Name: mouse models of helicobacter infection and gastric pathologies
Uploaded: 2018-10-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies at JoVE.com

Författarna vill tacka Ms. A. De Paoli och Ms. Georgie Wray-McCann för tekniskt bistånd. Författarna medger användning av faciliteterna och tekniskt bistånd av Monash histologi plattform, Institutionen för anatomi och utvecklingsbiologi, Monash University. Laboratoriet stöds av medel från den nationella hälso- och medicinsk forskning rådet (NHMRC) till RLF (APP1079930, APP1107930). RLF stöds av en Senior Research Fellowship från NHMRC (APP1079904). KD och MC stöds både av Monash Graduate stipendier. KD stöds också av centrum för medfödd immunitet och infektiös sjukdomar, Hudson Institute av medicinsk forskning, medan MC har en International Postgraduate stipendium från fakulteten, omvårdnad och vårdvetenskap, Monash University. Forskning vid Hudson Institute för medicinsk forskning stöds av den viktorianska regeringens operativa infrastrukturen Support Program.

1. tillväxt och beredning av bakteriella inokulat
<ol><li>Tina glycerol lager av H. pylori eller H. felis15 från-80 ° C och subkultur på häst blodagar (HBA) plattor bestående av: blodagar Base No.2 (se Tabell för material). en modifierad ”Skirrows antibiotika selektiv tillskott” (bestående av vankomycin, 10 μg/mL, polymyxin B, 25 ng/mL; trimetoprim, 5 µg/mL; amfotericin B, 2,5 μg/mL); och 5 – 10% (v/v) häst blod15,...

