Name: generation of genome-wide chromatin conformation capture libraries from tightly staged early drosophila embryos
Uploaded: 2018-10-03T13:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos at JoVE.com

Dit onderzoek werd gefinancierd door het Max-Planck-Gesellschaft. C.B.H. werd gesteund door een beurs van de Onderzoekschool International Max Planck-moleculaire biologie. Wij danken Shelby Blythe en Eric Wieschaus voorziet vriendelijk de eGFP-PCNA Drosophila melanogaster lijn.

<ol>
	<li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nat Rev Genet. 17 (11), 661-678 (2016).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Jin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+map+of+the+three-dimensional+chromatin+interactome+in+human+cells.">A high-resolution map of the three-dimensional chromatin interactome in human cells.</a> Nature. , (2013).</li><li>Rao, S. S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Map+of+the+Human+Genome+at+Kilobase+Resolution+Reveals+Principles+of+Chromatin+Looping.">A 3D Map of the Human Genome at Kilobase Resolution Reveals Principles of Chromatin Looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Darbellay, F., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+Domains,+Metagenes,+and+the+Emergence+of+Pleiotropic+Regulations+at+Hox+Loci.">Topological Domains, Metagenes, and the Emergence of Pleiotropic Regulations at Hox Loci.</a> Current topics in developmental biology. 116, 299-314 (2016).</li><li>Beagan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Genome+Topology+Can+Exhibit+an+Incompletely+Rewired+3D-Folding+State+during+Somatic+Cell+Reprogramming.">Local Genome Topology Can Exhibit an Incompletely Rewired 3D-Folding State during Somatic Cell Reprogramming.</a> Cell stem cell. 18 (5), 611-624 (2016).</li><li>Andrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+hundreds+of+regulatory+landscapes+in+developing+limbs+reveals+two+regimes+of+chromatin+folding.">Characterization of hundreds of regulatory landscapes in developing limbs reveals two regimes of chromatin folding.</a> Genome Res. 27 (2), 223-233 (2017).</li><li>Krijger, P. H. L., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome.">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li><li>Sexton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+folding+and+functional+organization+principles+of+the+Drosophila+genome.">Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome.</a> Cell. 148 (3), 458-472 (2012).</li><li>Ghavi-Helm, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+loops+appear+stable+during+development+and+are+associated+with+paused+polymerase.">Enhancer loops appear stable during development and are associated with paused polymerase.</a> Nature. 512 (7512), 96-100 (2014).</li><li>Foe, V. E., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+nuclear+and+cytoplasmic+behaviour+during+the+five+mitotic+cycles+that+precede+gastrulation+in+Drosophila+embryogenesis.">Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis.</a> J Cell Sci. 61, 31-70 (1983).</li><li>Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zygotic+Genome+Activation+Triggers+the+DNA+Replication+Checkpoint+at+the+Midblastula+Transition.">Zygotic Genome Activation Triggers the DNA Replication Checkpoint at the Midblastula Transition.</a> Cell. 160 (6), 1169-1181 (2015).</li><li>Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+maintenance+of+heritable+chromatin+structure+during+early+Drosophila+embryogenesis.">Establishment and maintenance of heritable chromatin structure during early Drosophila embryogenesis.</a> eLife. 5, e20148 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+Larva+Harvesting+and+Preparation.">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila melanogaster. , (2017).</li><li>Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Neuronal+Cultures+from+Midgastrula+Stage+Drosophila+Embryos.">Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (5), (2007).</li><li>Shermoen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Baskets+for+Drosophila+Egg+Collections,+Treatments,+and+Incubations.">Preparation of Baskets for Drosophila Egg Collections, Treatments, and Incubations.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (10), (2008).</li><li>Ay, F., Noble, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+methods+for+studying+the+3D+architecture+of+the+genome.">Analysis methods for studying the 3D architecture of the genome.</a> Genome biology. 16 (1), 183 (2015).</li><li>Lazaris, C., Kelly, S., Ntziachristos, P., Aifantis, I., Tsirigos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiC-bench:+comprehensive+and+reproducible+Hi-C+data+analysis+designed+for+parameter+exploration+and+benchmarking.">HiC-bench: comprehensive and reproducible Hi-C data analysis designed for parameter exploration and benchmarking.</a> BMC Genomics. 18 (1), (2017).</li><li>Servant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiC-Pro:+an+optimized+and+flexible+pipeline+for+Hi-C+data+processing.">HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C data processing.