Name: generation of genome-wide chromatin conformation capture libraries from tightly staged early drosophila embryos
Uploaded: 2018-10-03T13:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos at JoVE.com

Diese Forschung wurde von der Max-Planck-Gesellschaft finanziert. C.B.H. wurde durch ein Stipendium von der International Max Planck Research School – molekulare Biomedizin unterstützt. Wir danken Shelby Blythe und Eric Wieschaus für die freundliche Bereitstellung eGFP-PCNA Drosophila Melanogaster Linie.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die hier vorgestellten Protokoll ist sehr effektiv bei der Generierung von qualitativ hochwertige Karten der Chromatin-Architektur in den frühen Drosophila Embryos. Im Vergleich zu einer früheren Protokoll34, verwendet beschriebene Ansatz hier eine auf dem neuesten Stand in Situ Hi-C Verfahren5, was schnellere Verarbeitung, höheren Auflösung und weniger Reagenz Verwendung. Das gesamte Verfahren, einschließlich der in Situ -Hi-C-Protokoll wird voraussichtlich auf den unterschiedlichsten Bühnen und experimentellen Systemen neben Drosophilaarbeiten. Da das Protokoll geringem input Bedarf hat, könnte es auch auf isolierten Zellpopulationen verwendet werden. In Drosophilawenn einige Parameter mithilfe des Protokolls für Embryonen außerhalb des Bereichs hier beschrieben, insbesondere die Fixierung des Materials, müssen möglicherweise angepasst werden. Da ältere Embryonen eine hochgradig undurchlässige Kutikula entwickeln, können die Erhöhung der Konzentration von Formaldehyd und verlängert die Fixierung angebracht sein. Für die Sammlung von Embryonen in Phasen als nukleare Zyklus 14, Inkubationszeiten von Embryonen bei 25 ° C im Schritt 1.4 wie folgt angepasst werden müssen: nukleare Zyklus 12, 70 min; nukleare Zyklus 13, 90 min; 3 – 4 hpf, 03:30 Uhr.
Während 13 Spaltung Divisionen (Stufe 1-4) verdoppelt sich die Kerne Dichte etwa mit jeder Abteilung. Die Kerne können leicht durch ihre hellen GFP Fluoreszenz identifiziert werden. Während der Mitose eGFP-PCNA befindet sich nicht im Zellkern, und sein Signal über den Embryo verstreut ist. Diese Eigenschaft macht identifizierende Embryonen, die eine synchrone Spaltung Division möglich durchmachen. Für das Studium Chromatin Konformation, sind diese mitotischen Embryonen in der Regel nicht erwünscht, da die mitotische Organisation des Chromatins drastisch anders als die Interphase Organisation35. Es ist möglich, das Protokoll um speziell Embryonen durchläuft eine synchrone mitotische Teilung wählen anzupassen. In diesem Fall nur Embryonen mit verstreuten, nichtnukleare Verteilung von eGFP-PCNA aufbewahrt werden, und alle anderen Embryonen verworfen werden sollte. Da die atomare Dichte bestimmt werden kann, müssen alternative Methoden, um Embryonen durch ihre Morphologie in der übertragenen Lichtmikroskopie angesehen eingesetzt werden. Pol-Zellen und Kerne an die Peripherie der Embryo hindeuten, dass der Embryo mindestens nuklearen Kreislaufs 9, abgeschlossen wurde während sichtbare Cellularization an der Peripherie nuklearen Zyklus 1412anzeigt.
Hallo-C Experimente können erfolgreich mit einer großen Auswahl von Restriktionsenzymen5durchgeführt werden. Aktuelle Ansätze verwenden in der Regel Enzyme, die entweder eine 4-Base-Sequenz, wie MboI oder ein 6-Base Anerkennung-Website, z. B. HindIII zu erkennen. Der Vorteil von 4-Base Fräser über 6-Base Fräser ist, dass sie höhere mögliche Lösung angesichts genügend Sequenzierung Tiefe und eine gleichmäßigere Abdeckung von Restriktionsschnittstellen über das Genom. Es gibt keine klarer Vorteil bei der Wahl einer 4-Sockel-Fräser über weitere5,23,36,37. Die zwei am häufigsten verwendeten Enzyme, MboI und DpnII, erkennen beide die gleichen GATC-Anerkennung-Website. DpnII ist unempfindlicher gegen CpG Methylierung, kein Anliegen in Drosophila. Die hier vorgestellten Protokoll kann auch als ein Restriktionsenzym DpnII verwenden erfolgreich abgeschlossen werden. In Abschnitt 4.2. Restriktionsenzym und Puffer haben gemäß den Empfehlungen des Herstellers für DpnII Kompatibilität angepasst werden.
