Name: cell membrane repair assay using a two-photon laser microscope
Uploaded: 2018-01-02T15:00:00
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Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Alberta faculdade de medicina e odontologia, os amigos de Garrett Cumming cadeira fundo de pesquisa, HM Toupin fundo de cadeira de pesquisa neurológica de ciência, Distrofia Muscular Canadá, Canadá Foundation para inovação (CFI), Alberta educação e tecnologia avançada (AET), institutos canadenses de pesquisa em saúde (CIHR), viagem de Jesse - Fundação para o Gene e terapia celular, as mulheres e Instituto de pesquisa de saúde infantil (WCHRI), e Alberta inova saúde soluções (AIHS ).
Gostaríamos de agradecer o Dr. Steven Laval para nos fornecer o plasmídeo dysferlin completos. Também gostaríamos de agradecer o Dr. Katsuya Miyake para aconselhamento técnico.

Células de fibroblastos humanos utilizadas neste estudo foram utilizadas com aprovação do Comitê de ética humana da faculdade de medicina e Odontologia da Universidade de Alberta.
1. transfecção de células com longa-metragem do plasmídeo DYSF
<ol>
	<li>Células de cultura de fibroblastos num balão de T225 contendo 40 mL de meio de crescimento - de mL 36 Dulbecco modificado águia médio (DMEM), 4 mL de soro fetal bovino (FBS) e 20 µ l de penicilina/estreptomicina (P/S) - numa incu...

<ol>
	<li>Cong, X., Hubmayr, R. D., Li, C., Zhao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+membrane+wounding+and+repair+in+pulmonary+diseases.">Plasma membrane wounding and repair in pulmonary diseases.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 312 (3), L371-L391 (2017).</li><li>Demonbreun, A. R., McNally, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+Membrane+Repair+in+Health+and+Disease.">Plasma Membrane Repair in Health and Disease.</a> Curr Top Membr. 77, 67-96 (2016).</li><li>McNeil, P. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular+dispensability+of+dysferlin+C2+domains+reveals+rational+design+for+mini-dysferlin+molecules.">Modular dispensability of dysferlin C2 domains reveals rational design for mini-dysferlin molecules.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27629-27636 (2012).</li><li>Lee, J., Yokota, T., Takeda, S., Miyagoe-Suzuki, Y., Mori-Yoshimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch+6.">Ch 6.</a> Translational Research in Muscular Dystrophy. , 87-102 (2016).</li><li>Barthelemy, F., Wein, N., Krahn, M., Levy, N., Bartoli, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+research+and+therapeutic+perspectives+in+dysferlinopathies.">Translational research and therapeutic perspectives in dysferlinopathies.</a> Mol Med. 17 (9-10), 875-882 (2011).</li></ol>

Dois fotões laser ferindo da membrana celular é uma técnica precisa e versátil para avaliar a dinâmica da membrana em vitrode fechamento. Neste artigo, descrevemos um protocolo para a determinação da membrana celular, habilidade em dysferlinopathy paciente células usando o laser de dois fotões ferindo o ensaio de fechamento. Nossos resultados mostram que a paciente células dysferlinopathy são defeituosas na membrana celular de fechamento, que é consistente com resultados por outros pesquisadores e qu...