</a> Genome Biology. 16 (1), (2015).</li><li>Durand, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juicer+Provides+a+One-Click+System+for+Analyzing+Loop-Resolution+Hi-C+Experiments.">Juicer Provides a One-Click System for Analyzing Loop-Resolution Hi-C Experiments.</a> Cell systems. 3 (1), 95-98 (2016).</li><li>Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hitchhiker's+guide+to+Hi-C+analysis:+Practical+guidelines.">The Hitchhiker's guide to Hi-C analysis: Practical guidelines.</a> Methods. 72, 65-75 (2015).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopDom:+an+efficient+and+deterministic+method+for+identifying+topological+domains+in+genomes.">TopDom: an efficient and deterministic method for identifying topological domains in genomes.</a> Nucleic Acids Res. 44 (7), e70 (2016).</li><li>Kruse, K., Hug, C. B., Hern&#225;ndez-Rodr&#237;guez, B., Vaquerizas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TADtool:+visual+parameter+identification+for+TAD-calling+algorithms.">TADtool: visual parameter identification for TAD-calling algorithms.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3190-3192 (2016).</li><li>L&#233;vy-Leduc, C., Delattre, M., Mary-Huard, T., Robin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+segmentation+for+analyzing+Hi-C+data.">Two-dimensional segmentation for analyzing Hi-C data.</a> Bioinformatics. 30 (17), i386-i392 (2014).</li><li>Filippova, D., Patro, R., Duggal, G., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+alternative+topological+domains+in+chromatin.">Identification of alternative topological domains in chromatin.</a> Algorithms for molecular biology: AMB. 9 (1), 14 (2014).</li><li>Crane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensin-driven+remodelling+of+X+chromosome+topology+during+dosage+compensation.">Condensin-driven remodelling of X chromosome topology during dosage compensation.</a> Nature. 523 (7559), 240-244 (2015).</li><li>Durand, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juicebox+Provides+a+Visualization+System+for+Hi-C+Contact+Maps+with+Unlimited+Zoom.">Juicebox Provides a Visualization System for Hi-C Contact Maps with Unlimited Zoom.</a> Cell systems. 3 (1), 99-101 (2016).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+long-range+genome+interactions+using+the+WashU+Epigenome+Browser.">Exploring long-range genome interactions using the WashU Epigenome Browser.</a> Nature Methods. 10 (5), 375-376 (2013).</li><li>Ram&#237;rez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies.">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> bioRxiv. , 115063 (2017).</li><li>Kerpedjiev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiGlass:+Web-based+Visual+Comparison+And+Exploration+Of+Genome+Interaction+Maps.">HiGlass: Web-based Visual Comparison And Exploration Of Genome Interaction Maps.</a> bioRxiv. , 121889 (2017).</li><li>Hug, C. B., Grimaldi, A. G., Kruse, K., Vaquerizas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+Architecture+Emerges+during+Zygotic+Genome+Activation+Independent+of+Transcription.">Chromatin Architecture Emerges during Zygotic Genome Activation Independent of Transcription.</a> Cell. 169 (2), (2017).</li><li>Berkum, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes.">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), (2010).</li><li>Naumova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+mitotic+chromosome.">Organization of the mitotic chromosome.</a> Science. 342 (6161), 948-953 (2013).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+2.0:+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation.">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods (San Diego, Calif). 123, 56-65 (2017).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol hier gepresenteerd is zeer effectief in het genereren van hoge kwaliteit kaarten van de chromatine-architectuur in vroege Drosophila embryo's. Vergeleken met een eerder protocol34, de beschreven aanpak hier gebruikt een up-to-date in situ Hi-C procedure5, wat resulteert in snellere verwerking, hogere resolutie, en minder reagens gebruik. De algemene procedure, met inbegrip van de in situ Hi-C protocol wordt verwacht om te werken aan een breed scala van podia en experimentele systemen naast Drosophila. Aangezien het protocol een lage invoer vereiste heeft, kon het ook worden gebruikt op geïsoleerde cel populaties. In Drosophila, wanneer met behulp van het protocol voor embryo's buiten het bereik beschreven hier, sommige parameters, wellicht met name de vastlegging van het materiaal, worden aangepast. Aangezien oudere embryo's een zeer ondoordringbare schubbenlaag ontwikkelen, verhoging van de concentratie van formaldehyde en fixatie te verlengen kunnen worden gehouden. Voor verzamelen van embryo's in stadia dan nucleaire kringloop 14, de tijden van de incubatie van embryo's bij 25 ° C in stap 1.4 moeten als volgt worden aangepast: nucleaire kringloop 12, 70 min; nucleaire kringloop 13, 90 min; 3-4 hpf, 3:30 h.
