Name: cell membrane repair assay using a two-photon laser microscope
Uploaded: 2018-01-02T15:00:00
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Diese Arbeit wurde von Universität von Alberta Fakultät für Medizin und Zahnmedizin, die Freunde von Garrett Cumming Stuhl Forschungsfonds, HM Toupin neurologische Forschung Stuhl Wissenschaftsfonds, muskulöse Dystrophie Kanada, Canada Foundation für Innovation (CFI) unterstützt, Alberta erweiterte Bildung und Technologie (AET), kanadische Institute der Gesundheitsforschung (CIHR), Jesse Reise - die Grundlage für gen und Zelltherapie, die Frauen und Kinder Health Research Institute (WCHRI) und Alberta Health Solutions (AIHS erneuert ).
Wir möchten Dr. Steven Laval danken für die Bereitstellung von uns mit dem Full-length Dysferlin-Plasmid. Wir möchten auch Dr. Katsuya Miyake für technische Beratung bedanken.

In dieser Studie verwendete menschlichen Fibroblastenzellen wurden mit Zustimmung der menschlichen Ethik-Kommission der Fakultät für Medizin und Zahnmedizin an der Universität von Alberta eingesetzt.
1. die Transfektion von Zellen mit durchgehender DYSF plasmid
<ol>
	<li>Kultur-Fibroblastenzellen in einem T225 Kolben mit 40 mL Wachstumsmedien - 36 mL Dulbecco geändert Eagle Medium (DMEM), 4 mL des fetalen bovine Serum (FBS) und 20 µL von Penicillin/Streptomycin (P/S) - in einem CO2...

<ol>
	<li>Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+wounding+and+repair+in+pulmonary+diseases.">Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).</li><li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Membrane+Repair+in+Health+and+Disease.">Plasma Membrane Repair in Health and Disease.</a> Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).</li><li>McNeil, P. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+dispensability+of+dysferlin+C2+domains+reveals+rational+design+for+mini-dysferlin+molecules.">Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).</li><li>Lee, J., Yokota, T., Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+6.">Ch 6.</a> Translational Research in Muscular Dystrophy. , 87-102 (2016).</li><li>Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+research+and+therapeutic+perspectives+in+dysferlinopathies.">Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies.</a> Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).</li></ol>

Zwei-Photonen-Laser Verwundung der Zellmembran ist eine genaue und vielseitige Technik für die Beurteilung der Dynamik der Membran Wiederverschließen in Vitro. In diesem Artikel beschriebenen wir ein Protokoll für die Bestimmung der Zellmembran Wiederverschließen Fähigkeit in Dysferlinopathie Patientenzellen mit dem zwei-Photonen-Laser Verwundung Assay. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Dysferlinopathie Patienten Zellen Defekt in Zellmembran Wiederverschließen, das steht im Einklang mit Ergebnissen von andere...