A membrana celular das células eucarióticas é composto por uma camada dupla de fosfolipídios cravejado de proteína que define o ambiente intra/extracelular da célula e é essencial para manter a sobrevivência celular de homeostase e célula. Membrana celular lesões decorrentes de insultos mecânicos ou químicos são comuns em vários tipos de células de mamíferos, incluindo esquelético e músculo cardíaco, estômago e pulmão células1,2,3,4. Além de lesões consequentes para funções fisiológicas diárias, as membranas das células também podem ser danificadas por insultos ambientais, toxinas bacterianas e reperfusão isquêmica5. Falha de selar rupturas na membrana celular leva ao influxo não regulamentado de extracelular Ca2 +- juntamente com outros componentes extracelulares potencialmente tóxicos - dentro da célula, desencadeando cascatas de sinal a jusante que rapidamente podem resultar em células morte1,4,5,6.
Até à data, tem havido vários modelos propostos para o reparo de membrana nas células. Mecanismos de reparação diferentes podem ser ativados, dependendo do tamanho e da natureza da ruptura da membrana. Por exemplo, sugere-se que as membranas celulares podem utilizar fluxo lateral ou proteína entupimento para reparar pequenas interrupções (&#60; 1 nm). O modelo de fusão lateral propõe que rupturas de membrana são rapidamente reparadas através de recrutamento lateral de dysferlin contendo membrana7, enquanto a proteína entupimento modelo sugere que pequenas perfurações são remendadas através de agregações de proteínas (principalmente anexinas) 8. Inversamente, desencadear lesões maiores de membrana Ca2 +-dependente, mediada por dysferlin vesículas fusão e formação de um remendo do reparo. No modelo de remendo de reparação, um rápida Ca2 + influxo para a célula dispara o recrutamento de várias proteínas (dysferlin, anixinas, mitsugumin-53 e proteínas EDH) que formam um complexo ou "patch", juntamente com uma fusão de vesículas intracelulares ou lisossomos no local da membrana danificar4,9,10,11,12. É importante notar que estes modelos não são necessariamente mutuamente exclusivos e podem trabalhar em conjunto para facilitar a reparação da membrana. Falha de selar corretamente o dano da membrana celular está associada a vários Estados da doença, incluindo distrofia muscular (dysferlinopathy - incluindo Miyoshi miopatia, membro-cinta distrofia muscular tipo IIB e miopatia distal com início tibial anterior) 13, cardiomiopatia14e Chediak-Higashi síndrome (CHS)15.
Dada essa integridade adequada da membrana celular e peças de fechamento um papel tão importante na saúde e na doença, uma compreensão mais profunda dos mecanismos moleculares subjacentes do reparo da membrana celular seria benéfica na busca de novas estratégias terapêuticas. É, portanto, necessário possuir técnicas experimentais adequadas para a cinética de monitorar e avaliar a capacidade de reparação da membrana celular. Vários métodos em vitro para reparação de membrana de modelagem foram projetados. Uma estratégia envolve lesão mecânica, que pode ser facilitado através da célula a raspar com uma lâmina/navalha pipeta/cirúrgico ou pelo rolamento esferas de vidro sobre as células de16. No entanto, este tipo de lesão mecânica gera lesões maiores e cria um elevado grau de variação no ferimento da pilha, tanto dentro como entre culturas.
Outro método de gerar feridas de membrana é ablação a laser por microscopia de dois fotões. Em contraste com a microscopia confocal laser tradicional que emprega a excitação de fóton único, o laser de dois fotões usa simultaneamente dois fótons de comprimento de onda longa, baixo consumo de energia para facilitar a excitação de um elétron de alta energia17. Este processo não-linear resulta em excitação exclusivamente dentro do plano focal e não ao longo do trajeto da luz toda17 (Figura 1). Este reduzido excitação volume ajuda a minimizar Fotodano quando de imagens ao vivo de células18,19. Pesquisadores, portanto, são capazes de gerar lesões precisas na membrana celular e monitor membrana efectuou em tempo real usando corantes fluorescentes e observar as alterações da intensidade de fluorescência como a ruptura da membrana celular e, depois, regenere.
Esta abordagem tem sido usada repetidamente para estudar a membrana ferindo em vitro e em vivo e em célula de vários tipos de20,21. Por exemplo, a membrana reparar defeitos em fibroblastos e myotubes derivado de dysferlinopathy, os pacientes foram avaliados utilizando esta técnica22,23. Também, única fibras musculares isoladas de ratos foram usadas para monitorar reparo remendo formação13,24,25. O movimento de proteínas fluorescente etiquetados também pode ser observado durante o reparo da membrana em fibras de músculo único9. Além disso, o processo de reparação mecanismos a seguir dois fotões laser ferindo em embriões de peixe-zebra pode ser observado em tempo real na vivo26.
Neste artigo, descrevem uma metodologia para avaliar a dinâmica de reparo da membrana celular em fibroblastos usando dois fotões laser ferindo, embora esta metodologia pode ser aplicada a vários tipos de células com a finalidade de quantificar a membrana plasmática, capacidade de fechamento em vitro. Neste método, as células são incubadas com FM4-64, um corante lipofílico, célula-impermeável que fluoresce rapidamente a como liga-se ao negativamente carregada de fosfolipídios no citoplasma ao entrar na célula através da lesão de membrana (Figura 2&#38; 3). quantificação da fluorescência do corante adjacente à lesão de membrana permite o monitoramento do tempo que leva para a membrana da célula de selar em si. Para exemplificar a utilidade desse método, usamos dysferlinopathy paciente fibroblastos transfectados com plasmídeos dysferlin completos GFP-conjugados (DYSF) para avaliar o resgate de reparo da membrana celular.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">11320033</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">35mm collagen-coated glass-bottom dishes</td>
			<td style="width:71px;">MatTek</td>
			<td style="width:119px;">P53GCOL-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Serum-deprived media</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Transfection reagent</td>
			<td style="width:71px;">Thermo Fisher</td>
			<td style="width:119px;">15338100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">FM 4-64 Dye</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Tyrode&#8217;s Salts Solution</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T2397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Confocal laser scanning microscope</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:243px;">Chameleon Two-photon laser</td>
			<td style="width:71px;">Coherent</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cell membrane repair assay using a two-photon laser microscope

