir la formación de Malta en ratones con patología similar y progresión de la enfermedad en humanos MALT linfoma8,9. Los más comúnmente utilizados de H. pylori aislado en los estudios de colonización de ratón es la "cepa 1 de Sydney" (SS1) cepa10, cagPAI+ pero una T4SS no funcional (T4SS−)11. Otras cepas usadas incluyen H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 y X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. Para las infecciones de H. felis , la cepa CS1 ("gato espiral 1, cagPAI–/T4SS−) es generalmente usado14.
Aquí proporcionamos un protocolo que describe la preparación de inóculos de Helicobacter infección en vivo , el procedimiento para sonda intragástrica de ratones, así como métodos para el procesamiento de tejidos para el estudio de los cambios histopatológicos en el estómago. En particular, este artículo se centrará en los métodos histológicos utilizados para visualizar la colonización bacteriana y evaluar cambios histopatológicos, incluyendo formación de Malta, en la mucosa gástrica de ratones infectados. Algunos de los métodos aquí descritos se pueden adaptadas al estudio de otros patógenos intestinales como S. Typhimurium o C. rodentium.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacteriological reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxoid Blood Agar Base No.2</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>CM0271B</td>
			<td>Dissolve in deinonized water prior to sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Defibrinated Horse blood</td>
			<td>Australian Ethical Biologicals</td>
			<td>PDHB100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Brain Heart Infusion Broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>237500</td>
			<td>Dissolve in deinonized water prior to sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CampyGen gas packs</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>CN0035A/CN0025A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute alcohol, 100% Denatured</td>
			<td>ChemSupply</td>
			<td>AL048-20L-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-propanol)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene (sulphur free)</td>
			<td>ChemSupply</td>
			<td>XT003-20L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s Haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>&#160;MH-1L</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin, Aqueous Stain</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>EOCA-1L</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright-Giemsa Stain, modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WG80-2.5L</td>
			<td>Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>11031/5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.00579.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;M8291</td>
			<td>Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39028</td>
			<td>Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Univar (Ajax Fine Chemicals)</td>
			<td>A475-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulphate Heptahydrate</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>MA048-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V2002-1G</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4932-5MU</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim (&#8805;98% HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>Dissolve in 100% (absolute) Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Amresco (Astral Scientific)</td>
			<td>E437-100MG</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacitracin from Bacillus licheniformis</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0125</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naladixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N8878</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyflurane (Pentrhox)</td>
			<td>Medical Developments International</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Paraplast Plus, Leica Biosystems</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxoid Anaerobic Jars</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HP0011/HP0031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAN Pasteur Pipettes</td>
			<td>Interpath Services</td>
			<td>200CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23g precision glide needle</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>301805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis, VWR</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portex fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>800/100/200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic feeding catheters</td>
			<td>Instech&#160; Laboratories</td>
			<td>FTP20-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml tuberculin luer slip disposable syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z317314</td>
			<td>Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACs Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M Tubes (orange cap)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>30-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic loop</td>
			<td>LabServ</td>
			<td>LBSLP7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6</td>
			<td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td>
			<td>4124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek III Uni-Casette System</td>
			<td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td>
			<td>4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome, Leica RM2235</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged SuperFrost Plus glass slides</td>
			<td>Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4951PLUS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse models of helicobacter infection and gastric pathologies

Helicobacter pylori es un patógeno gástrico que está presente en la mitad de la población mundial y es una causa significativa de morbilidad y mortalidad en los seres humanos. Varios modelos de ratón de la infección gástrica por Helicobacter se han desarrollado para estudiar los mecanismos moleculares y celulares por el H. pylori bacterias colonizan el estómago de los ejércitos humanos y causan enfermedad. Adjunto, describimos protocolos: 1) preparar suspensiones bacterianas de la infección en vivo de ratones mediante sonda intragástrica; 2) determinar los niveles de colonización bacteriana en el tejido gástrico de ratón, por reacción en cadena de polimerasa (PCR) y recuento de viables; y 3) evaluar los cambios patológicos, por la histología. Establecer Helicobacter infección en ratones, animales libres de patógenos específicos de (SPF) primero son inoculados con suspensiones (contiene ≥ 105 unidades formadoras de colonias, UFC) de cepas de ratón-colonización de o Helicobacter pylori o otros gástrico Helicobacter spp. de animales, tales como Helicobacter felis. En lo puntos apropiados del tiempo post-infección, estómagos son suprimidos y disecados sagittally en dos fragmentos de tejido iguales, cada uno compuesto por las regiones de antro y cuerpo. Uno de estos fragmentos entonces se utiliza para conteo de viables o la extracción de ADN, mientras que el otro se sujeta a procesamiento histológico. Colonización bacteriana y cambios histopatológicos en el estómago pueden evaluarse rutinariamente en secciones de tejido gástrico teñidas con tintes Warthin-Starry de tinción Giemsa o hematoxilina y eosina (H & E), según corresponda. Análisis inmunológicos adicionales también podrán ser efectuados por inmunohistoquímica o inmunofluorescencia en secciones de tejido gástrico de ratón. Los protocolos se describen a continuación están diseñados para posibilitar la evaluación en los ratones de patologías gástricas en humanos relacionadas con H. pylori que se asemejan a las enfermedades, incluyendo inflamación, atrofia de la glándula y la formación del folículo linfoide. La preparación del inóculo y protocolos mediante sonda intragástrica también pueden ser adaptados para el estudio de la patogenia de otros patógenos entéricos humanos que colonizan ratones, tales como Salmonella Typhimurium o Citrobacter rodentium.