Weicht die Fragmentgröße der Sequenzierung Bibliothek deutlich aus dem Bereich in Abbildung 2Agezeigt, kann Clusterbildung während der Sequenzierung werden weniger effizient oder komplett ausfallen. In diesem Fall die Größenverteilung nach der Schur sollte überprüft werden und Scheren Parameter entsprechend angepasst. Gipfel in der Verteilung der DNA-Fragmente von sehr kleinen (< 100 bp) oder sehr groß (> 1.000 bp) Größen deutet auf Probleme mit Größenauswahl, z. B. tragen über Perlen oder überstand, die verworfen werden sollen. Diese Bibliotheken mit kleinen Peaks bei diesen unerwünschten Größen, z. B. eine abgebildet, sind noch sequenziert oft erfolgreich mit nur einem geringfügigen Rückgang clustering Effizienz.
Hohe Raten von PCR Doppelarbeit sollte vermieden werden, denn dies drastisch die Anzahl der nutzbaren Sequenz liest reduziert. Die Rate der PCR Duplikate steht in direktem Zusammenhang mit der Menge an input-Material. Mit mehr Input mindert daher in der Regel Probleme mit PCR Vervielfältigung.
Höhere Zahlen liest, gefiltert durch Lesen Sie Orientierung ()( )Abbildung 2 bunzureichende Verdauung, die das Ergebnis der Verwendung zu wenig Enzym, zuviel input-Material oder unvollständige Homogenisierung der Embryonen werden kann.

Chromatin Konformation erfassen (3C) hat eine außerordentlich nützliche Methode, um die Topologie des Chromatins in der Kern-1Studie entwickelt. Die Variante 3C Hi-C ermöglicht Messung der Kontakt Frequenzen aller Chromatin-Interaktionen, die im Zellkern in einem einzigen Experiment2auftreten. Anwendung von Hi-C spielte eine wichtige Rolle bei der Entdeckung und Charakterisierung von vielen grundlegenden Prinzipien des Chromatin Organisation, z. B. TADs, Fächern und Schlaufen3,4,5.
Studium der Chromatin-Architektur im Rahmen der entwicklungspolitischen Übergänge und Zelldifferenzierung werden zunehmend verwendet, um die Mechanismen der Genregulation bei diesen Prozessen6,7,8zu entwirren, 9. Eines der Modellorganismen von großem Interesse ist Drosophila Melanogaster, deren Entwicklung und Genom gut charakterisiert sind. Jedoch führte nur wenige Studien, die untersuchen, Chromatin Architektur in Drosophila außerhalb von in-vitro- Gewebekultur Einstellungen wurden10,11. In Embryonen waren 16 – 18 h Post Befruchtung, TADs und Fächer erinnert an ähnliche Strukturen bei Säugetieren identifiziert10, welche wirft die Frage, welche Rolle sie in der Genregulation bei Drosophila Embryos spielen Entwicklung. Vor allem in den frühen Stadien der Entwicklung, vor der Gastrulation sind solche Studien technisch anspruchsvoll. Vor der Gastrulation unterziehen Drosophila Embryos 13 synchrone nuklearen Unternehmensbereiche, die in einem rasanten Tempo von 8 bis 60 min pro Zyklus12,13fortfahren. Darüber hinaus das Fehlen von visuellen Funktionen, die verschiedenen Phasen zu unterscheiden erschweren, dicht inszenierten Embryo Material in ausreichender Menge zu erhalten.