Die Zellmembran der eukaryotischen Zellen besteht aus einer Doppelschicht Protein besetzte Phospholipide, die definiert der Intra-/extrazellulären Umgebung der Zelle und ist unerlässlich für die Aufrechterhaltung der zelluläre Homöostase und Zelle überleben. Zellmembran Verletzungen infolge mechanischer oder chemischer Beleidigungen sind an der Tagesordnung in verschiedenen Säugetier-Zelle Arten, einschließlich Skelett- und Herzmuskulatur, Magen und Lunge Zellen1,2,3,4. Neben Verletzungen konsequente tägliche physiologische Funktion können Zellmembranen auch durch ökologische Beleidigungen, bakterielle Toxine und ischämische Reperfusion5beschädigt werden. Brüche in der Zellmembran verschließen führt zu einem unregulierten Zustrom von extrazellulären Ca2 +- zusammen mit anderen potentiell toxischen extrazellulären Komponenten - in die Zelle auslösen nachgeschalteter Signalkaskaden, die schnell in Zelle führen kann Tod,1,4,5,6.
Bisher gab es mehrere vorgeschlagenen Modelle für Membran-Reparatur in den Zellen. Je nach Größe und Art der Membran Ruptur können verschiedene Reparaturmechanismen aktiviert werden. Es wird beispielsweise vorgeschlagen, Zellmembranen lateral Flow oder Protein um kleine Störungen beheben Verstopfung nutzen kann (&#60; 1 nm). Die laterale Fusion-Modell schlägt vor, dass Membran Brüche durch die seitliche Einstellung des Dysferlin-haltigen schnell geflickt sind Membran7, während das Protein Verstopfung Modell schlägt vor, dass kleine Perforationen durch Protein Aggregationen geflickt werden (meist Polymerasen) 8. dagegen größere Membran Läsionen auslösen Ca2 +-abhängige, Dysferlin-vermittelten Vesicle Fusion und Bildung eines Reparatur-Patch. In der Reparatur-Patch-Modell löst ein schnelle Ca2 + Zustrom in die Zelle die Rekrutierung von mehrere Proteine (Dysferlin Polymerasen, Mitsugumin-53 und EDH Proteine) bilden ein komplexes oder "Patch", zusammen mit einer Fusion von intrazellulären Vesikeln oder Lysosomen an der Stelle der Membran beschädigt werden4,9,10,11,12. Es ist wichtig zu beachten, dass diese Modelle nicht notwendigerweise gegenseitig ausschließen sind und in Konzert funktionieren, Membran-Reparatur zu erleichtern. Nichtbeachtung der Zellmembran Schäden ordnungsgemäß zu verschließen ist verbunden mit mehreren Krankheitszuständen, einschließlich Muskeldystrophie (Dysferlinopathie - einschließlich Miyoshi Myopathie, Gliedmaßen-Gürtel Muskeldystrophie Typ IIB und distalen Myopathie mit vorderen tibiale einsetzen) 13, Kardiomyopathie14und Chediak-Higashi-Syndrom (CHS)15.
In Anbetracht, dass richtige Zellmembran Integrität und Wiederverschließen spielt eine wichtige Rolle in Gesundheit und Krankheit, ein tieferes Verständnis für die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der Zellmembran Reparatur nützlich bei der Suche nach neue therapeutische Strategien wäre. Deshalb ist es notwendig, geeignete experimentelle Techniken zur Überwachung der Kinetics und bewerten die Fähigkeit der Zellmembran Reparatur zu besitzen. Mehrere in-vitro- Methoden zur Modellierung von Membran-Reparatur sind entworfen worden. Eine Strategie beinhaltet die mechanische Verletzungen, die durch die Zelle zu kratzen, mit einer Pipette/chirurgische Messer/Rasiermesser oder durch die Zellen16Glasperlen überrollen erleichtert werden kann. Jedoch diese Art von mechanischen Verletzungen erzeugt größere Läsionen, und schafft ein hohes Maß an Variation Zelle Verletzung, sowohl innerhalb als auch zwischen den Kulturen.
Eine weitere Methode zur Generierung von Membran Wunden ist Laser-Ablation durch zwei-Photonen-Mikroskopie. Im Gegensatz zu traditionellen konfokale Lasermikroskopie, das einzelne Photon Erregung beschäftigt, nutzt die zwei-Photonen-Laser gleichzeitig zwei langwellige, Niedrigenergie-Photonen, um die Anregung einer hochenergetischen Elektronen17zu erleichtern. Diese nichtlinearen Prozess führt zu Erregung ausschließlich in der Brennebene und nicht entlang der gesamten Lichtweg17 (Abbildung 1). Dies reduziert Erregung Volumen hilft lichtbedingten minimieren beim lebenden Zellen18,19abbilden. Forscher sind daher in der Lage, präzise Läsionen in der Zellmembran und Monitor Membran Wiederverschließen in Echtzeit durch die Verwendung von fluoreszierender Farbstoffen und Beobachtung von Veränderungen in der Fluoreszenzintensität als die Zellmembran Brüche und dann Sicherheitsventilen zu generieren.
Dieser Ansatz wurde wiederholt verwendet, um die Membran Verwundung in Vitro und in Vivo zu untersuchen und mehrere Zelle eingibt20,21. Z. B. Membran reparieren defekte in Fibroblasten und Myotubes, abgeleitet von Dysferlinopathie, die Patienten wurden anhand dieser Technik22,23. Darüber hinaus wurden einzelne Muskelfasern von Mäusen isoliert verwendet, um Reparatur Patch Bildung13,24,25zu überwachen. Die Bewegung der Gewebekulturen tagged Proteine kann auch während der Reparatur der Membran in einzelnen Muskelfasern9beobachtet werden. Darüber hinaus kann der Prozess der sarcolemmal Reparatur nach zwei-Photonen-Laser Verwundung in den Zebrafish Embryos in Echtzeit in Vivo26beobachtet werden.
In diesem Artikel beschreiben wir eine Methodik für die Bewertung der Zellmembran Reparatur Dynamik in Fibroblasten mit zwei-Photonen-Laser verletzt wurden, obwohl diese Methodik zu verschiedenen Zelltypen zur Quantifizierung der Plasmamembran Wiederverschließen Fähigkeit angewendet werden können in Vitro. Bei dieser Methode werden mit FM4-64 Zellen inkubiert, ein lipophiler, Zelle-undurchlässigen Farbstoff, der schnell fluoresziert wie es an negativ bindet aufgeladen Phospholipide im Zytoplasma beim Eintritt in der Zelle durch die Membran-Läsion (Abbildung 2&#38; 3). Quantifizierung der Farbstoff Fluoreszenz angrenzend an die Membran Läsion ermöglicht eine Überwachung der Zeit, die für die Zellmembran zu selbst zu verschließen. Um das Dienstprogramm dieser Methode zu veranschaulichen, verwenden wir Dysferlinopathie Patienten Fibroblasten transfiziert mit GFP konjugiert in voller Länge Dysferlin (DYSF) Plasmide um die Rettung der Zellmembran Reparatur zu beurteilen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11320033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">35mm collagen-coated glass-bottom dishes</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P53GCOL-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Serum-deprived media</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15338100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">FM 4-64 Dye</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Tyrode&#8217;s Salts Solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T2397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Chameleon Two-photon laser</td>
			<td style="width:71px;">Coherent</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell membrane repair assay using a two-photon laser microscope

