Name: generation of genome-wide chromatin conformation capture libraries from tightly staged early drosophila embryos
Uploaded: 2018-10-03T13:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos at JoVE.com

تم تمويل هذا البحث من "جمعية ماكس بلانك". وأيد C.B.H. على زمالة من المدرسة البحوث الدولية ماكس بلانك – "الطب الحيوي الجزيئي". ونحن نشكر ليث شيلبي واريك ف. فيشاوس فازوا يرجى توفير خط melanogaster المورفولوجية اجفب منها.

<ol>
	<li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nat Rev Genet. 17 (11), 661-678 (2016).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Jin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+map+of+the+three-dimensional+chromatin+interactome+in+human+cells.">A high-resolution map of the three-dimensional chromatin interactome in human cells.</a> Nature. , (2013).</li><li>Rao, S. S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Map+of+the+Human+Genome+at+Kilobase+Resolution+Reveals+Principles+of+Chromatin+Looping.">A 3D Map of the Human Genome at Kilobase Resolution Reveals Principles of Chromatin Looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Darbellay, F., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+Domains,+Metagenes,+and+the+Emergence+of+Pleiotropic+Regulations+at+Hox+Loci.">Topological Domains, Metagenes, and the Emergence of Pleiotropic Regulations at Hox Loci.</a> Current topics in developmental biology. 116, 299-314 (2016).</li><li>Beagan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Genome+Topology+Can+Exhibit+an+Incompletely+Rewired+3D-Folding+State+during+Somatic+Cell+Reprogramming.">Local Genome Topology Can Exhibit an Incompletely Rewired 3D-Folding State during Somatic Cell Reprogramming.</a> Cell stem cell. 18 (5), 611-624 (2016).</li><li>Andrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+hundreds+of+regulatory+landscapes+in+developing+limbs+reveals+two+regimes+of+chromatin+folding.">Characterization of hundreds of regulatory landscapes in developing limbs reveals two regimes of chromatin folding.</a> Genome Res. 27 (2), 223-233 (2017).</li><li>Krijger, P. H. L., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome.">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li><li>Sexton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+folding+and+functional+organization+principles+of+the+Drosophila+genome.">Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome.</a> Cell. 148 (3), 458-472 (2012).</li><li>Ghavi-Helm, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+loops+appear+stable+during+development+and+are+associated+with+paused+polymerase.">Enhancer loops appear stable during development and are associated with paused polymerase.</a> Nature. 512 (7512), 96-100 (2014).</li><li>Foe, V. E., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+nuclear+and+cytoplasmic+behaviour+during+the+five+mitotic+cycles+that+precede+gastrulation+in+Drosophila+embryogenesis.">Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis.</a> J Cell Sci. 61, 31-70 (1983).</li><li>Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zygotic+Genome+Activation+Triggers+the+DNA+Replication+Checkpoint+at+the+Midblastula+Transition.">Zygotic Genome Activation Triggers the DNA Replication Checkpoint at the Midblastula Transition.</a> Cell. 160 (6), 1169-1181 (2015).</li><li>Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+maintenance+of+heritable+chromatin+structure+during+early+Drosophila+embryogenesis.">Establishment and maintenance of heritable chromatin structure during early Drosophila embryogenesis.</a> eLife. 5, e20148 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+Larva+Harvesting+and+Preparation.">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila melanogaster. , (2017).</li><li>Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Neuronal+Cultures+from+Midgastrula+Stage+Drosophila+Embryos.">Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (5), (2007).</li><li>Shermoen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Baskets+for+Drosophila+Egg+Collections,+Treatments,+and+Incubations.">Preparation of Baskets for Drosophila Egg Collections, Treatments, and Incubations.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (10), (2008).</li><li>Ay, F., Noble, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+methods+for+studying+the+3D+architecture+of+the+genome.">Analysis methods for studying the 3D architecture of the genome.</a> Genome biology. 16 (1), 183 (2015).</li><li>Lazaris, C., Kelly, S., Ntziachristos, P., Aifantis, I., Tsirigos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiC-bench:+comprehensive+and+reproducible+Hi-C+data+analysis+designed+for+parameter+exploration+and+benchmarking.">HiC-bench: comprehensive and reproducible Hi-C data analysis designed for parameter exploration and benchmarking.</a> BMC Genomics. 18 (1), (2017).</li><li>Servant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiC-Pro:+an+optimized+and+flexible+pipeline+for+Hi-C+data+processing.">HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C data processing.</a> Genome Biology. 16 (1), (2015).</li><li>Durand, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juicer+Provides+a+One-Click+System+for+Analyzing+Loop-Resolution+Hi-C+Experiments.">Juicer Provides a One-Click System for Analyzing Loop-Resolution Hi-C Experiments.</a> Cell systems. 3 (1), 95-98 (2016).</li><li>Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hitchhiker's+guide+to+Hi-C+analysis:+Practical+guidelines.">The Hitchhiker's guide to Hi-C analysis: Practical guidelines.</a> Methods. 72, 65-75 (2015).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopDom:+an+efficient+and+deterministic+method+for+identifying+topological+domains+in+genomes.">TopDom: an efficient and deterministic method for identifying topological domains in genomes.</a> Nucleic Acids Res. 44 (7), e70 (2016).</li><li>Kruse, K., Hug, C. B., Hern&#225;ndez-Rodr&#237;guez, B., Vaquerizas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TADtool:+visual+parameter+identification+for+TAD-calling+algorithms.">TADtool: visual parameter identification for TAD-calling algorithms.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3190-3192 (2016).</li><li>L&#233;vy-Leduc, C., Delattre, M., Mary-Huard, T., Robin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+segmentation+for+analyzing+Hi-C+data.">Two-dimensional segmentation for analyzing Hi-C data.</a> Bioinformatics. 30 (17), i386-i392 (2014).</li><li>Filippova, D., Patro, R., Duggal, G., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+alternative+topological+domains+in+chromatin.">Identification of alternative topological domains in chromatin.</a> Algorithms for molecular biology: AMB. 9 (1), 14 (2014).</li><li>Crane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensin-driven+remodelling+of+X+chromosome+topology+during+dosage+compensation.">Condensin-driven remodelling of X chromosome topology during dosage compensation.</a> Nature. 523 (7559), 240-244 (2015).</li><li>Durand, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juicebox+Provides+a+Visualization+System+for+Hi-C+Contact+Maps+with+Unlimited+Zoom.">Juicebox Provides a Visualization System for Hi-C Contact Maps with Unlimited Zoom.</a> Cell systems. 3 (1), 99-101 (2016).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+long-range+genome+interactions+using+the+WashU+Epigenome+Browser.">Exploring long-range genome interactions using the WashU Epigenome Browser.</a> Nature Methods. 10 (5), 375-376 (2013).</li><li>Ram&#237;rez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies.">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> bioRxiv. , 115063 (2017).</li><li>Kerpedjiev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiGlass:+Web-based+Visual+Comparison+And+Exploration+Of+Genome+Interaction+Maps.">HiGlass: Web-based Visual Comparison And Exploration Of Genome Interaction Maps.</a> bioRxiv. , 121889 (2017).</li><li>Hug, C. B., Grimaldi, A. G., Kruse, K., Vaquerizas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+Architecture+Emerges+during+Zygotic+Genome+Activation+Independent+of+Transcription.">Chromatin Architecture Emerges during Zygotic Genome Activation Independent of Transcription.</a> Cell. 169 (2), (2017).</li><li>Berkum, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes.">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), (2010).</li><li>Naumova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+mitotic+chromosome.">Organization of the mitotic chromosome.</a> Science. 342 (6161), 948-953 (2013).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+2.0:+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation.">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods (San Diego, Calif). 123, 56-65 (2017).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

