Name: generation of genome-wide chromatin conformation capture libraries from tightly staged early drosophila embryos
Uploaded: 2018-10-03T13:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos at JoVE.com

Cette recherche a été financée par la Société Max Planck. C.B.H. a été soutenu par une bourse de l’International Max Planck Research School – biomédecine moléculaire. Nous remercions Shelby Blythe et Eric Wieschaus aimablement la ligne de melanogaster de drosophile eGFP-PCNA.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole présenté ici est très efficace pour générer des cartes de qualité de l’architecture de la chromatine dans des embryons de drosophile au début. Par rapport à un précédent protocole34, l’approche décrite ici utilise un jour in situ CIH procédure5, résultant en un traitement plus rapide, une résolution plus élevée et moins son utilisation réactif. La procédure globale, y compris le protocole de CIH in situ est censée travailler sur un large éventail d’étapes et de systèmes expérimentaux en dehors de la drosophile. Étant donné que le protocole a une exigence d’entrée faible, il pourrait également être utilisé sur les populations de cellules isolées. Chez la drosophile, lors de l’utilisation du protocole pour les embryons en dehors de la plage décrite ici, certains paramètres, notamment la fixation de la matière, peut devoir être ajustée. Étant donné que les embryons plus âgés développent une cuticule hautement imperméable, augmentant la concentration de formaldéhyde et de prolonger la fixation peuvent être appropriés. Pour la collecte d’embryons aux stades autres que nucléaire cycle 14, les temps d’incubation des embryons à 25 ° C à l’étape 1.4 devant être modifiées comme suit : cycle nucléaire 12, 70 min ; cycle nucléaire 13, 90 min ; 3 – 4 hpf, 03:30 h.
Au cours des divisions de 13 clivage (étape 1-4), la densité des noyaux double à peu près à chaque division. Les noyaux peuvent facilement être identifiés par leur fluorescence GFP brillante. Au cours de la mitose, eGFP-PCNA ne se trouve pas dans le noyau, et son signal est dispersé tout au long de l’embryon. Cette caractéristique rend identification des embryons qui font l’objet d’une division de clivage synchrone possible. Pour étudier la conformation de la chromatine, ces embryons mitotiques ne sont généralement pas souhaitables, puisque l’organisation mitotique de la chromatine est radicalement différente de l’interphase organisation35. Il est possible d’adapter le protocole afin de sélectionner les embryons subissant une division mitotique synchrone. Dans ce cas, seuls les embryons avec distribution dispersée, non-nucléaire d’eGFP-PCNA doivent être conservés, et tous les autres embryons devraient être jetées. Puisque la densité nucléaire ne peut pas être déterminée, les méthodes alternatives d’embryons au stade de leur morphologie lus en microscopie photonique transmise doivent être employés. Présence de noyaux à la périphérie de l’embryon et les cellules de mât indiquent que l’embryon a complété au moins nucléaire cycle 9, alors que la cellularisation visible à la périphérie indique cycle nucléaire 1412.
Salut-C expériences peuvent être effectuées avec succès en utilisant une variété d’enzymes de restriction,5. Les approches actuelles utilisent généralement des enzymes qui reconnaissent soit une séquence de 4-base, tels que MboI, ou un site de reconnaissance 6-base, tels que HindIII. L’avantage de fraises 4-base sur base de 6 coupeurs est qu’ils offrent une meilleure résolution potentielle, donnée assez de profondeur séquençage et une couverture plus homogène de sites de restriction au sein du génome. Il n’y a aucun avantage évident en choisissant un couteau 4-base sur un autre5,23,36,37. Les deux enzymes les plus couramment utilisés, MboI et DpnII, tous deux reconnaissent le même site de reconnaissance GATC. DpnII est moins sensible à la méthylation de CpG, qui est d’aucun intérêt chez la drosophile. Le protocole présenté ici peut également être complété avec succès en utilisant DpnII comme une enzyme de restriction. Dans la section 4.2. enzyme de restriction et tampon doivent être ajustés pour la compatibilité DpnII, selon les recommandations du fabricant.