Tijdens de 13 decollete divisies (fase 1-4), verdubbelt de kernen dichtheid ongeveer met elke divisie. De kernen kunnen gemakkelijk worden geïdentificeerd door hun heldere GFP-fluorescentie. Tijdens de mitose, eGFP-PCNA is niet gelegen in de kern en zijn signaal is verspreid over het embryo. Deze functie maakt identificerende embryo's die zich in een synchrone decollete divisie mogelijk. Voor de studie van chromatine bevleesdheid, zijn deze mitotische embryo's meestal niet wenselijk, aangezien de mitotische organisatie van de chromatine drastisch anders dan de interfase organisatie35 is. Het is mogelijk om aan te passen het protocol specifiek Schakel embryo's ondergaan een synchrone mitotische divisie. In dit geval alleen embryo's met verspreide, niet-nucleaire verdeling van eGFP-PCNA moeten worden gehouden, en alle andere embryo's moeten worden weggegooid. Aangezien de nucleaire dichtheid kan niet worden bepaald, moeten alternatieve methoden om fase embryo's door hun morfologie bekeken in de lichte microscopie van verzonden worden toegepast. Aanwezigheid van pole cellen en kernen aan de rand van het embryo geven aan dat het embryo is voltooid ten minste nucleaire kringloop 9, overwegende dat zichtbaar cellularization aan de rand van de nucleaire kringloop 1412blijkt.
Hi-C experimenten kunnen met succes worden uitgevoerd met behulp van een brede selectie van restrictie-enzymen5. Huidige aanpak gebruiken meestal enzymen die beide een sequentie van de 4-base, zoals MboI, of een 6-base erkenning site, zoals HindIII herkent. Het voordeel van 4-base kotters over 6-base scharen is dat ze hogere potentiële resolutie bieden, gezien genoeg sequencing diepte en een meer gelijkmatige dekking van beperkingsplaatsen in het genoom. Bij het kiezen van een 4-base cutter over nog eens5,23,36,,37biedt geen duidelijke voordelen. De twee meest gebruikte enzymen, MboI en DpnII, herkennen beide dezelfde GATC erkenning site. DpnII is minder gevoelig voor CpG methylering, die van geen belang in Drosophila is. Het hier gepresenteerde protocol kan ook worden voltooid met behulp van DpnII als een restrictie-enzym. In paragraaf 4.2. restrictie-enzym en buffer moeten worden aangepast voor compatibiliteit van de DpnII, volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
Als de grootte van het fragment van de sequencing-bibliotheek van het bereik wordt weergegeven in figuur 2Aaanzienlijk afwijkt, kan clustervorming tijdens sequencing minder efficiënt of volledig mislukken. In dit geval de grootteverdeling na het scheren moet worden gecontroleerd en schuintrekken parameters aangepast. Pieken in de verdeling van de fragmenten van DNA van zeer kleine (< 100 bp) of zeer grote (> 1000 bp) maten geeft problemen met grootte selectie, zoals carry over kralen of bovendrijvende substantie die moeten worden verwijderd. Deze bibliotheken met kleine pieken bij deze ongewenste maten, zoals de een afgebeeld, zijn nog steeds sequenced vaak met succes met slechts een lichte daling in clusters van efficiëntie.
Hoge tarieven van PCR overlappingen moeten worden vermeden omdat dit drastisch het aantal bruikbare volgorde leest vermindert. Het tarief van PCR duplicaten is direct gerelateerd aan de hoeveelheid uitgangsmateriaal. Met behulp van meer input daarom verlicht meestal problemen met PCR dubbel.
Hogere aantallen leest gefilterd door Lees oriëntatie ()figuur 2B) geven onvoldoende vertering, die kan het resultaat van het gebruik van te weinig enzym, teveel uitgangsmateriaal of onvolledige homogenisering van de embryo's.

Chromatine conformatie vastleggen (3C) heeft ontpopt als een buitengewoon nuttig methode om te studeren van de topologie van de chromatine in de kern1. De variant 3C Hi-C kunt meten de contact frequenties van alle chromatine interacties die in de kern in een enkele experiment2 plaatsvinden. Toepassing van Hi-C speelde een belangrijke rol in de ontdekking en karakterisering van vele fundamentele beginselen van chromatine organisatie, zoals TADs, compartimenten en lussen3,4,5.
Studies van chromatine architectuur in het kader van de ontwikkelingsdoelen overgangen en celdifferentiatie worden steeds vaker gebruikt te ontrafelen van de mechanismen van genregulatie tijdens deze processen6,7,8, 9. Een van de modelorganismen van groot belang is de Drosophila melanogaster, wiens ontwikkeling en genoom worden goed gekenmerkt. Echter, enkele studies die onderzoeken van de architectuur van de chromatine in Drosophila buiten in vitro weefselkweek instellingen zijn uitgevoerd10,11. In embryo's werden 16-18 h post bevruchting, TADs en compartimenten die doet denken aan soortgelijke structuren in zoogdieren geïdentificeerde10, waarin werpt de vraag welke rol ze in genregulatie tijdens Drosophila embryo spelen ontwikkeling. Vooral in de vroege stadia van ontwikkeling, vóór gastrulatie, zijn dergelijke studies technisch uitdagend. Voordat gastrulatie ondergaan Drosophila embryo's 13 synchrone nucleaire divisies die gaan over een uiterst snelle tempo van de 8-60 min per cyclus12,13. Naast dit, het gebrek aan visuele functies te onderscheiden van de verschillende fasen maken het moeilijk strak geënsceneerde embryo materiaal in voldoende hoeveelheden aan te schaffen.