Este protocolo describe una técnica oral por sonda nasogástrica para lograr balon infección por H. pylori o H. felis en modelos de ratón murino (figura 1). Después de la eutanasia, estómagos se quitan, pesados y divididos en 2 mitades iguales formada por el antro, cuerpo y regiones no glandulares de los tejidos gástricos (figura 2). La región no glandular es eliminada antes de realizar cualquier análisis.
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Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Modelos de ratón de la infección por Helicobacter y patologías gástricas

Ratones representan un modelo inestimable en vivo para el estudio de la infección y las enfermedades causadas por microorganismos gastrointestinales. Aquí, describimos los métodos utilizados para estudiar la colonización bacteriana y cambios histopatológicos en modelos de ratón de Helicobacter pylori-relacionados con la enfermedad.

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la gastroenterología sobre el impacto de los miembros de la microbiota, específicamente los del género Helicobacter, en la inflamación y el cáncer. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio de la infección por Helicobacter y su impacto en el estómago en condiciones fisiológicas. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el desarrollo de terapias para la prevención o eliminación de la infección por Helicobacter o sus consecuencias, incluyendo antibióticos, medicamentos o vacunas.Estos métodos proporcionan información específica para la patogénesis de la infección por Helicobacter. Sin embargo, varias de las técnicas pueden adaptarse al estudio de otros patógenos gastrointestinales. Generalmente, individuos nuevos en este método lucharán con la preparación de un inóculo bacteriano capaz de establecer una infección en ratones.Es imperativo que los aislados de Helicobacter sean cepas conocidas de colonización de ratón que no han sido sometidas a una extensa subcultura in vitro. Además, debe registrarse el número de subculturas in vitro para estas cepas. Agregue suspensiones bacterianas a tubos de poliestireno de 15 mililitros y utilice un bucle de plástico para transferir una gota de 10 a 20 microlitros de cada cultivo a diapositivas de microscopio de vidrio individuales.A continuación, evalúe la viabilidad y la motilidad de las bacterias bajo microscopía de contraste de fase a un aumento de 100 veces. Utilice únicamente el H.pylori inocula si la mayoría de las bacterias tienen una forma bacilar. H.felis inocula debe contener principalmente bacterias en forma helicoidal.Y cargue la inócula en jeringas individuales, desechables de un mililitro. Equipe cada jeringa con una aguja de calibre 23 y utilice una película de parafina de plástico para fijar un catéter de polietileno desechable a cada aguja. A continuación, retuvo manualmente un ratón libre de patógenos específicos de seis a ocho semanas de edad y sin helicobacter por el escrúpulo del cuello y la cola, e inserte un catéter en el centro de la mandíbula abierta.Guiar el catéter en un caudal hacia el esófago, extendiendo el cuello del ratón para permitir la facilidad de acceso al estómago a través del esófago y lejos de la tráquea hasta que la mayor parte o todo el catéter ya no sea visible y se sienta una resistencia. Luego, entrega al menos una vez 10 a la quinta bacteria para asegurar una colonización óptima y patología de la enfermedad. Al final del experimento, usa tijeras finas y curvas para abrir la cavidad abdominal para la escisión del estómago.Corte el estómago a lo largo de la mayor curvatura, y lave suavemente el órgano dos veces en un tubo de 50 mililitros de PBS fresco por lavado para eliminar cualquier alimento residual. Después del segundo lavado, coloque el tejido en una placa de plástico Petri de seis centímetros para registrar el peso húmedo. Después de aplanar el estómago, bisect la muestra sagittally en dos fragmentos de tejido igual que comprenden el antrum, cuerpo, y regiones de bosque no glandular.Retire la región no glandular y pese la mitad de cada estómago antes de almacenar el trozo de tejido en la solución adecuada para el análisis descendente planificado. Agregue la otra mitad del tejido estomacal a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga 10%formalina, aplanando los tejidos contra los lados superiores de los tubos después de 10 segundos. Cuando los tejidos se hayan colocado en las paredes del tubo, vuelva a sumergir las muestras en el formol durante al menos 24 horas.Para contar el número de H.pylori viables en el estómago después de la infección, homogeneizar muestras de estómago almacenadas en BHI, y realizar diluciones en serie duplicadas de los homogeneatos gástricos resultantes en caldo fresco y estéril. Divida el agar de sangre de caballo preseleccionado, o HBA, las placas suplementadas con antibióticos adicionales en tres o cuatro