Name: cell membrane repair assay using a two-photon laser microscope
Uploaded: 2018-01-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af University of Alberta Fakultet for medicin og tandpleje, The venner af Garrett Cumming stol forskningsfond, HM Toupin neurologiske videnskab forskning stol fond, muskelsvind Canada, Canada Foundation for Innovation (CFI), Alberta avanceret uddannelse og teknologi (AET), canadiske institutter for sundhedsforskning (CIHR), Jesses rejse - grundlaget for gen og celleterapi, kvinder og børns sundhed Research Institute (WCHRI), og Alberta innoverer sundhed løsninger (AIHS ).
Vi vil gerne takke Dr. Steven Laval til forsyne os med fuld længde dysferlin plasmid. Vi vil også gerne takke Dr. Katsuya Miyake for teknisk rådgivning.

Menneskelige fibroblastceller, der anvendes i denne undersøgelse blev brugt med godkendelse fra den menneskelige etiske komité af lægevidenskabelige Fakultet og tandpleje på University of Alberta.
1. Transfektion af celler med fuld længde DYSF plasmid
<ol>
	<li>Kultur fibroblastceller i en T225 kolbe indeholdende 40 mL vækst medier - 36 mL Dulbecco ændret Eagle Medium (DMEM), 4 mL føtalt bovint serum (FBS) og 20 µL af penicillin/streptomycin (P/S) - i en CO2 inkubator ved...

<ol>
	<li>Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+wounding+and+repair+in+pulmonary+diseases.">Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).</li><li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Membrane+Repair+in+Health+and+Disease.">Plasma Membrane Repair in Health and Disease.</a> Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).</li><li>McNeil, P. L., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+cell+plasma+membrane+wounding+and+resealing+in+vivo.">Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo.</a> Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).</li><li>McNeil, P. L., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emergency+response+team+for+membrane+repair.">An emergency response team for membrane repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).</li><li>Cooper, S. T., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Repair:+Mechanisms+and+Pathophysiology.">Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology.</a> Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).</li><li>Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+free+Ca2++and+proteolysis+in+lethal+oxidative+injury+in+endothelial+cells.">Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells.</a> Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).</li><li>McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+actin-cytoskeleton-dependent+recruitment+of+plasma+membrane-derived+dysferlin+at+wounds+is+critical+for+muscle+membrane+repair.">Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair.</a> FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).</li><li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).</li><li>Demonbreun, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+actin-dependent+annexin+complex+mediates+plasma+membrane+repair+in+muscle.">An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle.</a> J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).</li><li>McNeil, P. L., Khakee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+muscle+fiber+plasma+membranes.+Role+in+exercise-induced+damage.">Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage.</a> Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).</li><li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomes+behave+as+Ca2+-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells.">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).</li><li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca(2+)-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106 (2), 157-169 (2001).</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).</li><li>Han, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlin-mediated+membrane+repair+protects+the+heart+from+stress-induced+left+ventricular+injury.">Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury.</a> J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).</li><li>Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+lysosomal+exocytosis+and+plasma+membrane+repair+in+Chediak-Higashi/beige+cells.">Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).</li><li>Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+plasma+membrane+wounding+and+assessment+of+lysosome-mediated+repair+responses.">Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses.</a> Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+and+dendrite+dynamics+in+zebrafish+embryos:+early+events+in+synaptogenesis+imaged+in+vivo.">Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo.</a> Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems.">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li><li>Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlinopathy+Fibroblasts+Are+Defective+in+Plasma+Membrane+Repair.">Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair.</a> PLoS Curr. 7, (2015).</li><li>Philippi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlin-deficient+immortalized+human+myoblasts+and+myotubes+as+a+useful+tool+to+study+dysferlinopathy.">Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy.</a> PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery.">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).</li><li>Swaggart, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+A6+modifies+muscular+dystrophy+by+mediating+sarcolemmal+repair.">Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).</li><li>Roostalu, U., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+molecular+interactions+at+damaged+sarcolemma.">In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma.</a> Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).</li><li>Azakir, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+dispensability+of+dysferlin+C2+domains+reveals+rational+design+for+mini-dysferlin+molecules.">Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).</li><li>Lee, J., Yokota, T., Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+6.">Ch 6.</a> Translational Research in Muscular Dystrophy. , 87-102 (2016).</li><li>Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+research+and+therapeutic+perspectives+in+dysferlinopathies.">Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies.</a> Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).</li></ol>

To-foton laser såret af cellemembranen er en præcis og alsidig teknik til vurdering af dynamikken i membranen genforsegling in vitro. I denne artikel beskrev vi en protokol til bestemmelse af cellemembranen genforsegling evne i dysferlinopathy patientens celler ved hjælp af to-foton laser såret assay. Vores resultater viser, at dysferlinopathy patienten celler er defekt i cellemembranen lukning, som er i overensstemmelse med resultaterne af andre forskere og som yderligere fremhæver de slående ligheder i c...