Oog op de ontwikkeling van een protocol waarmee het bestuderen van de chromatine architectuur in de vroege ontwikkeling van de Drosophila op de resolutie van de nucleaire kringloop, gecombineerd we twee bestaande technieken: in situ Hi-C, waarmee de generatie van hoge resolutie hele genoom contact kaarten5, en de embryo enscenering opdrachtregel een transgene Drosophila uiting van een eGFP-PCNA transgenic13,14. Deze transgenic lokaliseert op de nucleus tijdens de interfase en verspreidt gedurende de syncytieel blastoderm tijdens de mitose. Met behulp van deze eigenschap, is het mogelijk om gemakkelijk onderscheiden verschillende stadia van hun nucleaire dichtheid en mitotische embryo's door de verspreiding van het GFP-signaal.
Deze technieken kunnen samen, bestuderen van de driedimensionale structuur van de chromatine in hoge resolutie uit zo weinig als 20 Drosophila embryo's. Dit protocol bevat de instructies voor het verzamelen en sorteren van Drosophila embryo's te verkrijgen van de populaties van embryo's uit een cyclus van enkele nucleaire divisie. Het wordt verder beschreven hoe de verkregen embryo's worden gebruikt om uit te voeren in situ Hi-C. Het eindresultaat is een nucleotide bibliotheek geschikt voor het rangschikken op volgende generatie sequencing machines. De resulterende sequencing leest kunnen vervolgens worden verwerkt tot gedetailleerde chromatine interactie kaarten die betrekking hebben op het volledige genoom van Drosophila .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dATP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>19524016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MboI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0147L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase I Klenow Fragment</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0012</td>
			<td>T4 DNA Ligase Buffer included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina&#160;(Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335</td>
			<td>Sequencing Adaptor, Forward (unindexed) PCR primer and Reverse (indexed) PCR primer and USER enzyme used in the Library preparation section are components of this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645</td>
			<td>End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix and Polymerase Master Mix used in the Library preparation section are components of this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S2 AFA System</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon cell strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td>Embryo collection baskets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>437536C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>122062.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165 FC fluorescent stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165 FC DFC camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal micro pestle</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P985.1</td>
			<td>Used to lyse embryos in step 4.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3832,0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65002</td>
			<td>Streptavidin coated magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP-PCNA flies</td>
			<td>Gift from S. Blythe and E. Wieschaus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite 13%</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer pH 8.0 (1 M) for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Nucleotide Mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814362001</td>
			<td>Unmodified dCTP, dGTP, dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M solution for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate 3M pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Mixer RM-2L</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5729802</td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td>Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Embryo Collection Cages</td>
			<td>Flystuff.com</td>
			<td>59-100</td>
			<td>Egg collection cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube strips</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7202S</td>
			<td>T4 DNA Polymerase buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genome-wide chromatin conformation capture libraries from tightly staged early drosophila embryos

Onderzoeken van de driedimensionale structuur van de chromatine biedt onschatbaar inzicht in de mechanismen van de genexpressie. Hier beschrijven we een protocol voor het uitvoeren van de chromatine conformatie capture techniek in situ Hi-C op geënsceneerd Drosophila melanogaster embryo populaties. Het resultaat is een sequencing-bibliotheek waarmee de toewijzing van alle chromatine interacties die in de kern in een enkele experiment plaatsvinden. Embryo sorteren gebeurt handmatig met behulp van een fluorescente stereo microscoop en een transgene vlieg lijn met een nucleaire marker. Met behulp van deze techniek, embryo populaties van elke cyclus van nucleaire divisie, en met de gedefinieerde celcyclus status, kan worden verkregen met zeer hoge zuiverheid. Het protocol kan ook worden aangepast aan het sorteren van oudere embryo's buiten gastrulatie. Gesorteerde embryo's worden gebruikt als input voor in situ Hi-C. Alle experimenten, met inbegrip van sequencing bibliotheek voorbereiding, kunnen worden uitgevoerd in vijf dagen. Het protocol heeft lage input eisen en werkt betrouwbaar met behulp van 20 blastoderm fase embryo's als uitgangsmateriaal. Het eindresultaat is een bibliotheek van de volgorde voor het volgende generatie rangschikken. Na sequencing, kunnen de gegevens worden verwerkt in genoom-brede chromatine interactie kaarten die kunnen worden geanalyseerd met behulp van een breed scala aan beschikbare hulpmiddelen te krijgen informatie over het koppelen topologisch domeinstructuur (TAD), chromatine loops en chromatine vakken tijdens de Drosophila ontwikkeling.