Um ein Protokoll zu entwickeln, das Chromatin Architekturstudium in der frühen Entwicklung von Drosophila mit nuklearen Kreislaufs Auflösung ermöglicht, wir haben zwei bestehende Techniken kombiniert: in Situ Hi-C, wodurch die Generation mit hoher Auflösung ganze Genom Kontakt Karten5und Embryo-Inszenierung mit einer transgenen Drosophila -Linie mit dem Ausdruck eines eGFP-PCNA Transgen13,14. Das Transgen lokalisiert in den Zellkern während der Interphase und verteilt im gesamten syncytial Blastoderm während der Mitose. Mit dieser Eigenschaft ist es möglich, verschiedene Phasen durch ihre nuklearen Dichte und mitotischen Embryonen durch die Streuung der GFP-Signal leicht zu unterscheiden.
Diese Techniken ermöglichen die dreidimensionale Struktur des Chromatins in hoher Auflösung von nur 20 Drosophila Embryos zu studieren. Dieses Protokoll enthält die Anweisungen für die Ernte und Sortierung Drosophila Embryos Populationen von Embryonen aus einem einzelnen Atom Abteilung Zyklus zu erhalten. Es beschreibt die weitere Verwendung der gewonnenen Embryonen durchzuführen in Situ Hi-C. Das Endergebnis ist ein Nukleotid-Bibliothek für Sequenzierung auf Maschinen der nächsten Generation Sequenzierung geeignet. Der daraus resultierende Sequenzierung liest können dann zu detaillierten Chromatin Interaktion Karten für das gesamte Genom von Drosophila verarbeitet werden.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dATP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>19524016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MboI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0147L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase I Klenow Fragment</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0012</td>
			<td>T4 DNA Ligase Buffer included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina&#160;(Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335</td>
			<td>Sequencing Adaptor, Forward (unindexed) PCR primer and Reverse (indexed) PCR primer and USER enzyme used in the Library preparation section are components of this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645</td>
			<td>End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix and Polymerase Master Mix used in the Library preparation section are components of this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S2 AFA System</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon cell strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td>Embryo collection baskets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>437536C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>122062.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165 FC fluorescent stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165 FC DFC camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal micro pestle</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P985.1</td>
			<td>Used to lyse embryos in step 4.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3832,0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65002</td>
			<td>Streptavidin coated magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP-PCNA flies</td>
			<td>Gift from S. Blythe and E. Wieschaus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite 13%</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer pH 8.0 (1 M) for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Nucleotide Mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814362001</td>
			<td>Unmodified dCTP, dGTP, dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M solution for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate 3M pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Mixer RM-2L</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5729802</td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td>Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Embryo Collection Cages</td>
			<td>Flystuff.com</td>
			<td>59-100</td>
			<td>Egg collection cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube strips</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7202S</td>
			<td>T4 DNA Polymerase buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genome-wide chromatin conformation capture libraries from tightly staged early drosophila embryos

Die dreidimensionale Architektur des Chromatins zu untersuchen, bietet wertvolle Einblicke in die Mechanismen der Genregulation. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Durchführung der Chromatin Konformation Capture Technik in Situ Hi-C in Drosophila Melanogaster Embryo Populationen in Szene gesetzt. Das Ergebnis ist eine Sequenzierung-Bibliothek, die die Zuordnung aller Chromatin Interaktionen ermöglicht, die im Zellkern in einem einzigen Experiment auftreten. Embryo Sortierung erfolgt manuell mit einem fluoreszierenden Stereo-Mikroskop und eine transgene Fliegenschnur mit einem nuklearen Marker. Mit dieser Technik, Embryo Populationen aus jedem Zyklus nuclear Division und mit definierten Zellzyklus-Status erhalten Sie mit sehr hoher Reinheit. Das Protokoll kann auch an ältere Embryonen über Gastrulation sortieren angepasst werden. Sortierte Embryonen dienen als Eingänge für in Situ Hi-C. Alle Experimente, einschließlich Bibliothek Vorbereitung, Sequenzierung können in fünf Tagen abgeschlossen werden. Das Protokoll hat niedrige input-Anforderungen und arbeitet zuverlässig mit 20 Blastoderm Embryonen als input-Material. Das Endergebnis ist eine Sequenzierung-Bibliothek für die Sequenzierung der nächsten Generation. Nach der Sequenzierung, können die Daten zu genomweite Chromatin Interaktion Karten verarbeitet werden, die analysiert werden können, mit einem breiten Spektrum der verfügbaren Tools, Informationen über topologisch zuordnen Domänenstruktur (TAD), Chromatin Schleifen und Chromatin zu gewinnen Fächer bei Drosophila -Entwicklung.