segmentos, y, utilizando una adaptación de la técnica Miles y Misra, agregue de 10 a 100 microlitros de cada dilución homogeneizada estomacal en un segmento de cada placa de agar. Esparce los homogeneizas con bucles estériles de plástico y deja que las placas se sequen.A continuación, coloque las placas en una posición invertida en frascos de gas anaerobe que contengan un plato de agua Petri y un paquete de gas. Luego, incuba los frascos a 37 grados centígrados durante cuatro a siete días. Cuando se pueden observar colonias, enumere los segmentos que contienen entre 10 y 100 colonias aisladas.Después de la eutanasia, el estómago se cosecha de los animales y se pesa. Se extirpa la región no glandular, y el estómago se divide en dos mitades iguales que comprenden el antrum y el cuerpo. La colonización exitosa se confirma típicamente mediante la realización de un conteo viable y la posterior enumeración de colonias individuales de homogeneizaciones gástricas rayadas en placas de HBA.Tenga en cuenta que la presencia de bacterias contaminantes de la microbiota gástrica del ratón o un gran número de colonias de H.pylori puede complicar la enumeración de las UFC H.pylori. Alternativamente, se puede emplear pcR para verificar la infección utilizando imprimaciones validadas específicas dirigidas a una región de par de 325 bases de los genes H.felis y H.pylori ureB. En este experimento representativo, los ratones C57 Black-6 de tipo salvaje mostraron signos moderados de inflamación, incluyendo hiperplasia y atrofia de la glándula a los seis meses después de la infección con H.felis, así como la infiltración celular de la submucosa.Se observa una inflamación más grave en ratones knockout al mismo tiempo, con la presencia adicional de folículos linfoides observada cerca de los infiltrados celulares. Las bacterias H.felis también se pueden visualizar en secciones teñidas de Giemsa del tejido estomacal del ratón infectado. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la PCR cuantitativa, la inmunohistoquímica o la inmunofluorescencia para responder preguntas adicionales sobre los tipos de respuestas del huésped inducidas durante la infección por Helicobacter.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología y la gastroenterología exploraran el papel causal de Helicobacter pylori en la enfermedad estomacal en los seres humanos. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo infectar reproduciblemente ratones con especies de Helicobacter y para estudiar la patología asociada con la infección. No olvide que las cepas de Helicobacter utilizadas en este protocolo son infecciosas, y por lo tanto los procedimientos estándar de bioseguridad siempre deben seguirse mientras se trabaja con estas bacterias.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Inducción transuretral de infección del tracto urinario ratón

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Investigación

Inmunología e Infección

Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice

El diagnóstico de ecto y endoparásitos en ratas y ratones de laboratorio

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Administración intranasal de vacunas contra la influenza recombinante en modelos de ratón quimérico para el Estudio de la mucosa Inmunidad

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoides como Modelo para Enfermedades Infecciosas: Cultura de Derechos Humanos y organoides estomacales murinos y microinyección de Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Administración intra-traqueal de<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; En modelos de ratón para estudiar las vías respiratorias inflamación

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

De un solo paso negativo Purificación cromatográfica de<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; La proteína activadora de neutrófilos sobreexpresa en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; En modo batch

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Cultura de monocapa epitelial gástrico primario derivadas de ratón y humanos para el estudio de la regeneración

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Ruta de subaracnoideo intracraneal de la infección para investigar funciones de biopelículas del Streptococcus suis en Meningitis en un modelo murino de infección

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

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Ingeniería de genoma CRISPR Cas9 basado en generar modelos de Jurkat reportero para infección por VIH-1 con los sitios seleccionados integración Proviral

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models

Infección crónica, aguda y reactivada por VIH en modelos de ratón inmunodeficientes humanizados

Humanized NOD/SCID/IL-2 receptor &#947;-chainnull mice recapitulate some features of human immunity, which can be exploited in basic and pre-clinical ...