Gesorteerd op embryo populaties op nucleaire kringloop 12, 13 en 14 (overeenkomend met 1:30, 1:45 en 2:10 uren post bevruchting, respectievelijk12) en 3-4 h post bevruchting (hpf) zijn verkregen overeenkomstig de in het protocol beschreven procedures. Door het nemen van foto's van het signaal van de eGFP-PCNA van iedere partij gesorteerde embryo, is het mogelijk voor het documenteren van de precieze stadium en celcyclus status van elke één embryo die in downstream experimenten wordt gebruikt. Voorbeeld afbeeldingen van embryo's uit gesorteerde populaties worden getoond in figuur 1B-E. De uitvoer van de in situ Hi-C protocol is een nucleotide bibliotheek klaar om te worden sequenced op volgende generatie sequencing machines. Voor dit doel is een definitieve bibliotheek concentratie van ten minste 2-4 nM meestal vereist. Het gebruik van de aanbevolen hoeveelheid uitgangsmateriaal, deze concentratie is betrouwbaar bereikt (tabel 1).
De verwachte grootteverdeling van de fragmenten van DNA na maat keuze tussen 300 en 600 bp, met een maximum aan ongeveer 500 bp ()figuur 2A), afhankelijk van de exacte schuintrekken en grootte selectie parameters is. Voor sequencing raden we gekoppeld-einde leest van ten minste 75 bp lengte om het aantal unmappable beperkingsfragmenten in het genoom te minimaliseren. Hoge-resolutie kaarten met 1 – 2 kb bin grootte kunnen worden verkregen bij 400 miljoen leest. Het is raadzaam om elk, in plaats van een enkele repliceren op zeer hoge diepte sequencing rangschikken van meerdere biologische wordt gerepliceerd op een lagere diepte van 150 miljoen ~ leest. Dit maakt van de beoordeling van de biologische variatie en leidt tot een lager aantal afgedankte leest als gevolg van PCR duplicatie. Voor visuele weergave, kunnen de duplo's worden gecombineerd. Alvorens aan de sequencing van een monster op hoge diepte, is het raadzaam voorbeelden met behulp van ondiepe rangschikken (een paar miljoen leest per monster) om te bepalen van fundamentele bibliotheek kwaliteitsparameters zoals in figuur 2Buitvoeren.
Analyse van Hi-C gegevens vereist aanzienlijke computationele middelen en bio-informatica expertise. Als een kort overzicht, de gepaarde leest onafhankelijk worden toegewezen aan het genoom van de verwijzing, de daaruit voortvloeiende aanpassingen zijn gefilterd voor kwaliteit en de afdrukstand, dan een matrix van contacten op een bepaalde opslaglocatie-resolutie of fragment-niveau kan worden gegenereerd uit de gefilterde uitlijning. De contact matrix is de basis voor alle verdere downstream analyse verkennen TADs, loops en compartimenten. Voor de eerste analyse van de volgorde leest, zijn verschillende bioinformatics pijpleidingen beschikbaar waarmee de verwerking van ruwe leest in contact matrices zonder veel gespecialiseerde bioinformatics kennis18,19, 20,21,22,23. Hoe verdere analyse gebeurt hangt grotendeels af van de exacte biologische vraag bestudeerde en wellicht aanzienlijke ervaring in het programmeren en scripting in R of Python. Diverse gereedschappen en algoritmen Bel TADs zijn echter beschikbaar5,24,25,26,27,28, evenals software om te analyseren en Hi-C gegevens in de webbrowser en als stand-alone desktop applicaties29,30,31,32te verkennen.
Zodra verwerkt, kan de kwaliteit van de bibliotheek worden bepaald met behulp van verschillende statistieken (figuur 2B). Als eerste moet het tempo van de PCR duplicaten, oftewel het aantal gesequenceerd Lees paren die voortvloeien uit de oorspronkelijke molecuul, worden zo laag mogelijk om de hoeveelheid verspilde volgorde leest te beperken. Maar zelfs bibliotheken met > 40% PCR dubbel kan worden verwerkt tot hoogwaardige contact kaarten als de duplicaten zijn gefilterd. Ten tweede, het tarief van gefilterde luidt vanwege hun geaardheid, zoals beschreven in4, consequent moet lager dan 10% van de uitgelijnde Lees paren.