Si la taille du fragment de la bibliothèque de séquençage s’écarte sensiblement de la gamme illustrée à la Figure 2 a, la formation de cluster pendant le séquencement peut s’avérer moins efficace ou échouer complètement. Dans ce cas, la distribution de la taille après la tonte doit être vérifiée et cisaillement paramètres ajustés en conséquence. Pics dans la distribution des fragments d’ADN de très petites (< 100 bp) ou très grande taille (> 1 000 bp) tailles signale des problèmes avec sélection de taille, tels que porter plus de perles ou de surnageant qui sont censés être mis au rebut. Souvent, ces bibliothèques avec des petites pointes à ces tailles indésirables, tels que l’un sur la photo, sont encore séquencé avec succès avec seulement une diminution mineure efficacité de clustering.
Des taux élevés de duplication de PCR doivent être évitées car cela réduit considérablement le nombre de lectures de séquence utilisable. Le taux de PCR doublons est directement lié à la quantité de matières entrantes. En utilisant plus d’entrées donc habituellement atténue les problèmes de duplication de PCR.
Un nombre plus élevé de lectures filtrés en raison de l’orientation de lecture ()Figure 2 b) indique la digestion insuffisante, qui peut être le résultat de l’utilisation trop peu enzyme, trop d’entrée matériau ou incomplète homogénéisation des embryons.

Capture de conformation de la chromatine (3C) est devenue une méthode particulièrement utile pour étudier la topologie de la chromatine dans le noyau1. La variante 3C Hi-C permet de mesurer les fréquences de contact de toutes les interactions de la chromatine qui se produisent dans le noyau en une seule expérience2. Application du CIH a joué un rôle important dans la découverte et la caractérisation de nombreux principes fondamentaux d’organisation de la chromatine, comme dat, compartiments et boucles3,4,5.
Études d’architecture de la chromatine dans le contexte des transitions du développement et de différenciation cellulaire sont de plus en plus utilisés à élucider les mécanismes de régulation des gènes au cours de ces processus6,7,8, 9. Parmi les organismes modèles d’un grand intérêt est Drosophila melanogaster, dont développement et génome sont bien caractérisés. Cependant, peu d’études qui examinent l’architecture de la chromatine dans la drosophile en dehors de l’in vitro culture tissulaire, les paramètres ont été réalisées10,11. Chez les embryons, 16 – 18 h après la fécondation, DAT et compartiments qui rappelle des structures similaires chez les mammifères ont été identifiés10, qui soulève la question de quel rôle ils jouent dans la régulation des gènes au cours de l’embryon de drosophile développement. Surtout dans les premiers stades de développement, avant la gastrulation, ces études sont techniquement difficiles. Avant la gastrulation, des embryons de drosophile subissent 13 divisions nucléaires synchrones qui procèdent à un rythme extrêmement rapid de 8 – 60 min par cycle12,13. En outre, l’absence de caractéristiques visuelles de distinguer les différentes étapes le rendent difficile obtenir un embryon solidement mises en scène matériel en quantité suffisante.
Afin d’élaborer un protocole qui permet d’étudier l’architecture de la chromatine dans le développement précoce de drosophile à résolution du cycle nucléaire, nous avons combiné les deux techniques existantes : in situ Hi-C, qui permet à toute la génération des images haute résolution génome contact cartes5et mise en scène d’embryon à l’aide d’une ligne de Drosophila transgénique exprimant eGFP-PCNA transgène13,14. Ce transgène se localise dans le noyau pendant l’interphase et se disperse dans le blastoderme syncytial au cours de la mitose. À l’aide de cette propriété, il est possible de distinguer facilement les différentes étapes de leur densité nucléaire et embryons mitotiques de la dispersion du signal GFP.