Cellemembranen af eukaryote celler består af et dobbelt-lag af protein-besat fosfolipider som definerer den intra/ekstracellulære miljø af cellen og er afgørende for at opretholde cellulære homøostase og celle overlevelse. Cellemembranen skader som følge af mekanisk eller kemisk fornærmelser er hverdagskost i forskellige pattedyr celletyper, herunder skelet og hjertemuskulaturen, mave og lunge celler1,2,3,4. Ud over skader deraf til daglige fysiologiske funktion, kan cellemembraner også blive beskadiget af miljømæssige fornærmelser, bakteriel toksiner og iskæmisk reperfusion5. Manglende evne til at forsegle bristninger i cellemembranen fører til en ureguleret tilstrømning af ekstracellulære Ca2 +- sammen med andre potentielt giftige ekstracellulære komponenter - ind i cellen, udløser downstream signal cascades, hvilket kan hurtigt resultere i celle død1,4,5,6.
Til dato har der været flere foreslåede modeller for membran reparation i celler. Forskellige reparations-mekanismer kan blive aktiveret alt efter størrelse og karakter af membran brud. For eksempel, det foreslås, at cellemembraner kan udnytte, laterale flow eller protein tilstopning for at reparere små forstyrrelser (&#60; 1 nm). Den laterale sammensmeltning model foreslår at membran brister hurtigt bødet gennem laterale ansættelse af dysferlin-holdige membran7, mens protein tilstopning model tyder på, at små perforeringer er bødet gennem protein sammenlægninger (for det meste annexins) 8. derimod større membran læsioner udløse Ca2 +-afhængige, dysferlin-medieret vesikel fusion og dannelsen af en reparation patch. I reparation patch model, en hurtig Ca2 + tilstrømning ind i cellen udløser ansættelse af flere proteiner (dysferlin, annexins, mitsugumin-53 og EDH proteiner), som udgør en kompleks eller "patch", sammen med en fusion af intracellulære blærer eller lysosomer i stedet for membran skade4,9,10,11,12. Det er vigtigt at bemærke, at disse modeller som ikke nødvendigvis udelukker og kan arbejde i fællesskab for at lette membran reparation. Manglende korrekt forsegle cellemembranerne skader er forbundet med flere sygdomstilstande, herunder muskeldystrofi (dysferlinopathy - herunder Miyoshi myopathy, led-bælte muskelsvind type IIB og distale myopathy med forreste tibial debut) 13, kardiomyopati14og Chediak-Higashi syndrom (CHS)15.
I betragtning af at rette celle membran integritet og genlukning spiller sådan en vigtig rolle i sundhed og sygdom, en dybere forståelse af de underliggende molekylære mekanismer af cellemembranen reparation ville være gavnlige i at finde nye terapeutiske strategier. Det er derfor nødvendigt at besidde relevante eksperimentelle teknikker til at overvåge kinetik og vurdere muligheden af cellemembranen reparation. Flere in vitro- metoder til modellering membran reparation er designet. Én strategi indebærer mekanisk skade, som kan fremmes gennem celle skrabe med en pipette/kirurgiske kniv/skraber eller ved at rulle glasperler over celler16. Men denne form for mekanisk skade genererer større læsioner, og skaber en høj grad af variation i celle skade, både inden for og mellem kulturer.
En anden metode til at generere membran sår er laser ablation af to-foton mikroskopi. I modsætning til traditionelle laser Konfokal mikroskopi, der beskæftiger enkelt foton excitation, bruger to-foton laser samtidig to lang bølgelængde, lav-energi fotoner til at lette excitation af en højenergi elektron17. Denne ikke-lineær proces resulterer i excitation udelukkende inden for brændplanet og ikke langs hele lys vej17 (figur 1). Dette reduceret excitation volumen hjælper med at minimere solskader, når imaging levende celler18,19. Forskere kan derfor generere præcis læsioner i cellemembranen og monitor membran genlukning i realtid ved hjælp af fluorescerende farvestoffer og observere ændringer i fluorescens-intensiteten som cellemembranen bristninger og derefter lukninger (reseals).
Denne tilgang er blevet brugt gentagne gange til at studere membran såret in vitro og i vivo og i flere celle typer20,21. For eksempel, membran reparere defekter i fibroblaster og myotubes stammer fra dysferlinopathy patienter blev vurderet ved hjælp af denne teknik22,23. Også, enkelt muskelfibre isoleret fra mus blev brugt til at overvåge reparation patch dannelse13,24,25. Flytning af fluorescently mærket proteiner kan også iagttages under membran reparation i enkelt muskelfibre9. Derudover kan processen med sarcolemmal reparation efter to-foton laser var blevet såret i zebrafisk embryoner observeres i realtid i vivo26.
I denne artikel vil skitsere vi en metode til vurdering af cellemembranen reparation dynamics i fibroblaster ved hjælp af to-foton laser såret, selv om denne metode kan anvendes på forskellige celletyper med henblik på at kvantificere plasma membran genforsegling evne i vitro. I denne metode, cellerne inkuberes med FM4-64, en lipofile, celle-vandtætte farvestof, der hurtigt fluorescerer da det binder sig til negativt ladede fosfolipider i cytoplasma ved ankomsten til cellen gennem membranen læsion (figur 2&#38; 3). kvantificering af farvestof fluorescens støder op til membran læsion giver mulighed for at overvåge den tid, det tager for cellemembranen til reseal selve. For at eksemplificere nytten af denne metode, bruger vi dysferlinopathy patient fibroblaster transfekteret med normal god landbrugspraksis-konjugeret fuld længde dysferlin (DYSF) plasmider for at vurdere redning af cellemembranen reparation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11320033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">35mm collagen-coated glass-bottom dishes</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P53GCOL-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Serum-deprived media</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15338100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">FM 4-64 Dye</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Tyrode&#8217;s Salts Solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T2397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Chameleon Two-photon laser</td>
			<td style="width:71px;">Coherent</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell membrane repair assay using a two-photon laser microscope