<ol>
	<li>Goh, K. L., Chan, W. K., Shiota, S., Yamaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+Helicobacter+pylori+infection+and+public+health+implications.">Epidemiology of Helicobacter pylori infection and public health implications.</a> Helicobacter. 16, 1-9 (2011).</li><li>Montecucco, C., Rappuoli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+dangerously:+how+Helicobacter+pylori+survives+in+the+human+stomach.">Living dangerously: how Helicobacter pylori survives in the human stomach.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2 (6), 457-466 (2001).</li><li>Akopyants, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyses+of+the+cag+pathogenicity+island+of+Helicobacter+pylori.">Analyses of the cag pathogenicity island of Helicobacter pylori.</a> Molecular Microbiology. 28 (1), 37-53 (1998).</li><li>Censini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cag,+a+pathogenicity+island+of+Helicobacter+pylori,+encodes+type+I-specific+and+disease-associated+virulence+factors.">cag, a pathogenicity island of Helicobacter pylori, encodes type I-specific and disease-associated virulence factors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (25), 14648-14653 (1996).</li><li>Peek, R. M., Fiske, C., Wilson, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+innate+immunity+in+Helicobacter+pylori-induced+gastric+malignancy.">Role of innate immunity in Helicobacter pylori-induced gastric malignancy.</a> Physiological Reviews. 90 (3), 831-858 (2010).</li><li>O'Rourke, J. L., Lee, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Helicobacter+pylori+infection+and+disease.">Animal models of Helicobacter pylori infection and disease.</a> Microbes and Infection. 5 (8), 741-748 (2003).</li><li>Sakagami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atrophic+gastric+changes+in+both+Helicobacter+felis+and+Helicobacter+pylori+infected+mice+are+host+dependent+and+separate+from+antral+gastritis.">Atrophic gastric changes in both Helicobacter felis and Helicobacter pylori infected mice are host dependent and separate from antral gastritis.</a> Gut. 39 (5), 639-648 (1996).</li><li>Correa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+and+gastric+carcinogenesis.">Helicobacter pylori and gastric carcinogenesis.</a> The American Journal of Surgical Pathology. 19, S37-S43 (1995).</li><li>Enno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALToma-like+lesions+in+the+murine+gastric+mucosa+after+long-term+infection+with+Helicobacter+felis.+A+mouse+model+of+Helicobacter+pylori-induced+gastric+lymphoma.">MALToma-like lesions in the murine gastric mucosa after long-term infection with Helicobacter felis. A mouse model of Helicobacter pylori-induced gastric lymphoma.</a> The American Journal of Pathology. 147 (1), 217-222 (1995).</li><li>Lee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+standardized+mouse+model+of+Helicobacter+pylori+infection:+introducing+the+Sydney+strain.">A standardized mouse model of Helicobacter pylori infection: introducing the Sydney strain.</a> Gastroenterology. 112 (4), 1386-1397 (1997).</li><li>Crabtree, J. E., Ferrero, R. L., Kusters, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mouse+colonizing+Helicobacter+pylori+strain+SS1+may+lack+a+functional+cag+pathogenicity+island.">The mouse colonizing Helicobacter pylori strain SS1 may lack a functional cag pathogenicity island.</a> Helicobacter. 7 (2), 139-140 (2002).</li><li>Israel, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori+strain-specific+differences+in+genetic+content,+identified+by+microarray,+influence+host+inflammatory+responses.">Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses.</a> Journal of Clinical Investigation. 107 (5), 611-620 (2001).</li><li>Fox, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+pylori-induced+gastritis+in+the+domestic+cat.">Helicobacter pylori-induced gastritis in the domestic cat.</a> Infection and Immunity. 63 (7), 2674-2681 (1995).</li><li>Lee, A., Hazell, S. L., O'Rourke, J., Kouprach, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+spiral-shaped+bacterium+from+the+cat+stomach.">Isolation of a spiral-shaped bacterium from the cat stomach.</a> Infection and Immunity. 56 (11), 2843-2850 (1988).</li><li>Ferrero, R. L., Wilson, J. E., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+Helicobacter-induced+gastric+cancer:+use+of+cocarcinogens.">Mouse models of Helicobacter-induced gastric cancer: use of cocarcinogens.</a> Methods in Molecular Biology. 921, 157-173 (2012).</li><li>Ferrero, R. L., Thiberge, J. M., Huerre, M., Labigne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+of+specific-pathogen-free+mice+to+chronic+Helicobacter+pylori+(strain+SS1)+infection.">Immune responses of specific-pathogen-free mice to chronic Helicobacter pylori (strain SS1) infection.</a> Infection and Immunity. 