البروتوكول المعروضة هنا فعالة جداً في توليد خرائط عالية الجودة للهندسة المعمارية الكروماتين في الأجنة المورفولوجية في وقت مبكر. مقارنة بروتوكول سابق34، يستخدم النهج الموصوفة هنا حديثة في الموقع مرحبا-ج الداخلي5، مما أسفر عن تجهيز أسرع ودقة أعلى، وأقل استخدام كاشف. الداخلي الإجمالي بما في ذلك البروتوكول مرحبا-C في الموقع المتوقع للعمل على مجموعة واسعة من المراحل والنظم التجريبية إلى جانب المورفولوجية. منذ البروتوكول بشرط إدخال منخفضة، لكن يمكن أيضا استخدامه في السكان خلية معزولة. في المورفولوجية، عند استخدام البروتوكول للأجنة خارج النطاق الموصوفة هنا، بعض المعلمات، لا سيما تثبيت المواد، قد تحتاج إلى تعديل. منذ وضع الأجنة الأكبر سنا بشرة شديدة كتيمة، زيادة تركيز فورمالدهايد وإطالة أمد التثبيت قد يكون مناسباً. لمجموعة من الأجنة في مراحل عدا دورة النووي 14، مرات حضانة الأجنة عند 25 درجة مئوية في الخطوة 1، 4 تحتاج إلى تعديلها على النحو التالي: الدورة النووية 12, 70 دقيقة؛ دورة النووي 13، 90 دقيقة؛ 3 – 4 هبف، 03:30 ح.
خلال الانقسامات الانقسام 13 (المرحلة 1-4)، الزوجي كثافة الأنوية تقريبا مع كل شعبة. يمكن بسهولة تحديد الأنوية الأسفار بروتينات فلورية خضراء مشرقة. أثناء الانقسام، اجفب منها غير موجود في النواة، والإشارة هو موزعة الجنين. هذه الميزة يجعل تحديد الأجنة التي تشهد تقسيما انشقاق متزامن ممكن. لدراسة تشكيل الكروماتين، هذه الأجنة الانقسامية ليست عادة مرغوباً فيه، منذ الانقسامية تنظيم الكروماتين يختلف جذريا عن المنظمة الطور البيني35. فمن الممكن التكيف مع بروتوكول لتحديد الأجنة تمر تقسيم الانقسامية متزامن على وجه التحديد. في هذه الحالة، ينبغي أن تظل الأجنة فقط مع توزيع اجفب-منها مشتتة، غير النووية، ويجب أن يتم تجاهل جميع الأجنة الأخرى. إذ لا يمكن تحديد كثافة النووي، يجب استخدام أساليب بديلة لمرحلة الأجنة بالتشكل على عرضها في الفحص المجهري الخفيفة المنقولة. وجود خلايا القطب ونوى في محيط جنين تشير إلى أن الجنين قد أكمل دورة النووي على الأقل 9، بينما يشير سيلولاريزيشن مرئية على الهامش الدورة النووية 1412.
ج تجارب يمكن أن يؤديها بنجاح باستخدام تشكيلة واسعة من إنزيمات التقييد5. عادة ما تستخدم النهج الحالي الإنزيمات التي تعترف بأي تسلسل 4-قاعدة، مثل مبوي، أو موقع 6-قاعدة اعتراف، مثل هنديي. ميزة القواطع 4-قاعدة على تقطيع 6-قاعدة أنها توفر دقة أعلى المحتملة، نظراً لعمق كاف التسلسل، وتغطية أكثر من تقييد مواقع عبر الجينوم. لا يوجد أي ميزة واضحة في اختيار واحد 4-قاعدة القاطع على آخر5،23،،من3637. الإنزيمات هما الأكثر استخداماً، مبوي ودبنيي، على حد سواء الاعتراف جتك نفس الاعتراف بالموقع. دبنيي أقل حساسية مثلايشن البد، ولا تشكل مصدر قلق في المورفولوجية. البروتوكول المعروضة هنا يمكن أيضا أن نجاح استخدام دبنيي إنزيم التقييد. في الجزء 4-2. المخزن المؤقت لأنزيم التقييد قد يتعين تعديلها للتوافق مع دبنيي، وفقا لتوصيات الشركة المصنعة.
إذا كان حجم جزء من المكتبة التسلسل ينحرف كثيرا عن النطاق المبين في الشكل 2 أ، قد تكون أقل كفاءة تشكيل الكتلة أثناء تسلسل أو تفشل تماما. وفي هذه الحالة، يجب التحقق من توزيع حجم بعد القص والقص معلمات تعديلها تبعاً لذلك. قمم في توزيع الحمض النووي شظايا صغيرة جداً (< 100 bp) أو كبير جداً (> 1,000 bp) أحجام يشير مشاكل مع حجم التحديد، مثل حمل أكثر من الخرز أو المادة طافية التي من المفترض أن يتم تجاهل. غالباً ما هذه المكتبات مع قمم صغيرة في هذه الأحجام غير مرغوب فيها، مثل واحد ويتم المصورة، لا يزال التسلسل بنجاح مع انخفاض طفيف فقط في تجميع الكفاءة.
وينبغي تجنب معدلات عالية من الازدواجية PCR لأن هذا يخفض بشكل كبير عدد ما يلي تسلسل للاستخدام. معدل التكرار PCR ارتباطاً مباشرا بكمية المواد المدخلة. استخدام المزيد من المدخلات ولذلك عادة ما يخفف من المشاكل مع ازدواجية PCR.
تشير أرقام أعلى من القراءات التي تمت تصفيتها بسبب اتجاه القراءة (الشكل 2B) الهضم غير كافية، والتي يمكن أن تكون نتيجة لاستخدام القليل جداً إنزيم أو إدخال الكثير من المواد أو التجانس غير مكتملة للأجنة.