Ensemble, ces techniques permettent l’étude de la structure tridimensionnelle de la chromatine en haute résolution à partir d’aussi peu que 20 embryons de drosophile . Ce protocole comprend les instructions pour la récolte et le tri des embryons de drosophile pour obtenir les populations d’embryons d’un cycle de division nucléaire unique. Il décrit également comment les embryons obtenus sont utilisés pour effectuer sur place Hi-C. Le résultat final est une bibliothèque de nucléotides appropriée pour l’ordonnancement sur machines de séquençage prochaines génération. Les lectures de séquençage qui en résultent peuvent alors être traités dans des cartes d’interaction chromatine détaillées couvrant tout le génome de la drosophile .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dATP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>19524016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MboI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0147L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase I Klenow Fragment</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0012</td>
			<td>T4 DNA Ligase Buffer included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina&#160;(Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335</td>
			<td>Sequencing Adaptor, Forward (unindexed) PCR primer and Reverse (indexed) PCR primer and USER enzyme used in the Library preparation section are components of this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645</td>
			<td>End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix and Polymerase Master Mix used in the Library preparation section are components of this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S2 AFA System</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon cell strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td>Embryo collection baskets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>437536C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>122062.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165 FC fluorescent stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165 FC DFC camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal micro pestle</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P985.1</td>
			<td>Used to lyse embryos in step 4.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3832,0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65002</td>
			<td>Streptavidin coated magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP-PCNA flies</td>
			<td>Gift from S. Blythe and E. Wieschaus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite 13%</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer pH 8.0 (1 M) for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Nucleotide Mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814362001</td>
			<td>Unmodified dCTP, dGTP, dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M solution for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate 3M pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Mixer RM-2L</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5729802</td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td>Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Embryo Collection Cages</td>
			<td>Flystuff.com</td>
			<td>59-100</td>
			<td>Egg collection cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube strips</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7202S</td>
			<td>T4 DNA Polymerase buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genome-wide chromatin conformation capture libraries from tightly staged early drosophila embryos

Étudier l’architecture tridimensionnelle de la chromatine offre un aperçu précieux sur les mécanismes de régulation génique. Nous décrivons ici un protocole permettant d’effectuer la chromatine conformation capture technique in situ CIH sur mise en scène de populations d’embryon de drosophile . Le résultat est une bibliothèque de séquençage qui permet la cartographie de toutes les interactions de la chromatine qui se produisent dans le noyau en une seule expérience. Tri des embryons se fait manuellement à l’aide d’un microscope stéréo fluorescent et une ligne mouche transgénique contenant un marqueur nucléaire. En utilisant cette technique, les populations d’embryon de chaque cycle de division nucléaire et possédant un statut défini cycle cellulaire, peut être obtenue avec une très grande pureté. Le protocole peut également être adapté pour trier les embryons âgés au-delà de gastrulation. Trié les embryons sont utilisés comme entrées pour in situ Hi-C. Toutes les expériences, y compris le séquençage de préparation de la bibliothèque, peuvent être complétées en cinq jours. Le protocole a de faibles exigences d’entrée et fonctionne de manière fiable à l’aide de 20 embryons au stade blastoderme comme matières. Le résultat final est une bibliothèque de séquençage pour le séquençage de la génération suivante. Après le séquençage, les données peuvent être transformées en cartes d’interaction de chromatine Génome-large qui peuvent être analysés à l’aide d’un large éventail d’outils disponibles pour obtenir des informations sur l’Association topologiquement structure du domaine (TAD), des boucles de la chromatine et la chromatine compartiments au cours du développement de la drosophile .

Tri des populations de l’embryon au cycle nucléaire, 12, 13 et 14 (correspondant à 01:30, 01:45 et 02:10 heures après la fécondation, respectivement12) et 3 à 4 h après la fécondation (hpf) ont été obtenus selon les procédures décrites dans le protocole. En prenant des photos du signal eGFP-PCNA de chaque lot d’embryon trié, il est possible de documenter le statut exact de scène et cycle cellulaire de chaque embryon unique qui est utilisé dans des expériences en aval. Photos d’exemple d’embryons provenant de populations triées sont indiquées dans la Figure 1 b-E. La sortie de la protocole de CIH in situ est une bibliothèque de nucléotides prête à séquencer sur des machines de séquençage de génération suivante. À cet effet, une concentration finale de bibliothèque d’au moins 2 à 4 nM est habituellement exigée. En utilisant les apports recommandés de matières entrantes, cette concentration est fiable obtenus (tableau 1).
