Name: generation of genome-wide chromatin conformation capture libraries from tightly staged early drosophila embryos
Uploaded: 2018-10-03T13:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos at JoVE.com

इस शोध को मैक्स प्लैंक सोसाइटी ने वित्त पोषित किया । C.B.H. इंटरनेशनल मैक्स प्लैंक रिसर्च स्कूल से एक फैलोशिप द्वारा समर्थित था-आणविक चिकित्सा । हम Shelby Blythe और एरिक Wieschaus धंयवाद के लिए कृपया eGFP-PCNA Drosophila melanogaster लाइन प्रदान करते हैं ।

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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल जल्दी Drosophila भ्रूण में क्रोमेटिन वास्तुकला के उच्च गुणवत्ता वाले नक्शे पैदा करने में बहुत प्रभावी है । एक पूर्व प्रोटोकॉल३४की तुलना में, यहां वर्णित दृष्टिकोण एक अप-टू-डेट का उपयोग करता है सीटू हाय-C प्रक्रिया5, जल्दी प्रसंस्करण में जिसके परिणामस्वरूप, उच्च संकल्प, और कम एजेंट का उपयोग. सीटू हाई-सी प्रोटोकॉल में शामिल समग्र प्रक्रिया Drosophilaके अलावा चरणों और प्रयोगात्मक प्रणालियों की एक विस्तृत श्रृंखला पर काम करने की उम्मीद है. चूंकि प्रोटोकॉल एक कम इनपुट की आवश्यकता है, यह भी अलग कोशिका आबादी पर इस्तेमाल किया जा सकता है । Drosophilaमें, जब सीमा के बाहर भ्रूण के लिए प्रोटोकॉल का उपयोग यहां वर्णित है, कुछ मानकों, विशेष रूप से सामग्री के निर्धारण में समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । के बाद से बड़े भ्रूण एक उच्च अभेद्य छल्ली का विकास, formaldehyde और लंबे समय तक निर्धारण की एकाग्रता की स्थापना उचित हो सकता है । परमाणु चक्र के अलावा अंय चरणों में भ्रूण के संग्रह के लिए 14, १.४ कदम में 25 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण की मशीन समय इस प्रकार के रूप में समायोजित करने की आवश्यकता: परमाणु चक्र 12, ७० मिनट; नाभिकीय चक्र 13, ९० min; ३ – ४ hpf, 3:30 एच.
13 क्लीवेज डिवीजनों (स्टेज 1-4) के दौरान, नाभिक घनत्व मोटे तौर पर प्रत्येक प्रभाग के साथ डबल्स । नाभिक को आसानी से उनकी ब्राइट GFP प्रतिदीप्ति से पहचाना जा सकता है । बँटवारा के दौरान, eGFP-PCNA नाभिक में स्थित नहीं है, और इसके संकेत भ्रूण भर में फैलाया जाता है. इस सुविधा का भ्रूण है कि एक तुल्यकालिक दरार संभव विभाजन के दौर से गुजर रहे है की पहचान करता है । क्रोमेटिन अनुरूप अध्ययन के लिए, इन mitotic भ्रूण आम तौर पर वांछनीय नहीं हैं, क्रोमेटिन के mitotic संगठन के बाद से भारी है चरण संगठन३५से अलग है । यह विशेष रूप से एक तुल्यकालिक mitotic विभाजन के दौर से गुजर भ्रूण का चयन करने के लिए प्रोटोकॉल अनुकूलन संभव है । इस मामले में, केवल फैलाया हुआ, eGFP-PCNA के गैर-परमाणु वितरण के साथ भ्रूण रखा जाना चाहिए, और अन्य सभी भ्रूण को छोड़ दिया जाना चाहिए । परमाणु घनत्व निर्धारित नहीं किया जा सकता है के बाद से, उनके संचारित प्रकाश माइक्रोस्कोपी में देखा आकृति विज्ञान द्वारा मंच भ्रूण के लिए वैकल्पिक तरीकों कार्यरत होना चाहिए. ध्रुव कोशिकाओं और भ्रूण परिधि में नाभिक की उपस्थिति से संकेत मिलता है कि भ्रूण कम परमाणु चक्र 9 पूरा कर लिया है, जबकि दिखाई cellularization परिधि में परमाणु चक्र 1412इंगित करता है ।
उच्च सी प्रयोगों सफलतापूर्वक प्रतिबंध एंजाइमों की एक विस्तृत चयन5का उपयोग कर किया जा सकता है । वर्तमान approaches आमतौर पर कोई 4-आधार अनुक्रम, जैसे MboI, या कोई 6-आधार पहचान साइट, जैसे कि HindIII पहचान एंजाइमों का उपयोग करें । 6-आधार कटर पर 4-आधार कटर का लाभ यह है कि वे उच्च क्षमता के संकल्प की पेशकश, पर्याप्त अनुक्रमण गहराई दी, और एक अधिक भी कवरेज के जीनोम भर में प्रतिबंध साइटों की । एक और5,23,३६,३७पर एक 4-बेस कटर चुनने में कोई स्पष्ट लाभ नहीं है । दो सबसे अधिक इस्तेमाल किया एंजाइमों, MboI और DpnII, दोनों एक ही GATC मांयता साइट पहचान । DpnII CpG मिथाइल के प्रति कम संवेदनशील है, जो Drosophilaमें कोई चिंता का विषय नहीं है । यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल को भी सफलतापूर्वक एक प्रतिबंध एंजाइम के रूप में DpnII का उपयोग कर पूरा किया जा सकता है । धारा ४.२ में । प्रतिबंध एंजाइम और बफर DpnII संगतता के लिए समायोजित किया जा करने के लिए है, निर्माता की सिफारिशों के अनुसार.