التقاط تكيف الكروماتين (3 ج) برز كوسيلة استثنائية مفيدة لدراسة طوبولوجيا الكروماتين في نواة1. يسمح الخيار ج 3 ج مرحبا قياس ترددات الاتصال كل الكروماتين التفاعلات التي تحدث في النواة في تجربة واحدة2. تطبيق مرحبا-ج وقد لعبت دوراً هاما في اكتشاف وتوصيف العديد من المبادئ الأساسية للمنظمة الكروماتين، مثل الأمراض والمقصورات والحلقات3،،من45.
الدراسات المعمارية الكروماتين في سياق التحولات الإنمائية وتمايز خلية تستخدم بشكل متزايد لكشف آليات تنظيم الجينات أثناء هذه العمليات6،،من78، 9. واحد من الكائنات نموذج من اهتمام كبير هو melanogaster المورفولوجية، وتتسم أيضا الذين التنمية والجينوم. ومع ذلك، إجراء دراسات قليلة أن التحقيق في العمارة الكروماتين في المورفولوجية خارج زراعة الأنسجة في المختبر كانت إعدادات10،11. في الأجنة كانت ح 16 – 18 وظيفة الإخصاب، تادس والمقصورات يذكرنا بهياكل مماثلة في الثدييات حددت10، الذي يثير مسألة الدور الذي كانوا يلعبون في تنظيم الجينات خلال الجنين المورفولوجية التنمية. لا سيما في المراحل الأولى من التنمية، قبل جاستروليشن، مثل هذه الدراسات صعبة من الناحية التقنية. قبل جاستروليشن، تخضع الأجنة المورفولوجية 13 الانقسامات النووية متزامن أن المضي قدما بوتيرة سريعة جداً من 8 – 60 دقيقة لكل دورة12،13. وبالإضافة إلى ذلك، تجعل انعدام الميزات المرئية التمييز بين المراحل المختلفة من الصعب الحصول على الجنين نظموا أحكام المواد بكميات كافية.
من أجل وضع بروتوكول يسمح لدراسة الهندسة المعمارية الكروماتين في الإسراع بتطوير المورفولوجية في قرار الدورة النووية، نحن الجمع بين اثنين من التقنيات القائمة: في الموقع مرحبا جيم، الذي يتيح توليد عالية الدقة كاملة الاتصال خرائط الجينوم5، والتدريج الجنين باستخدام خط المورفولوجية المعدلة وراثيا معربا عن13،اجفب-منها التحوير14. هذا التحوير يموضع إلى النواة أثناء الطور البيني وتسارع شرط في جميع أنحاء بلاستوديرم المخلوي أثناء الانقسام. باستخدام هذه الخاصية، من الممكن بسهولة التمييز بين المراحل المختلفة بكثافتها النووية والأجنة الانقسامية التي تشتت إشارة التجارة والنقل.
معا، هذه التقنيات تمكن دراسة هيكل ثلاثي الأبعاد من الكروماتين بدقة عالية من عدد قليل من 20 المورفولوجية الأجنة. ويشمل هذا البروتوكول الإرشادات الخاصة بتجميع وفرز الأجنة المورفولوجية للحصول على سكان أجنة من دورة شعبة نووية واحدة. فهو يصف أيضا كيف تستخدم الأجنة التي تم الحصول عليها لتنفيذ في الموقع مرحبا--جيم والنتيجة النهائية مكتبة النوكليوتيدات مناسبة للتسلسل في آلات تسلسل الجيل القادم. ثم يمكن معالجة ما يلي التسلسل الناتج إلى خرائط التفاعل الكروماتين مفصلة تغطي كامل الجينوم المورفولوجية .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dATP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>19524016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MboI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0147L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase I Klenow Fragment</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0012</td>
			<td>T4 DNA Ligase Buffer included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina&#160;(Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335</td>
			<td>Sequencing Adaptor, Forward (unindexed) PCR primer and Reverse (indexed) PCR primer and USER enzyme used in the Library preparation section are components of this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645</td>
			<td>End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix and Polymerase Master Mix used in the Library preparation section are components of this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S2 AFA System</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon cell strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td>Embryo collection baskets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>437536C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>122062.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165 FC fluorescent stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165 FC DFC camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal micro pestle</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P985.1</td>
			<td>Used to lyse embryos in step 4.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3832,0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65002</td>
			<td>Streptavidin coated magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP-PCNA flies</td>
			<td>Gift from S. Blythe and E. Wieschaus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite 13%</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer pH 8.0 (1 M) for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Nucleotide Mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814362001</td>
			<td>Unmodified dCTP, dGTP, dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M solution for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate 3M pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Mixer RM-2L</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5729802</td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td>Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Embryo Collection Cages</td>
			<td>Flystuff.com</td>
			<td>59-100</td>
			<td>Egg collection cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube strips</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7202S</td>
			<td>T4 DNA Polymerase buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genome-wide chromatin conformation capture libraries from tightly staged early drosophila embryos

