Name: cell membrane repair assay using a two-photon laser microscope
Uploaded: 2018-01-02T15:00:00
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Ce travail a été soutenu par l’Université de l’Alberta Faculté de médecine et dentisterie, les amis de Garrett Cumming Président fonds de recherche, HM Toupin neurologiques Science Research Chair Fund, dystrophie musculaire Canada, Fondation canadienne pour l’Innovation (FCI), Alberta Advanced Education and Technology (AET), instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), voyage de Jesse - la Fondation pour la génétique et thérapie cellulaire, les femmes et Health Research Institute enfants (WCHRI), et Alberta Innovates Health Solutions (AIHS ).
Nous tenons à remercier le Dr Steven Laval pour nous alimenter avec le plasmide dysferline pleine longueur. Nous tenons également à remercier le Dr Katsuya Miyake pour des conseils techniques.

Cellules fibroblastiques humaines utilisées dans cette étude ont été utilisés avec l’approbation de la Commission d’éthique humaine de la faculté de médecine et de dentisterie de l’Université de l’Alberta.
1. la transfection des cellules avec le plasmide DYSF pleine longueur
<ol>
	<li>Cellules fibroblastes en culture dans un flacon de T225 contenant 40 mL de milieux de culture - Eagle modifié (DMEM) de 36 mL Dulbecco, 4 mL de sérum fœtal (SVF) et 20 µL de pénicilline/st...