यदि sequencing लायब्रेरी का अंश आकार काफी संख्या में चित्र 2aदिखाया गया से विचलित, अनुक्रमण के दौरान क्लस्टर गठन कम कुशल या पूरी तरह से विफल हो सकता है । इस मामले में, बाल काटना के बाद आकार वितरण की जांच की जानी चाहिए और कतरनी मानकों तदनुसार समायोजित । बहुत छोटा (< 100 bp) या बहुत बड़ा (> 1, 000 bp) के डीएनए अंशों के वितरण में चोटियों आकार चयन के साथ समस्याओं को इंगित करता है, जैसे मोतियों या supernatant के ऊपर ले जाने के लिए छोड़ दिया जाना चाहिए रहे हैं । अक्सर इन पुस्तकालयों पर छोटे चोटियों के साथ इन अवांछनीय आकार, इस तरह के एक चित्र के रूप में, अभी भी clustering दक्षता में केवल एक छोटी सी कमी के साथ सफलतापूर्वक अनुक्रम ।
पीसीआर दोहराव की उच्च दरों से बचना चाहिए क्योंकि यह काफी प्रयोग करने योग्य अनुक्रम की संख्या को कम कर देता है पढ़ता है । पीसीआर डुप्लीकेट की दर सीधे इनपुट मटेरियल की मात्रा से संबंधित है । अधिक इनपुट का उपयोग इसलिए आमतौर पर पीसीआर दोहराव के साथ समस्याओं को दूर ।
पढ़ने के उंमुखीकरण के कारण फ़िल्टर की उच्च संख्या (चित्रा बी) अपर्याप्त पाचन, जो बहुत कम एंजाइम, बहुत अधिक इनपुट सामग्री, या भ्रूण के अधूरे homogenization का उपयोग करने का परिणाम हो सकता है संकेत मिलता है ।

क्रोमेटिन क्षेऽ कैप्चर (3 सी) नाभिक1में क्रोमेटिन की टोपोलॉजी का अध्ययन करने के लिए एक असाधारण उपयोगी विधि के रूप में उभरा है । 3 सी संस्करण उच्च सी एक प्रयोग2में नाभिक में होने वाले सभी क्रोमेटिन बातचीत के संपर्क आवृत्तियों को मापने की अनुमति देता है. Hi-C के अनुप्रयोग ने क्रोमेटिन संगठन के कई मूलभूत सिद्धांतों, जैसे TADs, डिब्बों और छोरों3,4,5की खोज और लक्षण वर्णन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है ।
विकास संक्रमण और कोशिका विभेद के संदर्भ में क्रोमेटिन वास्तुकला का अध्ययन तेजी से इन प्रक्रियाओं के दौरान जीन विनियमन के तंत्र को जानने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं6,7,8, 9. महान ब्याज के मॉडल जीवों में से एक Drosophila melanogaster, जिसका विकास और जीनोम अच्छी तरह से विशेषता है । हालांकि, कुछ अध्ययनों कि Drosophila में क्रोमेटिन वास्तुकला की जांच के बाहर इन विट्रो ऊतक संस्कृति सेटिंग्स10,11आयोजित किया गया है । भ्रूण में 16 – 18 ज पद निषेचन, TADs और स्तनधारियों में इसी तरह की संरचनाओं की याद ताजा डिब्बों10, जो की भूमिका वे Drosophila भ्रूण के दौरान जीन विनियमन में खेल रहे है जो सवाल उठाती की पहचान की गई विकास. विशेष रूप से विकास के प्रारंभिक दौर में, gastrulation से पहले, ऐसे अध्ययन तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण हैं । gastrulation से पहले, Drosophila भ्रूण 13 तुल्यकालिक परमाणु प्रभाग है कि 8 के एक अत्यंत तीव्र गति से आगे बढ़ना-12चक्र,13प्रति 60 मिनट से गुजरना । इस के अलावा, दृश्य सुविधाओं की कमी के विभिन्न चरणों भेद करने के लिए यह मुश्किल पर्याप्त मात्रा में कसकर मंचन भ्रूण सामग्री प्राप्त करने के लिए बनाते हैं ।