La distribution de la taille attendue de fragments d’ADN après que sélection de la taille est entre 300 à 600 ans bp, avec un maximum à environ 500 bp (Figure 2 a),) selon la tonte exacte et les paramètres de sélection de taille. Pour le séquençage, nous vous recommandons de lectures jumelé-fin d’au moins 75 longueur de bp pour réduire le nombre de fragments de restriction non mappable dans le génome. Des cartes à haute résolution avec 1 à 2 Ko bin taille peuvent provenir de 400 millions de lectures. Nous vous recommandons de séquençage des réplicats biologiques multiples à une profondeur inférieure de 150 millions lit chacune, au lieu de séquençage simple reprend à très grande profondeur. Cela permet d’évaluer la variation biologique et conduit à un nombre inférieur de lectures mis au rebut en raison de la duplication de la PCR. Représentation visuelle, les répétitions peuvent être combinées. Avant de s’engager pour le séquençage d’un échantillon à grande profondeur, nous vous recommandons d’exécuter des échantillons à l’aide de séquençage peu profond (quelques millions de lectures par exemple) afin de déterminer les paramètres de qualité de bibliothèque de base comme dans la Figure 2 b.
Analyse des données de la CIH requiert une grande compétence computationnelle de ressources et de la bioinformatique. Comme un aperçu approximatif, les lectures appariés sont mappés indépendamment sur le génome de référence, les alignements qui en résultent sont filtrés pour la qualité et l’orientation, puis une matrice de contacts à un niveau de résolution ou un fragment de donnée bin peut provenir de la filtrée alignements. La matrice de contact est la base de tout plus en aval analyse exploration dat, boucles et compartiments. Pour l’analyse initiale des lectures de séquençage, il existe plusieurs pipelines de bioinformatique qui permettent la transformation de lectures brutes en contact matrices sans beaucoup bioinformatique spécialisée connaissances18,19, 20,21,22,23. Comment une analyse plus approfondie est faite hors dépend en grande partie la question biologique exacte à l’étude et peuvent nécessiter une expérience significative dans la programmation et de script en Python ou en R. Toutefois, plusieurs outils et algorithmes d’appeler dat sont disponibles5,24,25,26,27,28, mais aussi des logiciels pour analyser et Explorez Hi-C données dans le navigateur web et des applications de bureau autonome29,30,31,32.
Une fois traitée, la qualité de la bibliothèque peut être déterminée à l’aide de différents paramètres (Figure 2 b). Tout d’abord, le taux de doublons PCR, qui correspond au nombre de paires de lecture séquencées découlant de la même molécule originale, doit être aussi faible que possible limiter la quantité de séquence gaspillé lectures. Cependant, même avec les bibliothèques > duplication PCR 40 % peut être transformée en qualité cartes contact si les doublons sont filtrés. Deuxièmement, les lectures filtrés en raison de leur orientation, tel que décrit dans4, constamment sera inférieur à 10 % de paires de lecture alignés.