Numerosos insultos fisiopatológicos podem danificar as membranas celulares e, quando combinada com defeitos inatos na reparação da membrana celular ou integridade, podem resultar em doença. Compreender os mecanismos moleculares subjacentes em torno de reparo da membrana celular, portanto, é um objectivo importante para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para doenças associadas à dinâmica disfuncional da membrana celular. Muitos estudos in vitro e em vivo vistos compreender a membrana celular de fechamento em diversos contextos de doença utilizam ablação a laser dois fotões como um padrão para determinar os resultados funcionais após tratamentos experimentais. Neste ensaio, as membranas celulares são sujeitas a ferindo com um laser de dois fotões, que faz com que a membrana da célula, ruptura e tintura fluorescente para se infiltrar na célula. A intensidade da fluorescência dentro da célula em seguida pode ser monitorada para quantificar a capacidade da célula de selar em si. Existem vários métodos alternativos para a avaliação da membrana celular resposta a lesão, bem como a grande variação na laser dois fotões ferindo abordagem em si, portanto, um modelo de célula ferindo unificada beneficamente serviria para diminuir o variação entre estas metodologias. Neste artigo, nós esboçamos um laser simples de dois fotões ferindo o protocolo para a avaliação da membrana celular reparação in vitro em ambos saudáveis e dysferlinopathy paciente fibroblastos células transfectadas com ou sem um plasmídeo dysferlin completos.

Fibroblastos humanos saudáveis, fibroblastos de pacientes não tratados dysferlinopathy e pacientes fibroblastos transfectados com um plasmídeo que contém a sequência de dysferlin completos foram submetidas a dois fotões laser ferindo para avaliar a capacidade de fechamento de membrana em tempo real. Células de fibroblasto humano saudável exibida baixos níveis de ativação de fluorescência FM 4-64 seguindo do laser ferindo e fibroblastos de pacientes não tratados exibiram um al...

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Cell Membrane Repair Assay Using a Two-photon Laser Microscope

Ensaio de reparação da membrana celular usando um microscópio de dois fotões Laser

Membrana celular ferindo através de dois fotões laser é um método amplamente utilizado para avaliar a capacidade de fechamento de membrana e pode ser aplicado a vários tipos de células. Aqui, descrevemos um protocolo para em vitro viver de imagem membrana efectuou em dysferlinopathy paciente células após ablação a laser de dois fotões.

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Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Avaliando Retinal microglia fagocítica Função<em&gt; In Vivo</em&gt; Usando um ensaio baseado em citometria de fluxo

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Na Vivo Ensaio para detecção de células T antígeno-específicas função citolítica usando um modelo de vacinação

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Imagem de Intravital dois fotões de leucócitos durante a resposta imune em fígado de rato lipopolissacarídeo-tratados

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...