<ol>
	<li>Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+wounding+and+repair+in+pulmonary+diseases.">Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).</li><li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Membrane+Repair+in+Health+and+Disease.">Plasma Membrane Repair in Health and Disease.</a> Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).</li><li>McNeil, P. L., Ito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastrointestinal+cell+plasma+membrane+wounding+and+resealing+in+vivo.">Gastrointestinal cell plasma membrane wounding and resealing in vivo.</a> Gastroenterology. 96 (5 Pt 1), 1238-1248 (1989).</li><li>McNeil, P. L., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+emergency+response+team+for+membrane+repair.">An emergency response team for membrane repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (6), 499-505 (2005).</li><li>Cooper, S. T., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+Repair:+Mechanisms+and+Pathophysiology.">Membrane Repair: Mechanisms and Pathophysiology.</a> Physiol Rev. 95 (4), 1205-1240 (2015).</li><li>Geeraerts, M. D., Ronveaux-Dupal, M. F., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+free+Ca2++and+proteolysis+in+lethal+oxidative+injury+in+endothelial+cells.">Cytosolic free Ca2+ and proteolysis in lethal oxidative injury in endothelial cells.</a> Am J Physiol. 261 (5 Pt 1), C889-C896 (1991).</li><li>McDade, J. R., Archambeau, A., Michele, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+actin-cytoskeleton-dependent+recruitment+of+plasma+membrane-derived+dysferlin+at+wounds+is+critical+for+muscle+membrane+repair.">Rapid actin-cytoskeleton-dependent recruitment of plasma membrane-derived dysferlin at wounds is critical for muscle membrane repair.</a> FASEB J. 28 (8), 3660-3670 (2014).</li><li>Benninger, R. K., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+excitation+microscopy+for+the+study+of+living+cells+and+tissues.">Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues.</a> Curr Protoc Cell Biol. Chapter 4 (Unit 4), 11-24 (2013).</li><li>Demonbreun, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+actin-dependent+annexin+complex+mediates+plasma+membrane+repair+in+muscle.">An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle.</a> J Cell Biol. 213 (6), 705-718 (2016).</li><li>McNeil, P. L., Khakee, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruptions+of+muscle+fiber+plasma+membranes.+Role+in+exercise-induced+damage.">Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage.</a> Am J Pathol. 140 (5), 1097-1109 (1992).</li><li>Rodriguez, A., Webster, P., Ortego, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysosomes+behave+as+Ca2+-regulated+exocytic+vesicles+in+fibroblasts+and+epithelial+cells.">Lysosomes behave as Ca2+-regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells.</a> J Cell Biol. 137 (1), 93-104 (1997).</li><li>Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+repair+is+mediated+by+Ca(2+)-regulated+exocytosis+of+lysosomes.">Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes.</a> Cell. 106 (2), 157-169 (2001).</li><li>Bansal, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+membrane+repair+in+dysferlin-deficient+muscular+dystrophy.">Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy.</a> Nature. 423 (6936), 168-172 (2003).</li><li>Han, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlin-mediated+membrane+repair+protects+the+heart+from+stress-induced+left+ventricular+injury.">Dysferlin-mediated membrane repair protects the heart from stress-induced left ventricular injury.</a> J Clin Invest. 117 (7), 1805-1813 (2007).</li><li>Huynh, C., Roth, D., Ward, D. M., Kaplan, J., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+lysosomal+exocytosis+and+plasma+membrane+repair+in+Chediak-Higashi/beige+cells.">Defective lysosomal exocytosis and plasma membrane repair in Chediak-Higashi/beige cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (48), 16795-16800 (2004).</li><li>Corrotte, M., Castro-Gomes, T., Koushik, A. B., Andrews, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+plasma+membrane+wounding+and+assessment+of+lysosome-mediated+repair+responses.">Approaches for plasma membrane wounding and assessment of lysosome-mediated repair responses.</a> Methods Cell Biol. 126, 139-158 (2015).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Jontes, J. D., Buchanan, J., Smith, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+cone+and+dendrite+dynamics+in+zebrafish+embryos:+early+events+in+synaptogenesis+imaged+in+vivo.">Growth cone and dendrite dynamics in zebrafish embryos: early events in synaptogenesis imaged in vivo.</a> Nat Neurosci. 3 (3), 231-237 (2000).</li><li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation.">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14 (5), 1808-1817 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Miyake, K., Vogel, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+endomembrane+requirement+for+cell+surface+repair.">The endomembrane requirement for cell surface repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (8), 4592-4597 (2003).</li><li>Weisleder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+MG53-mediated+cell+membrane+repair+using+in+vivo+and+in+vitro+systems.">Visualization of MG53-mediated cell membrane repair using in vivo and in vitro systems.</a> J Vis Exp. (52), (2011).</li><li>Matsuda, C., Kiyosue, K., Nishino, I., Goto, Y., Hayashi, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlinopathy+Fibroblasts+Are+Defective+in+Plasma+Membrane+Repair.">Dysferlinopathy Fibroblasts Are Defective in Plasma Membrane Repair.</a> PLoS Curr. 7, (2015).</li><li>Philippi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysferlin-deficient+immortalized+human+myoblasts+and+myotubes+as+a+useful+tool+to+study+dysferlinopathy.">Dysferlin-deficient immortalized human myoblasts and myotubes as a useful tool to study dysferlinopathy.</a> PLoS Curr. 4, RRN1298 (2012).</li><li>Cai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MG53+nucleates+assembly+of+cell+membrane+repair+machinery.">MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery.</a> Nat Cell Biol. 11 (1), 56-64 (2009).</li><li>Swaggart, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Annexin+A6+modifies+muscular+dystrophy+by+mediating+sarcolemmal+repair.">Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (16), 6004-6009 (2014).</li><li>Roostalu, U., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+molecular+interactions+at+damaged+sarcolemma.">In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma.</a> Dev Cell. 22 (3), 515-529 (2012).</li><li>Azakir, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+dispensability+of+dysferlin+C2+domains+reveals+rational+design+for+mini-dysferlin+molecules.">Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).</li><li>Lee, J., Yokota, T., Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+6.">Ch 6.</a> Translational Research in Muscular Dystrophy. , 87-102 (2016).</li><li>Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+research+and+therapeutic+perspectives+in+dysferlinopathies.">Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies.</a> Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).</li></ol>

Deux photons laser blessant de la membrane cellulaire est une technique précise et polyvalente pour évaluer la dynamique de la membrane rescellage in vitro. Dans cet article, nous avons décrit un protocole pour déterminer la membrane de la cellule rescellement de capacité dans les cellules de patients dysferlinopathy en utilisant le deux photons laser blessant dosage. Nos résultats montrent que les patients cellules dysferlinopathy sont défectueuses dans la membrane cellulaire de réapposition de sceau, q...