Zahlreichen pathophysiologische Beleidigungen können Zellmembranen schädigen und Verbindung mit angeborenen Defekten in Zellmembran Reparatur oder Integrität, können zu Krankheit führen. Verständnis der zugrunde liegenden molekularen Mechanismen, die umgebenden Zellmembran Reparatur ist daher ein wichtiges Ziel für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für Erkrankungen, die mit dysfunktionalen Zellmembran Dynamik. Viele in Vitro und in Vivo Studien zum Ziel zu verstehen, Zellmembran Wiederverschließen Krankheit Kontexten nutzen zwei-Photonen-Laser-Ablation als Standard für die Bestimmung der funktionellen Ergebnisse nach experimentellen Behandlungen. In diesem Assay unterliegen Zellmembranen Verwundung mit einem zwei-Photonen-Laser, wodurch die Zellmembran zu Bruch und fluoreszierenden Farbstoff in die Zelle einzudringen. Die Intensität der Fluoreszenz in der Zelle kann dann überwacht werden, um die Fähigkeit der Zelle zu verschließen sich quantifizieren. Gibt es mehrere alternative Methoden für die Beurteilung der Zellmembran als Reaktion auf Verletzungen, als auch große Unterschiede in der zwei-Photonen-Laser Verwundung Ansatz selbst, daher würde ein einheitliches Modell der Zelle Verwundung nutzbringend zu verringern dienen der Unterschiede zwischen den beiden Methoden. In diesem Artikel beschreiben wir einen einfache zwei-Photonen-Laser Verwundung Protokoll für die Beurteilung der Zellmembran Reparatur in Vitro in beide gesund und Dysferlinopathie Patienten Fibroblasten, Zellen mit oder ohne ein in voller Länge Dysferlin-Plasmid transfiziert.