Mange patofysiologiske fornærmelser kan forårsage skader på cellemembranerne og, når kombineret med medfødte defekter i cellemembranen reparation eller integritet, kan resultere i sygdommen. Forstå de underliggende molekylære mekanismer omkring cellemembranen reparation er derfor en vigtig målsætning for udviklingen af nye terapeutiske strategier for sygdomme forbundet med dysfunktionelle cellemembranen dynamics. Mange in vitro og i vivo undersøgelser med henblik på forståelse af cellemembranen genlukning i forskellige sygdom sammenhænge udnytter to-foton laser ablation som en standard for bestemmelse af funktionelle resultater efter eksperimentelle behandlinger. I denne analyse underkastes cellemembraner såret med en to-foton laser, som forårsager cellemembranen til brud og fluorescerende farvestof til at infiltrere cellen. Intensiteten af fluorescens i cellen kan derefter overvåges for at kvantificere cellens evne til reseal selve. Der er flere alternative metoder til vurdering af cellemembranen reaktion på skade, samt stor variation i de to-foton laser såret tilgang, selv, derfor, en enkelt, ensartet model af celle såret ville gavnlig tjener til at mindske den variation mellem disse metoder. I denne artikel vil skitsere vi en simpel to-foton laser såret protokol for at vurdere cellemembranen reparation in vitro- i både sunde og dysferlinopathy patient fibroblast celler transfekteret med eller uden en fuld længde dysferlin plasmid.

Sunde humane fibroblaster, ubehandlede dysferlinopathy patient fibroblaster og patient fibroblaster transfekteret med et plasmid som indeholder fuld længde dysferlin sekvens blev udsat for to-foton laser såret for at vurdere membran genforsegling evne i realtid. Sunde humane fibroblastceller vises lave niveauer af FM 4-64 fluorescens aktivering efter laser blevet såret og ikke-behandlede patient fibroblaster udstillet en høj grad af relative fluorescens intensitet efter skade (<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope at JoVE.com

Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Cellemembranen reparation analyse ved hjælp af en to-foton Laser mikroskop

Cellemembranen såret via to-foton laser er en meget udbredt metode til vurdering af membran genforsegling evne og kan anvendes til flere celletyper. Her, beskriver vi en protokol til in vitro- live-imaging membran lukning i dysferlinopathy patientens celler efter to-foton laser ablation.

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

En Visual analysen til overvågning T6SS-medieret bakteriel konkurrence

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Overvåge ændringer i Membrane polaritet, Membrane Integritet, og intracellulære Ion Koncentrationerne i<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Brug fluorescerende farvestoffer

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Konformationel Evaluering af HIV-1 trimere kappeglycoproteinerne hjælp af en celle-ELISA-assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Undersøgelse Mast Cell Sekretorisk Granulat; fra Biosyntese til exocytose

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Long Term Intravital multiphoton Microscopy Imaging af immunceller i rask som syg Lever Brug CXCR6.Gfp Reporter Mus

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Vurdering Retinal mikrogliaceller fagocytotisk funktion<em&gt; In vivo</em&gt; Brug en flowcytometri-baseret assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay til påvisning af Antigen-specifikke T-celle cytolytisk funktion ved hjælp af en Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

To-foton Intravital billeddannelse af leukocytter under immunrespons i LPS-behandlede mus lever

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Karakterisering af Thymus-afhængige og Thymus-uafhængig Immunoglobulin Isotype svar i mus ved hjælp af enzym-forbundet Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...