आदेश में एक प्रोटोकॉल है कि परमाणु चक्र के प्रस्ताव पर जल्दी Drosophila विकास में क्रोमेटिन वास्तुकला का अध्ययन करने की अनुमति देता है विकसित करने के लिए, हम दो मौजूदा तकनीक संयुक्त: सीटू में हाय-सी है, जो उच्च संकल्प की पीढ़ी की अनुमति देता है पूरे जीनोम संपर्क5नक्शे, और भ्रूण मचान एक ट्रांसजेनिक Drosophila लाइन का उपयोग कर एक eGFP-PCNA transgene13,14व्यक्त । यह transgene स्थानीयकरण के दौरान नाभिक को और syncytial blastoderm में बँटवारा के दौरान भर में फैलाता है । इस गुण का प्रयोग, यह संभव है आसानी से अपने परमाणु घनत्व और GFP संकेत के फैलाव से mitotic भ्रूण द्वारा विभिंन चरणों भेद ।
साथ में, इन तकनीकों के रूप में कुछ के रूप में 20 Drosophila भ्रूण से उच्च संकल्प में क्रोमेटिन के तीन आयामी संरचना का अध्ययन कर सकें । इस प्रोटोकॉल कटाई और छंटाई Drosophila भ्रूण के लिए निर्देश भी शामिल है एक परमाणु विभाजन चक्र से भ्रूण की आबादी प्राप्त करते हैं । इसका आगे वर्णन है कि प्राप्त भ्रूण को सीटू हाय-सी में परफॉर्म करने के लिए कैसे इस्तेमाल किया जाता है । अंतिम परिणाम एक न्यूक्लियोटाइड अगली पीढ़ी अनुक्रमण मशीनों पर अनुक्रमण के लिए उपयुक्त पुस्तकालय है । परिणामी अनुक्रमण पढ़ता है तो विस्तृत क्रोमेटिन सहभागिता मैप्स पूरे Drosophila जीनोम को कवर में संसाधित किया जा सकता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dATP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>19524016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MboI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0147L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase I Klenow Fragment</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0012</td>
			<td>T4 DNA Ligase Buffer included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina&#160;(Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335</td>
			<td>Sequencing Adaptor, Forward (unindexed) PCR primer and Reverse (indexed) PCR primer and USER enzyme used in the Library preparation section are components of this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645</td>
			<td>End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix and Polymerase Master Mix used in the Library preparation section are components of this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S2 AFA System</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon cell strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td>Embryo collection baskets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>437536C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>122062.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165 FC fluorescent stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165 FC DFC camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal micro pestle</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P985.1</td>
			<td>Used to lyse embryos in step 4.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3832,0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65002</td>
			<td>Streptavidin coated magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP-PCNA flies</td>
			<td>Gift from S. Blythe and E. Wieschaus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite 13%</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer pH 8.0 (1 M) for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Nucleotide Mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814362001</td>
			<td>Unmodified dCTP, dGTP, dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M solution for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate 3M pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Mixer RM-2L</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5729802</td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td>Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Embryo Collection Cages</td>