ويقدم أفكاراً قيمة حول آليات تنظيم الجينات التحقيق بنية ثلاثية الأبعاد من الكروماتين. هنا، يمكننا وصف بروتوكول لأداء في الكروماتين تكيف التقاط تقنية في الموقع مرحبا-ج على نظم السكان الجنين melanogaster المورفولوجية . والنتيجة هي مكتبة تسلسل الذي يسمح لرسم خرائط لجميع الكروماتين التفاعلات التي تحدث في النواة في تجربة واحدة. ويتم فرز الأجنة يدوياً باستخدام مجهر فلوري استريو وخط الطيران المعدلة وراثيا يحتوي على علامة نووية. يمكن الحصول عليها باستخدام هذا الأسلوب، والسكان الجنين من كل دورة من دورات شعبة النووية، ومع وضع دورة الخلية المحددة، مع درجة نقاء عالية جداً. البروتوكول يمكن تكييفها لفرز الأجنة كبار السن تتجاوز gastrulation أيضا. فرز الأجنة تستخدم كمدخلات في الموقع مرحبا-جيم. جميع التجارب، بما في ذلك تسلسل إعداد مكتبة، يمكن أن تكتمل في غضون خمسة أيام. البروتوكول متطلبات المدخلات المنخفضة ويعمل موثوق بها باستخدام أجنة المرحلة بلاستوديرم 20 كمواد الإدخال. والنتيجة النهائية مكتبة تسلسل لتسلسل الجيل القادم. بعد التسلسل، يمكن معالجة البيانات إلى خرائط التفاعل الكروماتين على نطاق الجينوم التي يمكن تحليلها باستخدام مجموعة واسعة من الأدوات المتاحة للحصول على معلومات حول اقتران توبولوجيكالي بنية المجال (صبي) والحلقات الكروماتين الكروماتين المقصورات خلال التنمية المورفولوجية .