Sortiert Embryo Populationen an nuklearen Kreislaufs, 12, 13 und 14 (entspricht 01:30, 01:45 und 02:10 Stunden post-Düngung, bzw.12) und 3 – 4 h Post Düngung (hpf) wurden entsprechend den im Protokoll beschriebenen Verfahren. Von eGFP-PCNA Signal jeder Charge sortierte Embryo zu fotografieren, ist es möglich, die präzise Bühne und Zellzyklus Status jeder einzelnen Embryo zu dokumentieren, die in den nachgelagerten Experimenten verwendet wird. Beispielbilder von Embryonen aus sortierten Populationen sind in Abbildung 1 b-Egezeigt. Die Ausgabe des Protokolls in Situ Hi-C ist ein Nukleotid-Bibliothek bereit, auf Maschinen der nächsten Generation Sequenzierung sequenziert werden. Zu diesem Zweck ist eine endgültige Bibliothek Konzentration von mindestens 2 – 4 nM in der Regel erforderlich. Verwenden die empfohlenen Mengen von input-Material, ist diese Konzentration zuverlässig erreicht (Tabelle 1).
Die erwarteten Größenverteilung von DNA-Fragmenten nach Größenauswahl zwischen 300-600 bp, mit einem Maximum bei ca. 500 bp (Abbildung 2A(), je nach der genauen Scheren und Größe Selektionsparameter ist. Für die Sequenzierung empfehlen wir gepaart Ende liest mindestens 75 bp-Länge, die Anzahl der unkartierbar Einschränkung Fragmente des Genoms zu minimieren. Hochauflösende Karten mit 1 – 2 kb bin Größe erhalten Sie bei 400 Millionen mal gelesen. Wir empfehlen, mehrere biologische Wiederholungen in einer geringeren Tiefe von 150 Millionen Sequenzierung jeden, anstatt eine einzelne Replikation in sehr großer Tiefe Sequenzierung liest. Dies ermöglicht die Beurteilung der biologischen Variation und führt zu einer geringeren Anzahl von ausrangierten Lesevorgänge durch PCR Vervielfältigung. Für die grafische Darstellung können die Wiederholungen kombiniert werden. Es wird empfohlen vor der Festlegung auf eine Probe bei großer Tiefe Sequenzierung, auszuführen, Proben mit flachen Sequenzierung (ein paar Millionen gelesen je Probe) Basisbibliothek Qualitätsparameter wie in Abbildung 2 bzu bestimmen.
Analyse von Hi-C Daten erfordert erhebliche computational Ressourcen und Bioinformatik-Expertise. Als eine grobe Übersicht der gekoppelten liest das Referenz-Genom unabhängig zugeordnet sind, die daraus resultierende Ausrichtungen sind für Qualität und Ausrichtung gefiltert, dann eine Matrix der Kontakte auf einer gegebenen Auflösung oder Fragment platzebene erzeugt werden kann aus der gefilterten Ausrichtungen. Die Kontakt-Matrix ist die Grundlage für alle weiteren nachgeschalteten Analyse TADs, Loops und Fächer zu erkunden. Für die erste Analyse der Sequenzierung lautet, gibt es mehrere Bioinformatik Rohrleitungen zu ermöglichen, die Verarbeitung von Roh liest in Kontakt Matrizen ohne viel spezialisierte Bioinformatik wissen18,19, 20,21,22,23. Wie weitere Analyse durchgeführt wird, hängt die genaue biologische Frage unter Studie und erfordern große Erfahrung in Programmierung und scripting in R oder Python. Verschiedene Tools und Algorithmen TADs nennen sind jedoch verfügbar5,24,25,26,27,28, sowie Software zur Analyse und erkunden Sie Hi-C-Daten im Web-Browser und als eigenständige Desktop-Anwendungen29,30,31,32.