66 (4), 1349-1355 (1998).</li><li>Blanchard, T. G., Nedrud, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+maintenance+of+Helicobacter+species.">Laboratory maintenance of Helicobacter species.</a> Current Protocols in Microbiology. , (2012).</li><li>Kim, J. S., Chang, J. H., Chung, S. I., Yum, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+the+host+genetic+background+on+immune+responses+to+Helicobacter+pylori+infection+and+therapeutic+vaccine+efficacy.">Importance of the host genetic background on immune responses to Helicobacter pylori infection and therapeutic vaccine efficacy.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 31 (1), 41-46 (2001).</li><li>Nedrud, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+genetic+influence+on+the+innate+inflammatory+response+to+helicobacter+infection+of+the+gastric+mucosa.">Lack of genetic influence on the innate inflammatory response to helicobacter infection of the gastric mucosa.</a> Frontiers in Immunology. 3, 181 (2012).</li><li>Cai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+felis+eradication+restores+normal+architecture+and+inhibits+gastric+cancer+progression+in+C57BL/6+mice.">Helicobacter felis eradication restores normal architecture and inhibits gastric cancer progression in C57BL/6 mice.</a> Gastroenterology. 128 (7), 1937-1952 (2005).</li><li>Ferrero, R. L., Labigne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cloning,+expression+and+sequencing+of+Helicobacter+felis+urease+genes.">Cloning, expression and sequencing of Helicobacter felis urease genes.</a> Molecular Microbiology. 9 (2), 323-333 (1993).</li><li>Stevenson, T. H., Castillo, A., Lucia, L. M., Acuff, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+Helicobacter+pylori+in+various+liquid+and+plating+media.">Growth of Helicobacter pylori in various liquid and plating media.</a> Letters in Applied Microbiology. 30 (3), 192-196 (2000).</li><li>Uotani, T., Graham, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+Helicobacter+pylori+using+the+rapid+urease+test.">Diagnosis of Helicobacter pylori using the rapid urease test.</a> Annals of Translational Medicine. 3 (1), 9 (2015).</li><li>Riley, L. K., Franklin, C. L., Hook, R. R., Besch-Williford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+murine+helicobacters+by+PCR+and+restriction+enzyme+analyses.">Identification of murine helicobacters by PCR and restriction enzyme analyses.</a> Journal of Clinical Microbiology. 34 (4), 942-946 (1996).</li><li>Chaouche-Drider, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+commensal+Helicobacter+sp.+of+the+rodent+intestinal+flora+activates+TLR2+and+NOD1+responses+in+epithelial+cells.">A commensal Helicobacter sp. of the rodent intestinal flora activates TLR2 and NOD1 responses in epithelial cells.</a> PLoS One. 4 (4), e5396 (2009).</li><li>Fox, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helicobacter+bilis:+bacterial+provocateur+orchestrates+host+immune+responses+to+commensal+flora+in+a+model+of+inflammatory+bowel+disease.">Helicobacter bilis: bacterial provocateur orchestrates host immune responses to commensal flora in a model of inflammatory bowel disease.</a> Gut. 56 (7), 898-900 (2007).</li><li>McGee, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+enhances+Helicobacter+pylori+resistance+to+antibiotics+and+LL-37.">Cholesterol enhances Helicobacter pylori resistance to antibiotics and LL-37.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (6), 2897-2904 (2011).</li><li>Viala, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nod1+responds+to+peptidoglycan+delivered+by+the+Helicobacter+pylori+cag+pathogenicity+island.">Nod1 responds to peptidoglycan delivered by the Helicobacter pylori cag pathogenicity island.</a> Nature Immunology. 5 (11), 1166-1174 (2004).</li><li>Kong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+specific+PCR+method+to+detect+Helicobacter+felis+in+a+conventional+mouse+model.">A sensitive and specific PCR method to detect Helicobacter felis in a conventional mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 3 (1), 73-78 (1996).</li><li>Ng, G., Every, A., McGuckin, M., Sutton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+Helicobacter+felis+colonization+in+male+129/Sv+mice+fails+to+suppress+gastritis.">Increased Helicobacter felis colonization in male 129/Sv mice fails to suppress gastritis.</a> Gut Microbes. 2 (6), 358-360 (2011).</li><li>Ferrero, R. L., Ave, P., Radcliff, F. J., Labigne, A., Huerre, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Outbred+mice+with+long-term+Helicobacter+felis+infection+develop+both+gastric+lymphoid+tissue+and+glandular+hyperplastic+lesions.">Outbred mice with long-term Helicobacter felis infection develop both gastric lymphoid tissue and glandular hyperplastic lesions.</a> The Journal of Pathology. 191 (3), 333-340 (2000).</li></ol>