Gesunde menschliche Fibroblasten, unbehandelten Dysferlinopathie Patienten Fibroblasten und Patienten Fibroblasten transfiziert mit einem Plasmid mit die Full-length Dysferlin-Sequenz ausgesetzt waren zwei-Photonen-Laser Verwundung Membran Wiederverschließen Fähigkeit zu bewerten in Echtzeit. Gesunde menschliche Fibroblastenzellen angezeigt niedrigen Niveau von FM 4-64 Fluoreszenz Aktivierung nach Laser Verwundung und unbehandelten Patienten Fibroblasten zeigte ein hohes Maß an relativ...

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Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Zellmembran Reparatur Assays mit einem zwei-Photonen-Laser-Mikroskop

Zellmembran Verwundung über zwei-Photonen-Laser ist eine weit verbreitete Methode für die Bewertung der Membran Wiederverschließen Fähigkeit und kann auf mehrere Zelltypen angewendet werden. Hier beschreiben wir ein Protokoll für in-vitro- live-Aufnahmen von Membran Wiederverschließen in Dysferlinopathie Patientenzellen nach zwei-Photonen-Laser-Ablation.

Numerous pathophysiological insults can cause damage to cell membranes and, when coupled with innate defects in cell membrane repair or integrity, can ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Cell Free Assay System Estimating the Neutralizing Capacity of GM-CSF Antibody using Recombinant Soluble GM-CSF Receptor

Einem zellfreien Assay System Schätzung der neutralisierende Wirkung von GM-CSF Antikörper mit rekombinanten löslichen GM-CSF-Rezeptor

BACKGROUNDS: Previously, we demonstrated that neutralizing capacity but not the concentration of GM-CSF autoantibody was correlated with the disease ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Ein Visual Assay zur T6SS-vermittelte bakterielle Wettbewerb überwachen

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Monitoring Changes in Membrane Polarity, Membrane Integrity, and Intracellular Ion Concentrations in Streptococcus pneumoniae Using Fluorescent Dyes

Überwachen von Änderungen in Membran-Polarity, Membrane Integrity und intrazelluläre Ionenkonzentrationen in<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Verwenden von Fluoreszenzfarbstoffen

Membrane depolarization and ion fluxes are events that have been studied extensively in biological systems due to their ability to profoundly impact ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

Konformationsänderungen Auswertung der HIV-1-Trimeric Hüllglycoproteine ​​mit eine Handy-basierte ELISA-Test

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Investigating Mast Cell Secretory Granules; from Biosynthesis to Exocytosis

Untersuchung Mast Cell Sekretgranula; von Biosynthese zu Exocytosis

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Long Term Intravital Multiphoton Microscopy Imaging of Immune Cells in Healthy and Diseased Liver Using CXCR6.Gfp Reporter Mice

Langzeitintravital Multiphotonen Mikroskopie Imaging von Immunzellen in gesunden und kranken Leber Mit CXCR6.Gfp Reporter Mäuse

Liver inflammation as a response to injury is a highly dynamic process involving the infiltration of distinct subtypes of leukocytes including monocytes, ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em&gt; In Vivo</em&gt; Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Test zum Nachweis von Antigen-spezifischen T-Zell Zytolyse-Funktion mit einer Impfung-Modell

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Zwei-Photon intravitalen Bildgebung der Leukozyten im Rahmen der Immunantwort in Lipopolysaccharid behandelt Maus Leber

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Charakterisierung der Thymus-abhängig und Thymus-unabhängige Immunglobulin Isotype Antworten bei Mäusen mit Enzym-linked Immunosorbentprobe Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...