فرز السكان الجنين في الدورة النووية 12 و 13 و 14 (الموافق 01:30، 01:45، و 02:10 ساعات ما بعد الإخصاب، على التوالي12) وتم الحصول على 3 – 4 ح وظيفة التسميد (hpf) وفقا للإجراءات المبينة في البروتوكول. بالتقاط صور لإشارة منها اجفب من كل دفعة الجنين تم فرزها، فمن الممكن لتوثيق الوضع المرحلة ودورة الخلية الدقيق لكل جنين واحد يستخدم في تجارب المتلقين للمعلومات. مثال على صور للأجنة من السكان تم فرزها مبينة في الشكل 1 باء-ه. إخراج البروتوكول مرحبا-C في الموقع مكتبة النوكليوتيدات جاهزة تكون متسلسلة على آلات تسلسل الجيل القادم. ولهذا الغرض، تركيز مكتبة نهائي من شمال البحر الأبيض المتوسط على الأقل 2-4 مطلوب عادة. استخدام المبالغ الموصى بها لإدخال المواد، وهذا التركيز موثوق تحقق (الجدول 1).
توزيع الحجم المتوقع من شظايا من الحمض النووي بعد تحديد حجم ما بين 300-600 شركة بريتيش بتروليوم، مع حد أقصى في حوالي 500 شركة بريتيش بتروليوم (الشكل 2A)، اعتماداً على القص الدقيق ومعايير اختيار حجم. للتسلسل، نوصي بما يلي نهاية الاقتران من طول bp 75 على الأقل لتقليل عدد الأجزاء تقييد مصادفة في الجينوم. يمكن الحصول على خرائط عالية الدقة بحجم بن 1 – 2 كيلو بايت من يقرأ 400 مليون. ونحن نوصي التسلسل replicates بيولوجية متعددة على عمق أقل من 150 مليون يقرأ كل، بدلاً من التسلسل تكرار واحد في عمق عالية جداً. وهذا يسمح تقييم الاختلاف البيولوجي ويؤدي إلى انخفاض عدد القراءات المهملة بسبب ازدواجية PCR. لتمثيل مرئي، يمكن دمجها في replicates. قبل الالتزام بالتسلسل عينة في عمق عالية، نوصي بتشغيل العينات باستخدام تسلسل الضحلة (بضعة ملايين ما يلي كل عينة) لتحديد معلمات نوعية المكتبة الأساسية كما هو الحال في الشكل 2.
تحليل البيانات مرحبا-ج يتطلب خبرة كبيرة من الموارد والمعلوماتية الحيوية الحسابية. كنظرة الخام، يقرأ إقران يتم تعيينها بشكل مستقل للجينوم المرجعية، وأن التحالفات الناتجة يتم تصفيتها للجودة والتوجه، ثم يمكن إنشاء مصفوفة اتصالات على مستوى القرار أو جزء معين بن من تمت تصفيتها التحالفات. مصفوفة الاتصال هو الأساس لتحليل جميع المتلقين للمعلومات كذلك استكشاف تادس والحلقات والأجزاء الأخرى. تتوفر العديد من خطوط الأنابيب المعلوماتية الحيوية للتحليلات الأولية لقراءة التسلسل، تمكن معالجة الخام ما يلي إلى مصفوفات الاتصال دون كثير المعلوماتية المتخصصة المعرفة18،19، 2021،،،من2223. كيف يتم إجراء مزيد من التحليل يعتمد إلى حد كبير على مسألة البيولوجية الدقيقة قيد الدراسة وقد تتطلب خبرة كبيرة في البرمجة والبرمجة في البحث والتطوير أو بايثون. عدة أدوات وخوارزميات لاستدعاء تادس غير متاح5،24،25،26،،من2728، فضلا عن برامج لتحليل و استكشاف البيانات C مرحبا في مستعرض ويب وتطبيقات سطح المكتب قائمة بذاتها29،30،،من3132.
وفور تجهيز، يمكن تحديد نوعية المكتبة استخدام مقاييس مختلفة (الشكل 2). أولاً، ينبغي أن يكون معدل التكرارات بكر، وهو عدد أزواج القراءة المتتابعة الناشئة عن الجزيء الأصلي نفسه، منخفضة قدر الإمكان الحد من مقدار ما يلي تسلسل مهدرة. ومع ذلك، وحتى المكتبات مع > يمكن معالجة الازدواجية بكر 40% إلى خرائط عالية الجودة الاتصال إذا كانت التكرارات يتم تصفيتها. ثانيا، القراءات التي تمت تصفيتها بسبب ميولهم، كما هو موضح في4، ينبغي دائماً يكون المعدل أقل من 10% أزواج القراءة المنحازة.
أثناء التطوير قبل جاسترولار من المورفولوجية بين دورة النووي 12 و 14، هو البنية النووية جذريا تشكيلها33 (الشكل 3). في الدورة النووية 12، يتم الكشف عن بعض الأمراض، والتوزيع العام للاتصالات سلس جداً دون العديد من الميزات ملموس. وهذا هو تغيرا في الدورة النووية 13 و 14، عندما تادس بارز على نحو متزايد، وتستنفد الاتصالات البعيدة المدى غير محدد.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig1.jpg"> رقم 1: صور الممثل للأجنة اجفب منها أثناء الفرز. (أ) اجفب-منها إشارة من سكان لم يتم فرزها بالأجنة بعد جمع 60 دقيقة وحضانة ح 2 في 25 درجة مئوية (ب ه) أمثلة على الأجنة من السكان تم فرزها في الدورة النووية 12 (ب)، النووي دورة 13 (ج)، (14 دورة النووي د)، ومن الأجنة يمر الانقسام متزامن (E). تغيير حجم أشرطة = 200 ميكرومتر. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig2.jpg"> الشكل 2: أمثلة في الموقع مرحبا-C مكتبة نوعية المقاييس. آثار بيواناليزير (A) يبين التوزيع للحمض النووي أحجام جزء من مكتبة مرحبا-ج ناجحة (مكتبة 1، الأعلى) ومن مكتبة الذي يعرض وه شظايا التي تكون كبيرة جداً لتسلسل (مكتبة 2، أسفل). مكتبة 2 كان التسلسل بنجاح، ولكن كميات أكبر من شظايا من الحمض النووي غير مرغوب فيها قد تؤدي إلى تسلسل تناقص الغلة. (ب) تصفية إحصاءات مكتبتين مرحبا-ج: عرض هو عدد أزواج القراءة المنحازة المستبعدة من مزيد من التحليل بسبب قراءة الاتجاه والمسافة (إلى الداخل وإلى الخارج)4 أو الازدواجية بكر (مكررة). في كل شريط، يتم رسم عدد القراءات تمرير عامل التصفية (المتبقية) والفشل (تصفية). بالإضافة إلى ذلك يتم عرض النسبة المئوية لتمرير عامل التصفية على ما يلي كنص. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig3.jpg"> الشكل 3: التفاعل ج خرائط من الأجنة نظموا. خرائط التفاعل ج إهمال في القرار 10 كيلو بايت ومتوازن كما هو موضح قبل33. سيظهر منطقة على الصبغي 2 ل. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>مكتبة</td>
			<td>المرحلة</td>
			<td>عدد الأجنة</td>
			<td>كمية الحمض النووي قبل القص (الحرس الوطني)</td>
			<td>دورات بكر</td>
			<td>مكتبة النهائي تركيز (nM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>دورة النووي 12</td>
			<td>71</td>
			<td>46</td>
			<td>12</td>
			<td>28.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>دورة النووي 12</td>
			<td>46</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>دورة النووي 12</td>
			<td>60</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>دورة النووي 13</td>
			<td>36</td>
			<td>39</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>دورة النووي 13</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>دورة النووي 13</td>
			<td>48</td>
			<td>18</td>
			<td>12</td>
			<td>8.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>دورة النووي 14</td>
			<td>33</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>39.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>دورة النووي 14</td>
			<td>24</td>
			<td>36</td>
			<td>12</td>
			<td>20.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>دورة النووي 14</td>
			<td>14</td>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3-4 هبف</td>
			<td>17</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>24.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>3-4 هبف</td>
			<td>18</td>
			<td>42</td>
			<td>11</td>
			<td>19.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>3-4 هبف</td>
			<td>22</td>
			<td>63</td>
			<td>11</td>
			<td>48.4</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: قائمة بتسلسل الممثل مكتبة الإحصاءات. لكل مكتبة في القائمة، عدد الأجنة التي تم استخدامها لجيلها، مبلغ إجمالي الحمض النووي قبل المنسدلة البيوتين والقص تقاس كوبيت، دورات عدد PCR يستخدم للتضخيم، وتركيز المكتبة التسلسل النهائي بعد أن يتم الإشارة إلى تنقية واختيار حجم.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos at JoVE.com