La membrane cellulaire des cellules eucaryotes est constitué d’une double couche de phospholipides parsemées de protéine qui définit l’environnement intra/extracellulaire de la cellule et est essentielle pour maintenir la survie cellulaire de l’homéostasie et de la cellule. Membrane cellulaire blessures dus aux insultes mécaniques ou chimiques sont monnaie courante dans les divers types de cellules de mammifères, y compris squelettique et muscle cardiaque, estomac et poumon cellules1,2,3,4. En plus des blessures consécutives à une fonction physiologique quotidienne, membranes cellulaires peuvent également être endommagés par insultes environnementales, des toxines bactériennes et ischémie reperfusion5. Défaut de refermer les ruptures dans la membrane cellulaire conduit à un afflux non réglementé d’extracellulaire Ca2 +- ainsi que d’autres composants extracellulaires potentiellement toxiques - dans la cellule, cascades de signal en aval qui peuvent se traduire rapidement par cellule de déclenchement mort1,4,5,6.
A ce jour, il y a eu plusieurs modèles proposés pour la réparation de membrane de cellules. Les mécanismes de réparation différents peuvent être activés selon la taille et la nature de la rupture des membranes. Par exemple, il est suggéré que les membranes cellulaires peut utiliser écoulement latéral ou protéine colmatage pour réparer les petites perturbations (&#60; 1 nm). Le modèle de fusion latérale propose que les ruptures de la membrane sont rapidement mandés par le biais de recrutement latéral dysferline contenant de la membrane7, tandis que la protéine colmatage modèle suggère que les petites perforations sont mandées par agrégations de protéine (surtout ANNEXINES) 8. à l’inverse, déclenchent des lésions plus grandes de membrane Ca2 +-la fusion des vésicules dépendants, dysferline médiation et formation d’un patch de réparation. Dans le modèle de patch de réparation, un influx de Ca2 + rapid dans la cellule déclenche le recrutement de plusieurs protéines (dysferline, ANNEXINES, mitsugumin-53 et protéines EDH) qui forment un complexe ou la « tache », ainsi qu’une fusion des vésicules intracellulaires ou lysosomes sur le site de membrane endommagent4,9,10,11,12. Il est important de noter que ces modèles ne sont pas nécessairement mutuellement exclusifs et peuvent travailler de concert afin de faciliter la réparation de la membrane. Défaut de resceller correctement les dommages de la membrane cellulaire est associée à plusieurs états pathologiques, y compris la dystrophie musculaire (dysferlinopathy - y compris la myopathie Miyoshi, ceintures dystrophie musculaire type IIB et myopathie distale avec apparition tibiale antérieure) 13,14de la cardiomyopathie et syndrome de Chediak-Higashi syndrome (CHS)15.
Compte tenu de cette intégrité de la membrane de la cellule appropriée et rescellage fois un rôle si important dans la santé et la maladie, une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents de la membrane cellulaire de réparation serait bénéfique à la recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques. Il est, par conséquent, nécessaire de posséder des techniques expérimentales appropriées pour suivre la cinétique et d’évaluer la capacité de réparation de la membrane cellulaire. Plusieurs méthodes in vitro pour la modélisation de réparation de membrane ont été conçus. Une stratégie implique une lésion mécanique, qui peut être facilitée par la cellule gratter avec un lame pipette/chirurgie/rasoir ou en faisant rouler les billes de verre sur les cellules16. Toutefois, ce type de lésion mécanique génère des lésions plus grandes et crée un haut degré de variation dans les lésions des cellules, aussi bien au sein et entre les cultures.
Une autre méthode de génération des plaies de la membrane est ablation laser par microscopie biphotonique. Contrairement à la microscopie confocal laser traditionnel qui emploie l’excitation monophotonique, le deux photons laser utilise simultanément deux photons de longueur d’onde, faible consommation d’énergie pour faciliter l’excitation d’un électron à haute énergie17. Ce processus non linéaire aboutit à excitation exclusivement dans le plan focal et non pas suivant le trajet de la lumière toute17 (Figure 1). Cela réduit l’excitation volume contribue à réduire le photovieillissement lors de l’imagerie de cellules vivantes18,19. Les chercheurs sont donc en mesure de générer des lésions précises dans la membrane cellulaire et moniteur membrane rescellage en temps réel en utilisant des colorants fluorescents et en observant les changements dans l’intensité de fluorescence, les ruptures de la membrane cellulaire, puis rescellages.
Cette approche a été utilisée à plusieurs reprises pour étudier la membrane blessant in vitro et in vivo et dans la cellule plusieurs types20,21. Par exemple, membrane réparer les défauts de fibroblastes et de myotubes, dérivés de dysferlinopathy, les patients ont été évalués à l’aide de cette technique22,23. Également, les fibres musculaires simples isolés de souris ont été utilisées pour contrôler réparation patch formation13,24,25. La circulation des protéines fluorescent étiquetées peut également être observée lors de la réparation de la membrane en fibres musculaires simples9. En outre, le processus de réparation du sarcolemme, suite à deux photons laser blessant dans des embryons de poisson-zèbre s’observe en temps réel en vivo26.
Dans cet article, nous décrivons une méthode d’évaluation dynamique de réparation de membrane cellulaire dans les fibroblastes en utilisant deux photons laser blessant, bien que cette méthodologie peut être appliquée à différents types de cellules dans le but de quantifier la membrane plasmique rescellage capacité in vitro. Dans cette méthode, les cellules sont incubées avec FM4-64, un colorant lipophile, cellule-imperméable qui rapidement produit une fluorescence tel qu’il se lie à négativement chargé des phospholipides dans le cytoplasme en entrant dans la cellule par l’intermédiaire de la lésion de la membrane (Figure 2&#38; 3). quantification de la fluorescence de colorant adjacente à la lésion de la membrane permet de contrôler le temps qu’il faut pour la membrane de la cellule à se refermer. Pour illustrer l’utilité de cette méthode, nous utilisons dysferlinopathy patient fibroblastes transfectées avec les plasmides de conjugaison GFP pleine longueur dysferline (DYSF) pour évaluer le sauvetage de réparation de la membrane cellulaire.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11320033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">35mm collagen-coated glass-bottom dishes</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P53GCOL-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Serum-deprived media</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15338100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">FM 4-64 Dye</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Tyrode&#8217;s Salts Solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T2397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Chameleon Two-photon laser</td>
			<td style="width:71px;">Coherent</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell membrane repair assay using a two-photon laser microscope