Det här protokollet beskriver användning av en i vivo musmodell för Helicobacter -infektion. De kritiska steg i förfarandet är att: 1) beredning av Helicobacter inokulat som innehåller livskraftiga och rörliga bakterier; (2) leverans av antal bakterier till musen via intragastrisk sondmatning; (3) upptäckt av bakteriell infektion av kolonin räknar eller PCR. och 4) bearbetning av magsäckens vävnader för att kunna bedöma om histopatologi i infekterade magar. Ytterligare förslag på...

Helicobacter pylori är spiralformade, gramnegativa, mänskliga mag patogener närvarande i alla populationer över hela världen, med infektion priser i utvecklingsländerna som uppskattas vara i storleksordningen 80%1. Även om de flesta H. pylori-infekterade individer är asymtomatiska, vissa utvecklar mer allvarliga sjukdomar, alltifrån ulcus till ventrikelcancer2. H. pylori-associerad cancer kännetecknas i huvudsak antingen genom elakartade förändringar i epitelceller (GECs) eller genom bildandet av extra nodal lymfvävnad i magen, resulterande i gastriskt adenokarcinom eller slemhinna-associerade lymfoida vävnad (MALT) lymfom, respektive. H. pylori är mycket anpassade för att överleva i den hårda ekologisk nischen i magen på grund av olika virulensfaktorer och mekanismer som underlättar dess följsamhet, tillväxt och ämnesomsättning i denna nisch. I synnerhet ha virulenta stammar av H. pylori de 40 kb cag patogenicitet Island (cagPAI) som kodar ungefär 30 gener krävs för produktionen av en typ 4 utsöndring system (T4SS)3,4 . CAG PAI-positiv H. pylori stammar är associerade med induktion av högre nivåer av kronisk inflammation i den mottagande, som har varit inblandade som en viktig föregångare av gastriskt adenokarcinom5.
In vivo djurmodeller, särskilt möss, har varit mycket informativ genom att låta forskare att undersöka de relativa bidrag av värd, bakterie- och miljömässiga faktorer på H. pylori -infektion och sjukdom resultatet6. Studier har tidigare visat att långvarig H. pylori infektion i möss på C57BL/6 genetiska bakgrunden resultaten i utvecklingen av kronisk gastrit och körteln förtvinar, båda kännetecknen för H. pylori infektion7. Infektion med de relaterade katt/hund bakteriearter, H. felis, har dessutom visat sig framkalla MALT bildas i möss med liknande patologi och sjukdomsutveckling som sett i mänskliga MALT lymfom8,9. De vanligaste H. pylori isolatet i mus colonization studier är den ”Sydney stam 1” (SS1) stam10, som är cagPAI+ men har en icke-funktionella T4SS (T4SS−)11. Andra utbredda stammar inkludera H. pylori B128 7.13 (cagPAI+/T4SS+)12 och X47-2AL (cagPAI–/T4SS−)13. För H. felis infektioner, stammen CS1 (”Cat Spiral 1”, cagPAI–/T4SS−) är allmänt använda14.
Häri, tillhandahåller vi ett protokoll som beskriver utarbetandet av Helicobacter inokulat för i vivo infektion, förfarandet för intragastrisk sondmatning av möss, samt metoder för bearbetning av vävnader för studien av histopatologiska förändringar i magen. I synnerhet kommer att denna artikel fokusera på de histologiska metoder som används för att visualisera bakteriell kolonisering och bedöma histopatologiska förändringar, inklusive bildandet av MALT, i slemhinnan i magsäcken av infekterade möss. Några av de metoder som beskrivs här kan anpassas till studiet av andra gut patogener såsom S. Typhimurium eller C. rodentium.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacteriological reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxoid Blood Agar Base No.2</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>CM0271B</td>
			<td>Dissolve in deinonized water prior to sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Premium Defibrinated Horse blood</td>
			<td>Australian Ethical Biologicals</td>
			<td>PDHB100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Brain Heart Infusion Broth</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>237500</td>
			<td>Dissolve in deinonized water prior to sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CampyGen gas packs</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>CN0035A/CN0025A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histological reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formalin, neutral buffered, 10%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute alcohol, 100% Denatured</td>
			<td>ChemSupply</td>
			<td>AL048-20L-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol (2-propanol)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene (sulphur free)</td>
			<td>ChemSupply</td>
			<td>XT003-20L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mayer&#39;s Haematoxylin</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>&#160;MH-1L</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin, Aqueous Stain</td>
			<td>Amber Scientific</td>
			<td>EOCA-1L</td>
			<td>Filter before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wright-Giemsa Stain, modified</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>WG80-2.5L</td>