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

يصف هذا العمل بروتوكول لتوليد عالية الدقة في الموقع مرحبا-C مكتبات من أحكام نظموا قبل جاستروليشن melanogaster المورفولوجية الأجنة.

جيل من الكروماتين على نطاق الجينوم تكيف التقاط المكتبات من الأجنة المورفولوجية محكم نظموا في وقت مبكر

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال هندسة الكروماتين مثل كيف يمكن للهيكل ثلاثي الأبعاد من الكروماتين أن يؤثر على التعبير الجيني والتطور. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها توفر رؤية عالية الدقة لهندسة الكروماتين وأجنة الذبابة على وجه التحديد. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في تنظيم الكروماتين والتنمية، يمكن للمرء أيضا استخدام خطوط القائمة من مكتبات ذبابة المعدلة وراثيا لاختبار تأثيرها في منظمة الكروماتين.للبدء في البروتوكول، ضبط الحجم الإجمالي للأجنة التي تم جمعها سابقا إلى ملليلترين مع PBST. إضافة ستة ملليلتر من الهبتان و 100 ميكرولترات من 37٪ الفورمالديهايد في الماء. بعد إضافة الفورمالديهايد، يهز بقوة أنبوب صعودا وهبوطا لمدة دقيقة واحدة.وسوف تتحد المرحلة مائي والعضوية لتشكيل اتساق مثل الشامبو. تهيج الخليط على خلاط دوار لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي الأنبوب في 500 مرة ز لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة لجمع الأجنة في الجزء السفلي من الأنبوب.pirate كامل مثل الشامبو السائل والتخلص منه، مع الحرص على عدم التعرق أي أجنة. بعد 15 دقيقة من إضافة الفورمالديهايد، إعادة تعليق الأجنة في خمسة ملليلتر من PBST مع 125 جليكاين ملليمولار. هز الأجنة صعودا وهبوطا بقوة لمدة دقيقة واحدة.بعد الطرد المركزي، طامح المغرور. باستخدام ماصة 1000 ميكرولتر، نقل دفعة من 100 جنين إلى وعاء زجاجي صغير مناسب للفرز، ويفضل أن يكون ذلك على خلفية داكنة ووضعها على الجليد. فرز الأجنة حسب الكثافة النووية وحالة دورة الخلية باستخدام إبرة أو حقنة تلميح.إزالة جميع الأجنة الميتاوتية التي يمكن التعرف عليها من خلال توزيعها غير النووي المتفرق لـ EGFP PCNA والأجنة التي تظهر جزئيًا إشارة GFP غير نووية. للمساعدة في الفرز، اصطف الأجنة المرجعية في الدورات النووية 12 و 13 و 14 في كل دفعة لتتناسب مع الأجنة مع واحد من الأجنة المرجعية. ماصة حتى الأجنة المطلوب باستخدام 1000 ماصة ميكرولتر.نقلها إلى أنبوب جديد ووضعها على الجليد. استمر حتى يتم فرز ما يكفي من الأجنة للتجربة المخطط لها. تدور أنابيب لفترة وجيزة في 100 مرة ز في درجة حرارة الغرفة.إزالة فائقة وضمان الأجنة جافة قدر الإمكان لتجميد. فلاش تجميد الأجنة عن طريق غمر الأنابيب في النيتروجين السائل وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية. ضع الأنابيب مع الأجنة المجمدة على الجليد.resuspend الأجنة في 500 ميكرولترات من الجليد الباردة العازلة التحلل. انتظر دقيقة واحدة للسماح للجنين بالاستقرار في الجزء السفلي من الأنبوب. بعد ذلك ، طحن الأجنة مع آفة معدنية صغيرة تم تبريدها مسبقًا على الجليد الذي تم تصميمه لتناسب بإحكام أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر.لتجنب تهيج الأجنة ، أدخل الآفة ببطء حتى تمس الجزء السفلي من الأنبوب. دفع لأسفل ثم طحن عن طريق تدوير الآفات مرتين في كلا الاتجاهين. رفع الآفات قليلا جدا.دفع إلى الجزء السفلي من الأنبوب مرة أخرى وتكرار إجراء طحن 10 مرات أو حتى يتم lysed الأجنة تماما. وينبغي أن يكون الحل متجانساً وألا تبقى قطع كبيرة متبقية من الأجنة. احتضان التعليق المتجانس على الجليد لمدة 15 دقيقة.تدور في 1،000 مرة ز أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. تجاهل supernatant وغسل بيليه عن طريق resuspending في 500 ميكرولتر الجليد الباردة العازلة والتحلل صعودا وهبوطا. بعد دوران آخر، تجاهل الماخرة.Resuspend بيليه غسلها في 100 ميكرولترات من 0.5٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات أو SDS. ثم قم بإضفاء الصبغة على النواة عن طريق احتضان العينة لمدة 10 دقائق عند 65 درجة مئوية في كتلة التدفئة. إضافة 50 ميكرولترات من 10٪ تريتون X100 و 120 ميكرولترات من المياه.