Nach der Bearbeitung kann die Qualität der Bibliothek mit verschiedenen Metriken (Abb. 2 b) ermittelt werden. Erstens sollte die Rate der PCR Duplikate, die die Anzahl der sequenzierten lesen Sie Paare aus dem gleichen ursprünglichen Molekül ist, so niedrig wie möglich, die Menge des vergeudeten Sequenz lautet begrenzen. Aber auch Bibliotheken mit > 40 % PCR Vervielfältigung kann in qualitativ hochwertige Kontakt Karten verarbeitet werden, wenn die Duplikate gefiltert werden. Zweitens sollte die Rate des gefilterten lautet aufgrund ihrer Ausrichtung, wie beschrieben in4, konsequent weniger als 10 % des ausgerichteten lesen Sie Paare sein.
Während der Pre-gastrular Entwicklung von Drosophila zwischen nuklearen Kreislaufs 12 und 14 ist die nukleare Architektur drastisch umgebaut33 (Abbildung 3). Bei nuklearen Zyklus 12 Paar TADs werden erkannt und die Gesamtverteilung der Kontakte ist sehr glatt, ohne viele erkennbaren Eigenschaften. Dies ist dramatisch bei nuklearen Zyklus verändert, 13 und 14, wenn TADs zunehmend Prominente und unspezifischen weitreichende Kontakte sind erschöpft.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig1.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative Bilder von eGFP-PCNA Embryonen bei der Sortierung. (A) eGFP-PCNA Signal aus einer unsortierten Bevölkerung von Embryonen nach 60 min. Sammlung und 2 h Inkubation bei 25 ° C (B-E) Beispiele von Embryonen aus sortierten Populationen an nuklearen Zyklus 12 (B), nukleare 13 (C), 14 (nuklearen Kreislaufs Zyklus ( D), und von Embryonen in der synchronen Mitose (E). Skalieren von Balken = 200 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig2.jpg"> Abbildung 2: Beispiele für in Situ Hi-C Bibliothek Qualitätsmetriken. (A) Bioanalyzer Spuren zeigen die Verteilung der DNA-Fragment Größen aus einer erfolgreichen Hi-C-Bibliothek (Library 1, oben) und aus einer Bibliothek mit einem Spitzenwert von Fragmenten, die sind zu groß für die Sequenzierung (Bibliothek 2, unten). Bibliothek 2 wurde erfolgreich sequenziert, aber auch größere Mengen an unerwünschten DNA-Fragmente zu verringerten Sequenzierung Renditen führen können. (B) Filterung Statistiken von zwei Hi-C-Bibliotheken: angezeigt ist die Anzahl der ausgerichteten lesen Sie Paare, die von der weiteren Analyse durch Lesen Sie Ausrichtung und Abstand (nach innen, nach außen)4 oder PCR Vervielfältigung (doppelte) ausgeschlossen werden. In jeder Bar sind die Anzahl der Lese-, vorbei an den Filter (verbleibende) und Versagen (gefiltert) aufgetragen. Der Anteil der liest den Filter passieren wird zusätzlich als Text angezeigt. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig3.jpg"> Abbildung 3: Hi-C Interaktion Karten aus inszenierten Embryonen. Hallo-C Interaktion Karten sind Makulatur bei 10 kb Auflösung und ausgewogen wie vor33beschrieben. Dargestellt ist eine Region auf dem Chromosom 2 L. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig3large.jpg" target="_blank">Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bibliothek</td>
			<td>Bühne</td>
			<td>Anzahl der Embryonen</td>
			<td>Menge DNA vor Scheren (ng)</td>
			<td>PCR-Zyklen</td>
			<td>Endgültige Bibliothek Konzentration (nM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>nukleare Zyklus 12</td>
			<td>71</td>
			<td>46</td>
			<td>12</td>
			<td>28.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>nukleare Zyklus 12</td>
			<td>46</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>nukleare Zyklus 12</td>
			<td>60</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>nukleare Zyklus 13</td>
			<td>36</td>
			<td>39</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>nukleare Zyklus 13</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>nukleare Zyklus 13</td>
			<td>48</td>
			<td>18</td>
			<td>12</td>
			<td>8.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>nukleare Zyklus 14</td>
			<td>33</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>39,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>nukleare Zyklus 14</td>
			<td>24</td>
			<td>36</td>
			<td>12</td>
			<td>20.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>nukleare Zyklus 14</td>
			<td>14</td>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>17</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>24,0</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>18</td>
			<td>42</td>
			<td>11</td>
			<td>19.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>22</td>
			<td>63</td>
			<td>11</td>
			<td>48,4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Liste der repräsentativen Sequenzierung bibliotheksstatistik. Für jede Bibliothek in der Liste, die Anzahl der Embryonen, die für seine Generation, die Höhe der Gesamt-DNA vor Biotin Pulldown und Scheren, gemessen von Qubit, dienten Zyklen die Anzahl der PCR zur Verstärkung und die Endkonzentration der Sequenzierung Bibliothek verwendet nach Reinigung und Größenauswahl angegeben sind.