			<td>Dilute before use (20% Giemsa, 80% deionized water)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histolene</td>
			<td>Grale Scientific</td>
			<td>11031/5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPX mounting medium</td>
			<td>VWR</td>
			<td>1.00579.0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>The annealing temperature of ureB primers used in this study is 61&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GoTaq Flexi DNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>&#160;M8291</td>
			<td>Kit includes 10X PCR buffer and Magnesium Chloride</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-39028</td>
			<td>Dilute to 10mM in sterile nuclease free water before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Grade Agarose</td>
			<td>Bioline</td>
			<td>BIO-41025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydrogen Carbonate</td>
			<td>Univar (Ajax Fine Chemicals)</td>
			<td>A475-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulphate Heptahydrate</td>
			<td>Chem-Supply</td>
			<td>MA048-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vancomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>V2002-1G</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polymyxin B</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4932-5MU</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimethoprim (&#8805;98% HPLC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7883</td>
			<td>Dissolve in 100% (absolute) Ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin</td>
			<td>Amresco (Astral Scientific)</td>
			<td>E437-100MG</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacitracin from Bacillus licheniformis</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B0125</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Naladixic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>N8878</td>
			<td>Dissolve in deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methoxyflurane (Pentrhox)</td>
			<td>Medical Developments International</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin Wax</td>
			<td>Paraplast Plus, Leica Biosystems</td>
			<td>39601006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and plasticware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxoid Anaerobic Jars</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>HP0011/HP0031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COPAN Pasteur Pipettes</td>
			<td>Interpath Services</td>
			<td>200CS01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf 5810R centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Collect bacterial pellets by centrifugation at 2,200 rpm for 10 mins at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23g precision glide needle</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>301805</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Bemis, VWR</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portex fine bore polythene tubing</td>
			<td>Smiths Medical</td>
			<td>800/100/200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic feeding catheters</td>
			<td>Instech&#160; Laboratories</td>
			<td>FTP20-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml tuberculin luer slip disposable syringes</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>302100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf micropestle for 1.2 - 2 mL tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Z317314</td>
			<td>Autoclavable polypropylene pestles used for stomach homogenization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GentleMACs Dissociator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-235</td>
			<td>Use a pre-set gentleMACS Programs for mouse stomach tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M Tubes (orange cap)</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>30-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Qubit Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile plastic loop</td>
			<td>LabServ</td>
			<td>LBSLP7202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold Plate, Leica EG1160 Embedding System</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>Not applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek Base Mould System, Base Mold 38 x 25 x 6</td>
			<td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td>
			<td>4124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek III Uni-Casette System</td>
			<td>Sakura, Alphen aan den Rijn</td>
			<td>4170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome, Leica RM2235</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Charged SuperFrost Plus glass slides</td>
			<td>Menzel Glaser, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4951PLUS4</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mouse models of helicobacter infection and gastric pathologies