نفض الغبار الأنبوب لخلط المحتويات واحتضان الأنبوب في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في كتلة الحرارة. إضافة 25 ميكرولتردات من 10X تقييد إنزيم العازلة و 20 وحدة من خمس وحدات لكل ميكرولتر MBO1. نفض الغبار الأنبوب لخلط المحتويات واحتضان الأنبوب في كتلة الحرارة لهضم الحمض النووي.إضافة 20 وحدة أخرى من MBO1. مواصلة الحضانة لمدة 90 دقيقة. بعد الحضانة الثانية لمدة 90 دقيقة ، احتضان العينة في 62 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لactive من MBO1.بعد ذلك، أضف 18 ميكرولترات من 0.4 ملليمولار حيوي 14-dATP، 2.25 ميكرولترات من مزيج dCTP-dGTP-dTTP غير المعدلة 3.3 ميليمولار، وثمانية ميكرولترات من خمس وحدات لكل ميكرولترر الحمض النووي بوليميراز أنا كلينو جزء. نفض الغبار الأنبوب لخلط المحتويات واحتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 657 ميكرولترات من الماء ، و 120 ميكرولترات من 10X T4 الحمض النووي العازل ، و 100 ميكرولترات من 10 ٪ Triton X100 ، وستة ميكرولترات من 20 ملليغرام لكل ملليلتر بولفين مصل الألبوم ، وأخيرا خمسة ميكرولترات من خمس وحدات لكل ميكرولتر T4 LIGAse الحمض النووي.بعد ذلك، قم بتدوير الأنبوب بلطف عند 20 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. إضافة آخر خمسة ميكرولترات من خمس وحدات لكل microliter T4 الحمض النووي ligase. استمر في الدوران لمدة ساعتين إضافيتين، ثم قم بالدوران إلى أسفل النوى بمعدل 2،500 مرة ز لمدة خمس دقائق.بعد الطرد المركزي، تخلص من المغرور. Resuspend بيليه في 500 ميكرولتررس من العازلة استخراج وإضافة 20 ميكرولترات من 20 ملليغرام لكل ملليلتر البروتينات K.Flick الأنبوب واحتضان الأنبوب لهضم البروتين. إضافة 130 ميكرولترات من خمسة كلوريد الصوديوم الضرس واحتضان بين عشية وضحاها إلى إزالة crosslink.في اليوم التالي، ماصة العينة في أنبوب ملليلتر جديد مع خصائص منخفضة ربط الحمض النووي. إضافة 0.1X حجم من ثلاثة خلات الصوديوم الضرس واثنين من ميكرولترات من 15 ملليغرام لكل ملليلتر جليكوبل. إضافة 1.6 مجلدات من الإيثانول المطلق النقي وعكس المحتويات، ثم احتضان العينة في ناقص 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.بعد الحضانة، الطرد المركزي محتويات. حدد موقع بيليه الحمض النووي الذي لا يمكن إلا أن رصدت من قبل GlycoBlue. إزالة فائقة بعناية، تحريك تلميح ماصة في أنبوب على طول الجدار المقابل من بيليه الحمض النووي.غسل بيليه مع 800 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول. اخلط العينة عن طريق عكسها وطاردتها المركزية عند 20,000 مرة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. إزالة قطرات المتبقية خلال هذه الخطوة ويغسل التالية عن طريق دفعها للخروج من الأنابيب مع طرف P10، ثم فتح غطاء للهواء الجاف لمدة تصل إلى خمس دقائق.مرة واحدة لا يوجد سائل هو المتبقية، إضافة 50 ميكرولترات من 10 ملليمولار ثلاثيات كلوريد. ماصة مرارا وتكرارا الحل على المنطقة حيث كان موجودا بيليه ل solubilize الحمض النووي. إضافة ميكرولتر واحد من 20 ملليغرام لكل ملليلتر RNase A.Mix عن طريق نفض الغبار الأنبوب.احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لهضم الحمض النووي الريبي. وأخيراً، قم بتخزين العينة في الثلاجة أو الثلاجة حتى إعداد المكتبة. تكشف صور إشارة PCNA EGFP لكل دفعة من مجموعات الأجنة التي تم فرزها عن مرحلة دقيقة وحالة دورة الخلايا لكل جنين واحد لتجارب المصب.تظهر آثار Bioanalyzer أن توزيع حجم شظايا الحمض النووي بعد تحديد الحجم يتراوح بين 300 إلى 700 زوج أساسي بحد أقصى يبلغ حوالي 450 زوجًا أساسيًا. تُظهر خرائط التفاعل في الدورة النووية 12 أنه في الدورة النووية 12، يتم اكتشاف عدد قليل من المجالات المرتبطة بتوبولوجيلي أو TADs التي تتغير بشكل كبير في الـ 13 و14 عندما تكون الـ TADs بارزة بشكل متزايد ويتم استنفاد الاتصالات طويلة المدى غير المبينة. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر أن تغسل الخرز جيدا وليس لإطالة أوقات الحضانة دون داع وخاصة في درجات الحرارة العالية لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض جودة مرحبا جيم المكتبات.هذه التقنية التي تجمع بين التدريج الدقيق ورسم خرائط تأكيد الكروماتين عالية الدقة مهدت الطريق للباحثين في مجال علم الوراثة اللاجينية لاستكشاف دور منظمة الكروماتين ثلاثية الأبعاد في بيئة تنموية في الجسم الحي.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