Au cours du développement pré gastrula de drosophile entre cycle nucléaire 12 et 14, l’architecture nucléaire est radicalement rénové33 (Figure 3). Au cycle nucléaire 12, quelques dat est détectés et la répartition générale des contacts est très lisse sans les nombreuses fonctionnalités discernables. C’est radicalement changé au cycle nucléaire 13 et 14, lorsque dat sont toujours plus importants et non-spécifique contacts à longue distance sont épuisés.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig1.jpg"> Figure 1 : images représentant des embryons eGFP-PCNA pendant tri. Signal eGFP-PCNA (A) d’une population non trié d’embryons après que collecte de 60 min et 2 h d’incubation à 25 ° C (B-E) exemples d’embryons provenant de populations triées au cycle nucléaire 12 (B), nuclear cycle 13 (C), (14) cycle nucléaire ( D) et des embryons en cours de mitose synchrone (E). Barreaux de l’échelle = 200 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig2.jpg"> Figure 2 : Exemples de mesures de qualité in situ CIH bibliothèque. (A) Bioanalyzer traces montrant la distribution des tailles de fragment d’ADN auprès d’une bibliothèque de CIH réussie (bibliothèque 1, haut de la page) et d’une bibliothèque qui affiche un pic de fragments qui sont trop grands pour le séquençage (bibliothèque 2, bottom). Bibliothèque 2 a été séquencé avec succès, mais encore de plus grandes quantités de fragments d’ADN non désirés peuvent mener à une diminution de séquençage des rendements. (B) filtrage statistique des deux bibliothèques de CIH : affichée correspond au nombre de paires de lecture alignés qui sont exclus de l’analyse en raison de la lecture l’orientation et la distance (vers l’intérieur et l’extérieur)4 ou duplication de PCR (en double). Dans chaque bar, le nombre de lectures en passant le filtre (restant) et échec (filtré) est tracé. Le pourcentage de lectures en passant le filtre est en outre montré sous forme de texte. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig3.jpg"> Figure 3 : Salut-C interaction cartes embryons mise en scène de. Salut-C interaction cartes sont mis en cellule à résolution de 10KO et équilibrés comme décrit avant33. Montré est une région sur le chromosome 2 L. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bibliothèque</td>
			<td>Stade</td>
			<td>Nombre d’embryons</td>
			<td>Montant ADN avant le cisaillement (ng)</td>
			<td>Cycles PCR</td>
			<td>Concentration finale de bibliothèque (nM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>cycle nucléaire 12</td>
			<td>71</td>
			<td>46</td>
			<td>12</td>
			<td>28.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>cycle nucléaire 12</td>
			<td>46</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>cycle nucléaire 12</td>
			<td>60</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>cycle nucléaire 13</td>
			<td>36</td>
			<td>39</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>cycle nucléaire 13</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>cycle nucléaire 13</td>
			<td>48</td>
			<td>18</td>
			<td>12</td>
			<td>8.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Nuclear cycle 14</td>
			<td>33</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>39,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>Nuclear cycle 14</td>
			<td>24</td>
			<td>36</td>
			<td>12</td>
			<td>20,4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>Nuclear cycle 14</td>
			<td>14</td>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>17</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>24,0</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>18</td>
			<td>42</td>
			<td>11</td>
			<td>19.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>22</td>
			<td>63</td>
			<td>11</td>
			<td>48.4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : liste des statistiques de bibliothèques représentatives séquençage. Pour chaque bibliothèque dans la liste, le nombre d’embryons qui ont été utilisés pour sa génération, la quantité d’ADN totale avant la biotine pulldown et cisaillement mesurée par Qubit, le nombre de PCR cycles utilisés pour l’amplification et la concentration finale de la bibliothèque de séquençage Après sélection de purification et de taille sont indiqués.

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Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Cet ouvrage décrit un protocole pour la génération de haute résolution en situ CIH bibliothèques d’étroitement mis en scène la gastrulation Drosophila melanogaster embryons.