Tijdens pre gastrular ontwikkeling van Drosophila tussen nucleaire kringloop 12 en 14 is de nucleaire architectuur drastisch verbouwd33 (Figuur 3). Op nucleaire kringloop 12, paar TADs worden gedetecteerd en de algemene verdeling van contacten is erg glad zonder veel te onderscheiden functies. Dit is dramatisch veranderde op nucleaire kringloop 13 en 14, toen TADs steeds prominenter zijn en aspecifieke lange-afstands contacten zijn uitgeput.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig1.jpg"> Figuur 1: representatieve foto's van eGFP-PCNA embryo's bij het sorteren. (A) eGFP-PCNA signaal van een niet-gesorteerde bevolking van embryo's na 60 min collectie en 2 uur incubatie bij 25 ° C (B-E) voorbeelden van embryo's uit gesorteerde populaties op nucleaire kringloop 12 (B), nucleaire cyclus 13 (C), 14 (van de nucleaire kringloop D), en uit embryo's synchrone mitose (E) ondergaan. Schaal bars = 200 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig2.jpg"> Figuur 2: Voorbeelden van in situ Hi-C bibliotheek kwaliteit statistieken. (A) Bioanalyzer sporen waarin de verdeling van DNA fragment maten uit een succesvolle Hi-C-bibliotheek (Library 1, top) en uit een bibliotheek waarin een piek van fragmenten die te groot zijn voor het rangschikken (bibliotheek 2, onderaan). Bibliotheek 2 was succesvol sequenced, maar zelfs grotere hoeveelheden ongewenste DNA-fragmenten kunnen leiden tot verminderde sequencing opbrengsten. (B) statistieken van twee Hi-C bibliotheken filteren: het aantal uitgelijnde Lees paren die worden uitgesloten van verdere analyse als gevolg lees richting en afstand (naar binnen, naar buiten)4 of PCR duplicatie (duplicate) weergegeven is. In elke staaf, zijn het aantal leest het filter (resterende) passeren en falende (gefilterd) uitgezet. Het percentage van luidt het filter passeren wordt bovendien weergegeven als tekst. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig3.jpg"> Figuur 3: Hi-C interactie kaarten van gefaseerde embryo's. Hi-C interactie kaarten zijn bij 10 kb resolutie weggegooid en evenwichtige zoals beschreven voor33. Komt te staan is een regio op chromosoom 2 L. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bibliotheek</td>
			<td>Stadium</td>
			<td>Aantal embryo 's</td>
			<td>Bedrag DNA voordat scheren (ng)</td>
			<td>Cycli van PCR</td>
			<td>Definitieve bibliotheek concentratie (nM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>nucleaire kringloop 12</td>
			<td>71</td>
			<td>46</td>
			<td>12</td>
			<td>28.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>nucleaire kringloop 12</td>
			<td>46</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>nucleaire kringloop 12</td>
			<td>60</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>nucleaire kringloop 13</td>
			<td>36</td>
			<td>39</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>nucleaire kringloop 13</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>nucleaire kringloop 13</td>
			<td>48</td>
			<td>18</td>
			<td>12</td>
			<td>8.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>nucleaire kringloop 14</td>
			<td>33</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>39,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>nucleaire kringloop 14</td>
			<td>24</td>
			<td>36</td>
			<td>12</td>
			<td>20.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>nucleaire kringloop 14</td>
			<td>14</td>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>17</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>24,0</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>18</td>
			<td>42</td>
			<td>11</td>
			<td>19.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>22</td>
			<td>63</td>
			<td>11</td>
			<td>48.4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: lijst van representatieve sequencing bibliotheek statistieken. Voor elke bibliotheek in de lijst, het aantal embryo's die werden gebruikt voor de generatie, het bedrag van de totale DNA vóór Biotine pulldown en afknippen gemeten door Qubit, cycli het aantal PCR gebruikt voor amplificatie, en de uiteindelijke concentratie van de sequencing-bibliotheek na zuivering en grootte selectie worden aangegeven.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos at JoVE.com

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Dit werk beschrijft een protocol voor het genereren van hoge resolutie in situ Hi-C bibliotheken van strak geënsceneerd pre gastrulatie Drosophila melanogaster embryo's.