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Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll für die Erzeugung von hoher Auflösung in Situ Hi-C-Bibliotheken von dicht vor Gastrulation Drosophila Melanogaster inszeniert Embryonen.

Generation der genomweiten Chromatin Konformation Capture Bibliotheken aus dicht inszenierten Anfang Drosophila Embryos

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Chromatinarchitektur zu beantworten, z. B. wie die 3D-Struktur von Chromatin die Genexpression und -entwicklung beeinflussen kann. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie eine hochauflösende Ansicht der Chromatinarchitektur und präzise inszenierter Fliegenembryonen bietet. Obwohl diese Methode Einblicke in die Organisation und Entwicklung von Chromatin geben kann, kann man auch vorhandene Linien aus transgenen Fliegenbibliotheken verwenden, um ihre Wirkung in der Chromatin-Organisation zu testen.Um das Protokoll zu beginnen, passen Sie das Gesamtvolumen der zuvor gesammelten Embryonen auf zwei Milliliter mit PBST an. Fügen Sie sechs Milliliter Heptan und 100 Mikroliter 37%Formaldehyd in Wasser hinzu. Nach Zugabe von Formaldehyd, kräftig schütteln sie das Rohr nach oben und unten für eine Minute.Die wässrige und organische Phase wird sich zu einer shampooartigen Konsistenz verbinden. Rühren Sie die Mischung 10 Minuten lang auf einem Drehmischer. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 500 mal g für eine Minute bei Raumtemperatur, um Embryonen am Boden des Rohres zu sammeln.Saugen Sie die gesamte Shampoo-ähnliche Flüssigkeit und entsorgen Sie sie, wobei Sie darauf achten, keine Embryonen zu aspirieren. 15 Minuten nach Zugabe von Formaldehyd, setzen Sie die Embryonen in fünf Milliliter PBST mit 125 Millimolar Glycin. Schütteln Sie die Embryonen eine Minute lang kräftig auf und ab.Nach dem Zentrifugieren den Überstand ansaugen. Mit einer 1.000 Mikroliter Pipette eine Charge von 100 Embryonen auf ein kleines Glasgefäß übertragen, das zum Sortieren geeignet ist, vorzugsweise auf dunklem Hintergrund, und auf Eis legen. Sortieren Sie Embryonen nach Kerndichte und Zellzyklusstatus mit einer Nadel oder Spritzenspitze.Entfernen Sie alle mitotischen Embryonen, die durch ihre dispergierte, nicht-nukleare Verteilung von EGFP PCNA und Embryonen erkennbar sind, die teilweise ein nicht-nukleares GFP-Signal aufweisen. Um die Sortierung zu unterstützen, richten Sie Referenzembryonen in den Kernzyklen 12, 13 und 14 in jeder Charge auf, um Embryonen mit einem der Referenzembryonen abzugleichen. Pipette die gewünschten Embryonen mit einer 1.000 Mikroliter Pipette.In eine frische Röhre geben und auf Eis legen. Fahren Sie fort, bis genügend Embryonen für das geplante Experiment sortiert sind. Spin Rohre kurz bei 100 mal g bei Raumtemperatur.Entfernen Sie den Überstand und stellen Sie sicher, dass die Embryonen so trocken wie möglich zum Einfrieren sind. Flash gefrieren Embryonen durch Untertauchen der Rohre in flüssigen Stickstoff und speichern bei minus 80 Grad Celsius. Die Rohre mit gefrorenen Embryonen auf Eis legen.Setzen Sie die Embryonen in 500 Mikrolitere eiskalteLysepuffer aus. Warten Sie eine Minute, damit sich der Embryo am Boden des Rohres absetzen kann. Als nächstes mahlen Sie die Embryonen mit einem Metall-Mikro-Pestle vorgekühlt auf Eis, die entworfen ist, um fest passen eine 1,5 Milliliter Mikrozentrifuge Rohr.Um zu vermeiden, dass die