Génération de chromatine Genome-wide Conformation Capture bibliothèques d’embryons de drosophile début étroitement mise en scène

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’architecture chromatine comme la façon dont la structure 3D de la chromatine peut influencer l’expression et le développement des gènes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre une vue haute résolution de l’architecture chromatine et des embryons volants mis en scène avec précision. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de l’organisation et du développement de la chromatine, on peut également utiliser les lignes existantes des bibliothèques de mouches transgéniques pour tester leur effet dans l’organisation de la chromatine.Pour commencer le protocole, ajustez le volume total d’embryons précédemment recueillis à deux millilitres avec PBST. Ajouter six millilitres d’heptane et 100 microlitres de formaldéhyde à 37 % dans l’eau. Après avoir ajouté du formaldéhyde, secouez vigoureusement le tube de haut en bas pendant une minute.La phase aqueuse et organique se combinera pour former une consistance de shampooing. Agiter le mélange sur un mélangeur rotatif pendant 10 minutes. Centrifuger le tube à 500 fois g pendant une minute à température ambiante pour recueillir les embryons au fond du tube.Aspirez tout le liquide en forme de shampooing et jetez-le, en prenant soin de ne pas aspirer les embryons. 15 minutes après l’ajout de formaldéhyde, resuspendre les embryons en cinq millilitres de PBST avec 125 millimolaire glycine. Secouez vigoureusement les embryons de haut en bas pendant une minute.Après centrifugage, aspirer le supernatant. À l’aide d’une pipette de 1000 microlitres, transférez un lot de 100 embryons dans un petit récipient en verre adapté au tri, de préférence sur un fond sombre et placez-le sur de la glace. Trier les embryons par densité nucléaire et par état du cycle cellulaire à l’aide d’une aiguille ou d’une pointe de seringue.Enlevez tous les embryons mitotiques reconnaissables par leur distribution dispersée et non nucléaire de l’EGFP PCNA et des embryons qui montrent partiellement un signal GFP non nucléaire. Pour faciliter le tri, alignez des embryons de référence aux cycles nucléaires 12, 13 et 14 dans chaque lot pour faire correspondre les embryons à l’un des embryons de référence. Pipette les embryons désirés à l’aide d’une pipette de 1000 microlitres.Transférez-les dans un tube frais et placez-les sur la glace. Continuer jusqu’à ce que suffisamment d’embryons soient triés pour l’expérience prévue. Faire tourner brièvement les tubes à 100 fois g à température ambiante.Retirer le surnatant et s’assurer que les embryons sont aussi secs que possible pour la congélation. Congelez flash les embryons en vantant les tubes dans de l’azote liquide et stockez à moins 80 degrés Celsius. Déposer les tubes avec des embryons congelés sur la glace.Resuspendez les embryons dans 500 microlitres de tampon de lyse glacée. Attendez une minute pour permettre à l’embryon de se déposer au fond du tube. Ensuite, moudre les embryons avec un micro pilon métallique pré-refroidi sur la glace qui est conçu pour s’adapter étroitement à un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.Pour éviter d’agiter les embryons, insérez le pilon lentement jusqu’à ce qu’il touche le fond du tube. Poussez vers le bas, puis moudre en tournant le pilon deux fois dans les deux directions. Soulevez très légèrement le pilon.Poussez à nouveau au fond du tube et répétez la procédure de broyage 10 fois ou jusqu’à ce que les embryons soient complètement lysés. La solution doit être homogène et aucun gros embryon résiduel ne doit rester. Incuber la suspension homogénéisée sur la glace pendant 15 minutes.Tournez à 1000 fois g quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant et lavez la pastille en réutilisant dans 500 microlitres tampon de lyse glacée et pipetting de haut en bas. Après un autre spin, jeter le surnatant.Resuspendez la pastille lavée dans 100 microlitres de sulfate de dodecyl de sodium de 0,5 % ou SDS. Puis perméabiliser les noyaux en incubant l’échantillon pendant 10 minutes à 65 degrés Celsius dans un bloc chauffant. Ajouter 50 microlitres de 10% Triton X100 et 120 microlitres d’eau.Feuilleter le tube pour mélanger le contenu et incuber le tube à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes dans un bloc thermique. Ajouter 25 microlitres de tampon d’enzyme de restriction 10X et 20 unités