Helicobacter pylori är gastric patogener som förekommer i hälften av världens befolkning och är en betydande orsak till sjuklighet och dödlighet hos människor. Flera musmodeller av gastric Helicobacter -infektion har utvecklats för att studera de molekylära och cellulära mekanismer varigenom H. pylori bakterier kolonisera magen av mänskliga värdar och orsakar sjukdom. Häri, beskriver vi protokollen till: 1) förbereda bakteriell suspensioner för infektionen i vivo i möss via intragastrisk sondmatning; (2) fastställa bakteriell kolonisering nivåer i mus magsäckens vävnader, av polymeras-kedjereaktion (PCR) och livskraftig räknar; och 3) bedöma patologiska förändringar, med histologi. För att fastställa Helicobacter infektion hos möss, specifikt patogenfria (SPF) djuren inokuleras först med suspensioner (innehållande ≥105 kolonibildande enheter, CFUs) av mus-kolonisera stammar av antingen Helicobacter pylori eller andra gastric Helicobacter spp. från djur, såsom Helicobacter felis. Vid lämpliga tidpunkter efter infektionen, är magar censurerade och dissekeras sagittally i två lika vävnad fragment, vardera bestående av regionerna antrum och kroppen. En av dessa fragment används sedan för antingen lönsamt räkna eller DNA-extraktion, medan den andra utsätts för histologisk bearbetning. Bakteriell kolonisering och histopatologiska förändringar i magen får bedömas rutinmässigt i gastric vävnadssnitt färgas med Warthin-Starry, Giemsa eller hematoxylin och Eosin (H & E) fläckar, som är lämpligt. Ytterligare immunologiska analyser kan också genomföras av immunhistokemi eller immunofluorescens på mus gastric vävnadssnitt. De protokoll som beskrivs nedan är särskilt utformade för att möjliggöra bedömning hos möss av gastric patologier som liknar dem i mänskliga-relaterade H. pylori sjukdomar, inklusive inflammation, körtel atrofi och lymfoida hårsäcken bildandet. Inokulum förberedelse och intragastrisk sondmatning protokoll kan också anpassas till studerar patogenesen av andra enteriska mänskliga patogener att kolonisera möss, såsom Salmonella Typhimurium eller Citrobakter rodentium.