Nombreuses insultes physiopathologiques peuvent causer des dommages aux membranes cellulaires et, lorsqu’il est couplé avec des défauts innées dans la réparation de la membrane cellulaire ou l’intégrité, peuvent entraîner la maladie. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents qui entourent la réparation de la membrane cellulaire est donc un objectif important pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies liées à la dynamique de la membrane de cellules dysfonctionnelles. De nombreuses études in vitro et in vivo , afin de comprendre la membrane cellulaire rescellage dans divers contextes de maladie utilisent ablation laser deux photons comme une norme pour la détermination des résultats fonctionnels après des traitements expérimentaux. Dans cet essai, membranes cellulaires subissent coups et blessures avec un laser à deux photons, qui provoque la membrane cellulaire se rompre et colorant fluorescent s’infiltrer dans la cellule. L’intensité de la fluorescence au sein de la cellule peut être ensuite surveillée afin de quantifier la capacité de la cellule à se refermer. Il existe plusieurs autres méthodes pour évaluer la réponse de membrane cellulaire à des blessures, ainsi que grande variation dans le deux photons laser blessant approche lui-même, par conséquent, un modèle unifié de cellule blessant servirait avantageusement pour diminuer la variation entre ces méthodes. Dans cet article, nous décrivons un laser à deux photons simple blessant protocole pour évaluer la membrane cellulaire réparation in vitro à la fois sain et dysferlinopathy patients fibroblastes cellules transfectées avec ou sans un plasmide dysferline pleine longueur.

Les fibroblastes humains en bonne santé, fibroblastes de patients non traités dysferlinopathy et patients fibroblastes transfectées avec un plasmide contenant la séquence de la dysferline pleine longueur ont été soumis à deux photons laser blessant pour évaluer la membrane rescellage capacité en temps réel. Cellules de fibroblaste humain sain affichent faibles niveaux d’activation de fluorescence FM 4-64 après laser blessant et de fibroblastes de patients non traités présen...

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Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Essai de réparation Membrane cellulaire à l’aide d’un Microscope biphotonique Laser

Membrane cellulaire blessant par deux photons laser est une méthode largement utilisée pour évaluer la capacité de fermeture membrane et peut être appliquée à plusieurs types de cellules. Nous décrivons ici un protocole pour in vitro en direct-imagerie de membrane réapposition de sceau sur dysferlinopathy patients cellules après l’ablation de deux photons laser.

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

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Enquête mât cellules sécrétoires granulés; de biosynthèse d&#39;exocytose

Mast Cells (MC) are secretory cells of the immune system that accomplish their physiological and pathological functions by releasing pre-formed and newly ...

Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

À long terme intravitale microscopie multiphotonique imagerie des cellules immunitaires dans sains et malades du foie en utilisant des souris CXCR6.Gfp Reporter

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilisation d&#39;un test basé sur la cytométrie de flux

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test pour la détection de cellules T spécifiques de l’antigène fonction cytolytique en utilisant un modèle de Vaccination

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Two-photon Imaging intravitale des leucocytes au cours de la réponse immunitaire dans le foie de souris traitées Lipopolysaccharide

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Caractérisation des Thymus-dépendants et indépendants de Thymus immunoglobuline Isotype réponses chez la souris à l’aide d’Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...