de cinq unités par microlitre MBO1. Feuilleter le tube pour mélanger le contenu et incuber le tube dans un bloc thermique pour digérer l’ADN.Ajouter 20 autres unités de MBO1. Poursuivre l’incubation pendant 90 minutes. Après la deuxième incubation de 90 minutes, incuber l’échantillon à 62 degrés Celsius pendant 20 minutes pour inactiver le MBO1.Ensuite, ajoutez 18 microlitres de biotine de 0,4 millimolaire 14-dATP, 2,25 microlitres d’un mélange d’ADN non modifié de 3,3 millimlaires DCTP-dGTP-dTTP, et huit microlitres de cinq unités par fragment d’ADN microliter I Klenow. Feuilleter le tube pour mélanger le contenu et incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes. Ensuite, ajoutez 657 microlitres d’eau, 120 microlitres de tampon ligase d’ADN 10X T4, 100 microlitres de 10% Triton X100, six microlitres de 20 milligrammes par millilitre albumine de sérum bovin, et enfin cinq microlitres de cinq unités par microlitre T4 ligase d’ADN.Ensuite, faites pivoter doucement le tube à 20 RPM à température ambiante pendant deux heures. Ajouter cinq autres microlitres de cinq unités par microlitre T4 ligase d’ADN. Continuez à tourner pendant deux heures de plus, puis faites tourner les noyaux à 2500 fois g pendant cinq minutes.Après centrifugation, jeter le supernatant. Resuspendez la pastille en 500 microlitres de tampon d’extraction et ajoutez 20 microlitres de 20 milligrammes par millilitre proteinase K.Flick le tube et incuber le tube pour digérer la protéine. Ajouter 130 microlitres de cinq molaires de chlorure de sodium et incuber toute la nuit pour dé-croiser.Le lendemain, pipette l’échantillon dans un nouveau tube de deux millilitres avec de faibles caractéristiques de liaison d’ADN. Ajouter 0,1 X de volume de trois acétate de sodium molaire et deux microlitres de 15 milligrammes par millilitre glycoblue. Ajouter 1,6 volume d’éthanol absolu pur et inverser le contenu, puis incuber l’échantillon à moins 80 degrés Celsius pendant 15 minutes.Après l’incubation, centrifuger le contenu. Localisez la pastille d’ADN qui ne peut être repérée que par le GlycoBlue. Retirez soigneusement le surnatant, en déplaçant la pointe de pipette dans le tube le long du mur opposé de la pastille d’ADN.Lavez la pastille avec 800 microlitres de 70% d’éthanol. Mélanger l’échantillon en l’inversant et en le centrifugant à 20 000 fois g à température ambiante pendant cinq minutes. Retirez les gouttelettes restantes pendant cette étape et les lavages suivants en les poussant hors des tubes avec une pointe P10, puis ouvrez le couvercle pour sécher à l’air pendant jusqu’à cinq minutes.Une fois qu’il ne reste plus de liquide, ajouter 50 microlitres de chlorure tris de 10 millimlaires. Pipette à plusieurs reprises la solution sur la zone où la pastille a été localisée pour solubiliser l’ADN. Ajouter un microlitre de 20 milligrammes par millilitre RNase A.Mix en faisant glisser le tube.Incuber l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes pour digérer l’ARN. Enfin, conservez l’échantillon au congélateur ou au réfrigérateur jusqu’à la préparation de la bibliothèque. Les images du signal EGFP PCNA de chaque lot d’embryons triés révèlent des statuts précis du stade et du cycle cellulaire de chaque embryon pour des expériences en aval.Les traces de bioanalyseurs montrent que la distribution de taille des fragments d’ADN après sélection de taille se situe entre 300 et 700 paires de base avec un maximum d’environ 450 paires de base. Les cartes d’interaction Hi-C montrent qu’au cycle nucléaire 12, peu de domaines associés topologically ou TADs sont détectés qui change considérablement aux cycles nucléaires 13 et 14 quand les TAD sont de plus en plus proéminents et les contacts à longue portée non spécifiques sont épuisés. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de laver les perles à fond et de ne pas prolonger inutilement les temps d’incubation, surtout à des températures élevées, car cela peut conduire à des bibliothèques Hi-C de mauvaise qualité.Cette technique combinant une mise en scène précise et une cartographie de confirmation de la chromatine à haute résolution a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’épigénétique afin d’explorer le rôle de l’organisation tridimensionnelle de la chromatine dans un cadre développemental in vivo.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

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Recherche

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