Det här protokollet beskriver en oral sondmatning teknik för att uppnå intragastrisk infektion med H. pylori eller H. felis i murina musmodeller (figur 1). Efter eutanasi, magar bort, vägs och uppdelad i 2 lika stora delar bestående av antrum, kroppen och icke-glandular regioner av magsäckens vävnader (figur 2). Icke-glandular regionen tas bort innan du utför några analyser.
Framgångsrika koloniseringen av ...

Watch this Scientific Journal Video about Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies at JoVE.com

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Musmodeller av Helicobacter -infektion och Gastric patologier

Möss utgör en ovärderlig i vivo -modell för att studera infektion och sjukdomar orsakade av gastrointestinala mikroorganismer. Här beskriver vi de metoder som används för att studera bakteriell kolonisering och histopatologiska förändringar i musmodeller av Helicobacter pylori-relaterade sjukdomar.

Helicobacter pylori is a gastric pathogen that is present in half of the global population and is a significant cause of morbidity and mortality in ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom gastroenterologi området om effekterna av medlemmar av mikrobiota, särskilt de av släktet Helicobacter, på inflammation och cancer. Den största fördelen med denna teknik är att den tillåter studiet av Helicobacter infektion och dess inverkan på magen under fysiologiska förhållanden. Konsekvenserna av denna teknik sträcker sig mot utvecklingen av terapier för förebyggande eller eliminering av Helicobacter infektion eller dess konsekvenser, inklusive antibiotika, läkemedel, eller vacciner.Dessa metoder ger insikt som är specifika för patogenesen vid Helicobacter infektion. Flera av teknikerna kan dock anpassas till studiet av andra gastrointestinala patogener. Generellt kommer individer som är nya till denna metod att kämpa med beredningen av ett bakteriellt inokulat som kan etablera en infektion hos möss.Det är absolut nödvändigt att Helicobacter-isolaten är kända mus-koloniserande stammar som inte har genomgått omfattande subkultur in vitro. Dessutom bör antalet in vitro-subkulturer för dessa stammar registreras. Tillsätt bakteriedämpningar till polystyrenrör på 15 milliliter och använd en plastslinga för att överföra en 10-till 20-mikroliterdropp från varje kultur till individuella glasmikroskopsglas.Sedan, bedöma livskraft och motilitet av bakterierna under faskontrast mikroskopi vid en 100 gånger förstoring. Använd endast H.pylori-inokulor om majoriteten av bakterierna har en bacillär form. H.felis inocula bör i första hand innehålla spiralformade bakterier.Och ladda inokulaten i individuella, disponibla, en milliliter sprutor. Utrusta varje spruta med en nål med 23 gauge, och använd paraffinfilm av plast för att fästa en engångskateter av polyeten på varje nål. Därefter, manuellt begränsa en sex till åtta veckor gammal specifik-patogen-fri och Helicobacter-fri mus av scruff av nacke och svans, och sätt in en kateter i mitten av den öppna käken.Led katetern i en caudal mot matstrupen, förlänga halsen av musen för att möjliggöra enkel tillgång till magen genom matstrupen och bort från luftstrupen tills de flesta eller alla av katetern inte längre är synlig och ett motstånd känns. Sedan leverera minst en gånger 10 till den femte bakterier för att säkerställa en optimal kolonisering och sjukdom patologi. I slutet av experimentet, använd fin, böjd sax för att öppna bukhålan för excision av magen.Skär magen längs den större krökningen, och tvätta försiktigt organet två gånger i ett 50-milliliter rör av färsk PBS per tvätt för att avlägsna eventuell kvarvarande mat. Efter den andra tvätten, placera vävnaden i en tjärad, sex centimeter, plast Petriskål för att registrera den våta vikten. Efter platta magen, bisect provet sagittally i två lika vävnad fragment bestående av antrum, kropp och icke-körtelskogsområdena forestomach.Ta bort icke-körtelregionen, och väg ena halvan av varje mage innan du förvarar vävnadsbiten i lämplig lösning för den planerade nedströmsanalysen. Tillsätt den andra halvan av magen vävnad till en 15-milliliter koniska röret som innehåller 10%formalin, platta vävnaderna mot de övre sidorna av rören efter 10 sekunder. När vävnaderna har blivit anbringade på rörväggarna, åter nedsänk proverna i formalin i minst 24 timmar.För att räkna antalet livskraftiga H.pylori i magen post-infektion, homogenisera mage prover lagras i BHI, och utföra dubbla serieutspädningar av den resulterande mag homogenater i färsk, steril buljong. Dela upp förtorkade hästblodagar, eller HBA, plattor kompletterade med ytterligare antibiotika i tre eller fyra segment, och, med hjälp av en anpassning av Miles och Misra-tekniken, tillsätt 10 till 100 mikroliter av varje magehomogenatutspädning på ett segment av varje agarplatta. Sprid homogenates med sterila, plastöglor, och låt plattorna torka.Placera sedan plattorna i ett inverterat läge i anaerobe gasburkar som innehåller en petriskål med vatten och en gasförpackning. Sedan, ruva burkarna vid 37 grader Celsius i fyra till sju dagar. När kolonier kan observeras, räkna upp de segment som innehåller mellan 10 och 100 isolerade kolonier.Efter dödshjälp skördas magen från djuren och vägs. Den icke-körtelregionen avlägsnas, och magen är uppdelad i två lika stora halvor som omfattar antrum och kropp. Framgångsrik kolonisering bekräftas vanligtvis genom att utföra livskraftiga räkna och efterföljande uppräkning av enskilda kolonier från mag homogenater streckade på HBA plattor.Observera att förekomsten av förorenande bakterier från musen gastrisk mikrobiota eller stort antal H.pylori kolonier kan komplicera uppräkningen av H.pylori CFUs. Alternativt kan PCR användas för att verifiera infektion med hjälp av specifika validerade primers riktade mot en 325-baspar region i H.felis och H.pylori ureB gener. I detta representativa experiment, vild-typ C57 Black-6 möss visas måttliga tecken på inflammation, inklusive hyperplasi och körtel atrofi vid sex månader efter infektion med H.felis, samt cellulär infiltration av submucosa.Svårare inflammation observeras i knockout möss vid samma tidpunkt, med ytterligare förekomst av lymfoida folliklar observeras i närheten av cellulära infiltrates. H.felis bakterier kan också visualiseras i Giemsa-färgade delar av infekterade mus mage vävnad. Efter detta förfarande kan andra metoder som kvantitativa PCR, immunohistokemi eller immunofluorescens utföras för att svara på ytterligare frågor om de typer av värd svar inducerad under Helicobacter infektion.Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom mikrobiologi och gastroenterologi att utforska den orsakande roll Helicobacter pylori i magsjuka hos människor. Efter att ha sett denna video, bör du ha en god förståelse för hur man reproducera infektioner möss med Helicobacter arter och att studera patologin i samband med infektionen. Glöm inte att de Helicobacter-stammar som används i detta protokoll är smittsamma, och därför bör standardförfaranden för biosäkerhet alltid följas medan du arbetar med dessa bakterier.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Mouse Models Of Helicobacter Infection And Gastric Pathologies