Embryonen aufgewittelt werden, legen Sie den Stößel langsam ein, bis er den Boden des Rohres berührt. Drücken Sie nach unten und schleifen Sie dann, indem Sie den Stößel zweimal in beide Richtungen drehen. Heben Sie den Stößel sehr leicht an.Drücken Sie erneut auf den Boden des Rohres und wiederholen Sie den Schleifvorgang 10 Mal oder bis die Embryonen vollständig lysiert sind. Die Lösung sollte homogen sein und keine verbleibenden großen Embryonen bleiben. Die homogenisierte Suspension 15 Minuten auf Eis inkubieren.Drehen Sie bei 1 000 mal g vier Grad Celsius für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet, indem Sie in 500 Mikroliter eiskalten Lysepuffer und Pipetten nach oben und unten. Nach einer weiteren Drehung, entsorgen Sie den Überstand.Setzen Sie das gewaschene Pellet in 100 Mikroliter n.Ä. 0,5% Natriumdodecylsulfat oder SDS aus. Dann durchlässigen Sie die Kerne, indem Sie die Probe für 10 Minuten bei 65 Grad Celsius in einem Heizblock inkubieren. Fügen Sie 50 Mikroliter 10%Triton X100 und 120 Mikroliter Wasser hinzu.Streichen Sie das Rohr, um den Inhalt zu mischen und die Röhre bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten in einem Wärmeblock zu bebrüten. Fügen Sie 25 Mikroliter 10X Restriktionsenzympuffer und 20 Einheiten mit fünf Einheiten pro Mikroliter MBO1 hinzu. Streichen Sie die Röhre, um den Inhalt zu mischen und die Röhre in einem Wärmeblock zu inkubieren, um die DNA zu verdauen.Fügen Sie weitere 20 Einheiten Von MBO1 hinzu. Setzen Sie die Inkubation für 90 Minuten fort. Nach der zweiten 90-minütigen Inkubation die Probe bei 62 Grad Celsius für 20 Minuten inkubieren, um das MBO1 inaktiv zu machen.Als nächstes fügen Sie 18 Mikroliter 0,4 Millimolar Biotin 14-dATP, 2,25 Mikroliter eines unveränderten 3,3 Millimolar dCTP-dGTP-dTTP-Mix und acht Mikroliter mit fünf Einheiten pro Mikroliter DNA-Polymerase I Klenow-Fragment hinzu. Streichen Sie das Rohr, um den Inhalt zu mischen und die Probe bei 37 Grad Celsius für 90 Minuten zu bebrüten. Als nächstes fügen Sie 657 Mikroliter Wasser, 120 Mikroliter 10X T4 DNA Ligase Puffer, 100 Mikroliter 10%Triton X100, sechs Mikroliter von 20 Milligramm pro Milliliter RinderserumAlbumin und schließlich fünf Mikroliter mit fünf Einheiten pro Mikroliter T4 DNA Ligase hinzu.Als nächstes drehen Sie das Rohr vorsichtig bei 20 U/min bei Raumtemperatur für zwei Stunden. Fügen Sie weitere fünf Mikroliter mit fünf Einheiten pro Mikroliter T4 DNA Ligase hinzu. Drehen Sie noch zwei Stunden weiter, dann drehen Sie die Kerne fünf Minuten lang bei 2 500 mal g herunter.Nach der Zentrifugation den Überstand entsorgen. Setzen Sie das Pellet in 500 Mikroliter Extraktionspuffer aus und fügen Sie 20 Mikroliter von 20 Milligramm pro Milliliter Proteinase K.Flick die Röhre hinzu und inkubieren Sie die Röhre, um das Protein zu verdauen. 130 Mikroliter von fünf Mol-Natriumchlorid hinzufügen und über Nacht zur Entvernetzung inkubieren.Am nächsten Tag pipette die Probe in eine neue Zwei-Milliliter-Röhre mit niedrigen DNA-Bindungseigenschaften. Fügen Sie 0,1X Volumen von drei Molaren-Natriumacetat und zwei Mikroliter von 15 Milligramm pro Milliliter GlycoBlue. 1,6 Volumen reines absolutes Ethanol hinzufügen und den Inhalt invertieren, dann die Probe bei minus 80 Grad Celsius für 15 Minuten inkubieren.Zentrifugieren Sie nach der Inkubation den Inhalt. Suchen Sie das DNA-Pellet, das nur vom GlycoBlue entdeckt werden kann. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und bewegen Sie die Pipettenspitze entlang der gegenüberliegenden Wand aus dem DNA-Pellet in das Rohr.Waschen Sie das Pellet mit 800 Mikrolitern 70%Ethanol. Mischen Sie die Probe, indem Sie sie bei 20.000 mal g bei Raumtemperatur für fünf Minuten invertieren und zentrifugieren. Entfernen Sie die verbleibenden Tröpfchen während dieses Schritts und die folgenden Wäschen, indem Sie sie mit einer P10-Spitze aus den Rohren schieben, und öffnen Sie dann den Deckel, um bis zu fünf Minuten zu trocknen.Sobald keine Flüssigkeit mehr ist, 50 Mikroliter 10 Millimolar Trischlorid hinzufügen. Immer wieder Pipette die Lösung über den Bereich, wo das Pellet befindet sich, um die DNA zu löslich. Fügen Sie einen Mikroliter von 20 Milligramm pro Milliliter RNase A.Mix durch Streichen der Röhre.Inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius für 15 Minuten, um RNA zu verdauen. Schließlich die Probe im Gefrierschrank oder Kühlschrank bis zur Bibliotheksvorbereitung aufbewahren. Bilder des EGFP PCNA-Signals jeder sortierten Embryocharge zeigen präzise Stadium- und Zellzyklusstatus jedes einzelnen Embryos für nachgelagerte Experimente.Bioanalyzer-Spuren zeigen, dass die Größenverteilung von DNA-Fragmenten nach Größenauswahl zwischen 300 und 700 Basenpaaren mit einem Maximum von etwa 450 Basenpaaren liegt. Hi-C-Interaktionskarten zeigen, dass im Kernzyklus 12 nur wenige topologisch assoziierte Domänen oder TADs erkannt werden, die sich bei den Kernzyklen 13 und 14 dramatisch ändern, wenn TADs immer prominenter werden und unspezifische Langstreckenkontakte erschöpft sind. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Perlen gründlich zu waschen und die Inkubationszeiten nicht unnötig zu verlängern, insbesondere bei hohen Temperaturen, da dies zu qualitativ minderwertigen Hi-C-Bibliotheken führen kann.Diese Technik, die präzise Inszenierung und hochauflösende Chromatin-Bestätigungskartierung kombiniert, ebnete forschern auf dem Gebiet der Epigenetik den Weg, um die Rolle der dreidimensionalen Chromatin-Organisation in einer In-vivo-Entwicklungsumgebung zu erforschen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genomweite Bestimmung der Mammalian Replication-Timing von Inhaltsmessung DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Forschung

Genetik

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Mapping genomweite zugänglich Chromatin in primären menschlichen T-Lymphozyten durch ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotor Capture Hallo-c: Hochauflösende, genomweite Profilierung der Promoter Interaktionen

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genomweite Überwachung der Übertragungsfehler in Eukaryonten

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identifizierung von Enhancer-Promoter-Kontakten in embryoiden Körpern durch quantitative Chromosomenkonformationserfassung (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Genomweite Analyse der Histonmodifikationsverteilung mit der Chromatin-Immunpräzipitationssequenzierungsmethode in Magnaporthe Oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Chromosome Conformation Capture (3C) for Undergraduate Research and Teaching

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates (Video) | JoVE 

Eine Eins mit den 3Cs bekommen: Erfassung der Chromosomenkonformation für Studenten

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...