Generatie van genoom-brede chromatine conformatie Capture bibliotheken uit strak geënsceneerde vroege Drosophila embryo 's

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van chromatinearchitectuur, zoals hoe de 3D-structuur van chromatine de genexpressie en -ontwikkeling kan beïnvloeden. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een hoge resolutie weergave van chromatine architectuur en precies geënsceneerde vliegen embryo's biedt. Hoewel deze methode inzicht kan geven in chromatineorganisatie en -ontwikkeling, kan men ook bestaande lijnen uit transgene vliegbibliotheken gebruiken om hun effect in chromatineorganisatie te testen.Om het protocol te beginnen, past u het totale volume van eerder verzamelde embryo's aan op twee milliliter met PBST. Voeg zes milliliter heptaan en 100 microliter van 37% formaldehyde toe aan water. Na het toevoegen van formaldehyde, krachtig schudden de buis op en neer voor een minuut.De waterige en organische fase zal samen een shampoo-achtige consistentie vormen. Roer het mengsel op een roterende mixer gedurende 10 minuten. Centrifugeren de buis op 500 keer g gedurende een minuut bij kamertemperatuur om embryo's te verzamelen aan de onderkant van de buis.Aspirate de hele shampoo-achtige vloeistof en gooi het weg, waarbij je ervoor zorgt dat je geen embryo's aanzuit. 15 minuten na de toevoeging van formaldehyde, resuspend de embryo's in vijf milliliter PBST met 125 millimolar glycine. Schud de embryo's een minuut op en neer.Na het centrifugeren, aspirate de supernatant. Breng met behulp van een pipet van 1.000 microliter een partij van 100 embryo's over naar een klein glazen vat dat geschikt is om te sorteren, bij voorkeur op een donkere achtergrond en plaats deze op ijs. Sorteer embryo's op kerndichtheid en celcyclusstatus met behulp van een naald- of spuitpunt.Verwijder alle mitotische embryo's herkenbaar aan hun verspreide, niet-nucleaire distributie van EGFP PCNA en embryo's die gedeeltelijk een niet-nucleair GFP-signaal vertonen. Om de sortering te bevorderen, worden referentieembryo's in kerncycli 12, 13 en 14 in elke partij opgesteld om embryo's te matchen met een van de referentieembryo's. Pipette de gewenste embryo's met behulp van een 1.000 microliter pipet.Breng ze naar een verse buis en leg ze op ijs. Ga door totdat er voldoende embryo's zijn gesorteerd voor het geplande experiment. Spin buizen kort op 100 keer g bij kamertemperatuur.Verwijder de supernatant en zorg ervoor dat de embryo's zo droog mogelijk zijn om te bevriezen. Flash bevriezen embryo's door het onderdompelen van de buizen in vloeibare stikstof en op te slaan op min 80 graden Celsius. Leg de buizen met ingevroren embryo's op ijs.De embryo's worden opnieuw opgetrokken in 500 microliters met een ijskoude lysebuffer. Wacht een minuut om het embryo te laten nestelen aan de onderkant van de buis. Maal vervolgens de embryo's met een metalen micro stamper voorgekoeld op ijs dat is ontworpen om strak te passen een 1,5 milliliter microcentrifuge buis.Om te voorkomen dat de embryo's worden geagiteerd, plaatst u de stamper langzaam totdat deze de onderkant van de buis raakt. Duw naar beneden en maal vervolgens door het draaien van de stamper twee keer in beide richtingen. Til de stamper heel licht op.Duw nogmaals naar de bodem van de buis en herhaal de slijpprocedure 10 keer of totdat de embryo's volledig zijn gelyseerd. De oplossing moet homogeen zijn en er mogen geen resterende grote stukjes embryo's overblijven. Broed de gehomogeniseerde suspensie op ijs gedurende 15 minuten.Draai vijf minuten lang op 1.000 g vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg en was de pellet door de 500 microliter ijskoude buffer op en neer te brengen. Na een andere spin, gooi de supernatant.De gewassen pellet opnieuw opblazen in 100 microliter van 0,5%Natrium Dodecyl Sulfaat of SDS. Vervolgens permeabiliseren van de kernen door het uitbroeden van het monster gedurende 10 minuten op 65 graden Celsius in een verwarmingsblok. Voeg 50 microliter van 10% Triton X100 en 120 microliter water toe.Veeg op de buis om de inhoud te mengen en de buis 15 minuten in een warmteblok uit te broeden op 37 graden Celsius. Voeg 25 microliter van 10X restrictie enzym buffer en 20 eenheden van vijf eenheden per microliter MBO1. Veeg de buis om de inhoud te mengen en de buis in een hitteblok uit te broeden om het DNA te verteren.Tel daar nog eens 20 eenheden MBO1 bij op. Zet de incubatie gedurende 90 minuten voort. Na de tweede incubatie van 90 minuten, incuberen de steekproef bij 62 graden Celsius gedurende 20 minuten om de MBO1 inactief.Voeg vervolgens 18 microliter van 0,4 millimolar biotine 14-dATP, 2,25 microliter van een ongewijzigde 3,3 millimolar dCTP-dGTP-dTTP-mix toe en acht microliter van vijf eenheden per microliter DNA polymerase I Klenow-fragment. Veeg op de buis om de inhoud te mengen en het monster gedurende 90 minuten op 37 graden Celsius uit te broeden. Voeg vervolgens 657 microliter water toe, 