Transurethral Induction of Mouse Urinary Tract Infection

Transuretral Induktion av Mouse Urinvägsinfektion

Uropathogenic bacterial strains of interest are grown on agar. Generally, uropathogenic E. coli (UPEC) and other strains can be grown overnight on ...

Diagnosis of Ecto- and Endoparasites in Laboratory Rats and Mice

Diagnos av Ecto-och endoparasiter i laboratorium råttor och möss

Internal and external parasites remain a significant concern in laboratory rodent facilities, and many research facilities harbor some parasitized ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Intranasal administration av rekombinant influensavacciner i chimär musmodeller för att studera slemhinneimmunitet

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Organoids as Model for Infectious Diseases: Culture of Human and Murine Stomach Organoids and Microinjection of Helicobacter Pylori

Organoids som modell för Infektionssjukdomar: Culture of Human och Murina mage Organoids och mikroinjektion av Helicobacter Pylori

Recently infection biologists have employed stem cell derived cultures to answer the need for new and better models to study host-pathogen interactions. ...

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation

Intratrakeal administration<em&gt; Haemophilus influenzae</em&gt; I musmodeller för att studera Airway Inflammation

Here, we describe a detailed procedure to efficiently and directly deliver Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. We ...

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

One-step Negative Chromatographic Purification of Helicobacter pylori Neutrophil-activating Protein Overexpressed in Escherichia coli in Batch Mode

Enstegs Negativ kromatografisk rening av<em&gt; Helicobacter pylori</em&gt; Neutrofilaktiverande Protein överuttryckt i<em&gt; Escherichia coli</em&gt; I batch-läge

Helicobacter pylori neutrophil-activating protein (HP-NAP) is a major virulence factor of Helicobacter pylori (H. pylori). It plays a critical role in H. ...

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Mus - och mänskliga-härledda primära Gastric epitelial enskiktslager kultur för studien av regenerering

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model

Intrakraniell Subarachnoidal rutten av infektion för undersöker roller av Streptococcus suis biofilmer i hjärnhinneinflammation i en musmodell för infektion

Streptococcus suis is not only a major bacterial pathogen of pigs worldwide but also an emerging zoonotic agent. In humans and pigs, meningitis is a major ...

CRISPR-Cas9-based Genome Engineering to Generate Jurkat Reporter Models for HIV-1 Infection with Selected Proviral Integration Sites

CRISPR-Cas9-baserade genomet Engineering att generera Jurkat Reporter modeller för HIV-1 infektion med valda Proviral Integration platser

Human immunodeficiency virus (HIV) integrates its proviral DNA non-randomly into the host cell genome at recurrent sites and genomic hotspots. Here we ...

Chronic, Acute, and Reactivated HIV Infection in Humanized Immunodeficient Mouse Models

Kronisk, akut, och återaktiveras HIV-infektion i humaniserade Immunobristfälliga musmodeller

Humanized NOD/SCID/IL-2 receptor &#947;-chainnull mice recapitulate some features of human immunity, which can be exploited in basic and pre-clinical ...