تحديد الجينوم على نطاق توقيت النسخ المتماثل الثدييات بواسطة الحمض النووي قياس المحتوى

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

رسم خرائط الجينوم المنظومة الكروماتين موجوداً في الخلايا الليمفاوية تي البشرية الأولية التي أتاك-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

مروج التقاط مرحبا c: عالية الاستبانة، وعلى نطاق الجينوم التنميط التفاعلات المروج

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

كريسبر بوساطة إعادة تنظيم هيكل حلقة الكروماتين

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

المراقبة على نطاق الجينوم من أخطاء النسخ في الكائنات الحية حقيقية النواة

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

تحديد تسلسل الجينات التنظيمية استخدام تسلسل الجيل المقبل من تكيف كروموسوم دائرية الفائق التقاط (ج 4-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

تحديد جهات اتصال محسن-المروج في الأجسام الجنينية من خلال التقاط تثبيت الكروموسومات الكمية (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

تحليل على نطاق الجينوم لتوزيع تعديلات الهستون باستخدام طريقة تسلسل المناعة الكروماتين في ماغنابورتي أوريزاي

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Chromosome Conformation Capture (3C) for Undergraduate Research and Teaching

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates (Video) | JoVE 

الحصول على A مع 3Cs: التقاط تشوه الكروموسوم للطلاب الجامعيين

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...