120 microliter 10x T4 DNA-ligasebuffer, 100 microliter van 10%Triton X100, zes microliter van 20 milligram per milliliter runderserum albumine en tenslotte vijf microliter van vijf eenheden per microliter T4 DNA-ligase.Draai vervolgens de buis twee uur zachtjes bij 20 RPM bij kamertemperatuur. Voeg nog eens vijf microliter van vijf eenheden per microliter T4 DNA ligase toe. Blijf nog twee uur draaien en draai vervolgens vijf minuten naar beneden op 2, 500 keer g.Na centrifugatie, gooi de supernatant. Resuspend de pellet in 500 microliters van extractie buffer en voeg 20 microliter van 20 milligram per milliliter proteinase K.Flick de buis en incubeer de buis om het eiwit te verteren. Voeg 130 microliter van vijf molaire natriumchloride toe en broed 's nachts aan de-crosslink.De volgende dag, pipette het monster in een nieuwe twee milliliter buis met lage DNA-binding kenmerken. Voeg 0,1x volume van drie molaire natriumacetaat en twee microliter van 15 milligram per milliliter GlycoBlue. Voeg 1,6 volumes pure absolute ethanol toe en keer de inhoud om en ontcubeer het monster 15 minuten bij min 80 graden Celsius.Na incubatie, centrifugeren de inhoud. Zoek de DNA-pellet die alleen kan worden gespot door de GlycoBlue. Verwijder de supernatant voorzichtig, het verplaatsen van de pipet tip in de buis langs de tegenoverliggende muur van de DNA-pellet.Was de pellet met 800 microliter van 70% ethanol. Meng het monster door het om te keren en centrifuge het op 20,000 keer g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Verwijder de resterende druppels tijdens deze stap en de volgende wast door ze te duwen uit de buizen met een P10 tip, dan open deksel aan de lucht drogen voor maximaal vijf minuten.Zodra er geen vloeistof overblijft, voeg 50 microliter van 10 millimolar trischloride toe. Herhaaldelijk pipette de oplossing over het gebied waar de pellet zich bevond om het DNA op te nemen. Voeg een microliter van 20 milligram per milliliter RNase A.Mix door flicking de buis.Incubeer het monster op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten te verteren RNA. Tot slot, bewaar het monster in de vriezer of koelkast tot de bibliotheek voorbereiding. Afbeeldingen van het EGFP PCNA-signaal van elke gesorteerde embryobatch tonen nauwkeurige fase- en celcyclusstatussen van elk embryo voor downstream-experimenten.Bioanalyzer sporen tonen aan dat de grootteverdeling van DNA-fragmenten na grootteselectie tussen 300 en 700 basisparen is met een maximum op ongeveer 450 basisparen. Hi-C interactie kaarten blijkt dat op nucleaire cyclus 12, weinig Topologically Associated Domains of TAC's worden gedetecteerd die drastisch verandert op nucleaire cycli 13 en 14 wanneer TAC's zijn steeds prominenter en niet-specifieke lange afstand contacten worden uitgeput. Tijdens een poging tot deze procedure, is het belangrijk om te onthouden om de kralen grondig te wassen en niet om incubatietijden onnodig te verlengen, vooral bij hoge temperaturen, omdat dit kan leiden tot lage kwaliteit Hi-C bibliotheken.Deze techniek die nauwkeurige enscenering en chromatinebevestigingstoewijzing met hoge resolutie combineert, maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van epigenetica om de rol van driedimensionale chromatineorganisatie in een in vivo ontwikkelingsomgeving te verkennen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genoom-brede analyse van zoogdieren Replication Timing door DNA Content Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generatie van inheemse chromatine Immunoprecipitation Sequencing bibliotheken nucleosoom dichtheid p.a.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Toewijzing genoom-brede toegankelijk chromatine in primaire menselijke T lymfocyten door ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotor Capture Hi-C: High-resolution, genoom-brede profilering van promotor interacties

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-gemedieerde reorganisatie van chromatine lusstructuur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genoom-brede Surveillance van transcriptie fouten in eukaryote organismen

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

High-throughput identificatie van regelgevende gensequenties met behulp van Next-generation Sequencing van circulaire chromosoom conformatie Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identificatie van enhancer-promotor contacten in embryoïide lichamen door kwantitatieve chromosoomconformatie Capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Genoombrede analyse van histonmodificatieverdeling met behulp van de chromatine-immunoprecipitatie-sequencingmethode in Magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Chromosome Conformation Capture (3C) for Undergraduate Research and Teaching

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates (Video) | JoVE 

Een A krijgen met de 3C's: chromosoomconformatie-opname voor studenten

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...