			<td>Flystuff.com</td>
			<td>59-100</td>
			<td>Egg collection cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube strips</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7202S</td>
			<td>T4 DNA Polymerase buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genome-wide chromatin conformation capture libraries from tightly staged early drosophila embryos

क्रोमेटिन के तीन आयामी वास्तुकला की जांच जीन विनियमन के तंत्र में अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करता है । यहां, हम सीटू हाय में क्रोमेटिन अनुरूप कब्जा तकनीक प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन Drosophila melanogaster भ्रूण आबादी मंचन पर सी । परिणाम में एक एकल प्रयोग में नाभिक में होने वाली सभी क्रोमेटिन बातचीत की मैपिंग की अनुमति देता है कि एक sequencing पुस्तकालय है. भ्रूण छंटाई मैंयुअल रूप से एक फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप और एक ट्रांसजेनिक मक्खी एक परमाणु मार्कर युक्त लाइन का उपयोग किया जाता है । इस तकनीक का प्रयोग, प्रत्येक परमाणु विभाजन चक्र से भ्रूण आबादी, और परिभाषित कोशिका चक्र की स्थिति के साथ, बहुत उच्च शुद्धता के साथ प्राप्त किया जा सकता है । प्रोटोकॉल भी gastrulation से परे पुराने भ्रूण तरह अनुकूलित किया जा सकता है । हल भ्रूण सीटू हाय-सी में के लिए आदानों के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. sequencing लाइब्रेरी तैयारी सहित सभी प्रयोगों, पांच दिनों में पूरा किया जा सकता है । प्रोटोकॉल कम इनपुट आवश्यकताओं है और मज़बूती से इनपुट सामग्री के रूप में 20 blastoderm स्टेज भ्रूण का उपयोग कर काम करता है । अंतिम परिणाम अगली पीढ़ी sequencing के लिए एक अनुक्रमण पुस्तकालय है । अनुक्रमण के बाद, डेटा जीनोम में संसाधित किया जा सकता चौड़ा क्रोमेटिन संपर्क नक्शे कि उपलब्ध उपकरणों की एक विस्तृत श्रृंखला का उपयोग कर topologically डोमेन (बालक) संरचना, क्रोमेटिन छोरों, और क्रोमेटिन संबद्ध के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए विश्लेषण किया जा सकता Drosophila विकास के दौरान कंपार्टमेंट आई ।

हल परमाणु चक्र 12, 13, और 14 में भ्रूण आबादी (इसी 1:30, 1:45, और 2:10 घंटे के बाद निषेचन, क्रमशः12) और 3-4 एच पोस्ट निषेचन (hpf) प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं के अनुसार प्राप्त किए गए । प्रत्येक हल भ्रूण बैच के eGFP-PCNA संकेत की तस्वीरें लेने के द्वारा, यह बहाव प्रयोगों में इस्तेमाल किया जाता है कि हर एक भ्रूण के सटीक चरण और कोशिका चक्र स्थिति दस्तावेज़ के लिए संभव है. क्रमबद्ध आबादी से भ्रूण के उदाहरण चित्रों चित्र 1b-Eमें दिखाए जाते हैं । सीटू हाई-सी प्रोटोकॉल में का आउटपुट एक न्यूक्लियोटाइड पुस्तकालय अगली पीढ़ी sequencing मशीनों पर अनुक्रम किया जा करने के लिए तैयार है । इस प्रयोजन के लिए, एक अंतिम पुस्तकालय एकाग्रता में कम से 2-4 एनएम आमतौर पर आवश्यक है । इनपुट सामग्री की सिफारिश की मात्रा का उपयोग करना, इस एकाग्रता मज़बूती से हासिल की है (तालिका 1).
आकार चयन के बाद डीएनए टुकड़े की उंमीद आकार वितरण 300 के बीच है-600 बीपी, लगभग ५०० बीपी (चित्रा 2a)पर एक अधिकतम के साथ, सटीक बाल काटना और आकार चयन मापदंडों पर निर्भर करता है । sequencing के लिए, हम अनुशंसा करते हैं मीन्स-end के जीनोम में अनमैपर प्रतिबंध अंशों की संख्या को कम करने के लिए कम से ७५ bp लंबाई की पढ़ता है । 1 – 2 kb बिन आकार के साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन मानचित्र ४००,०००,००० पढ़ता से प्राप्त किया जा सकता है । हम अनुशंसा करते हैं sequencing एकाधिक जैविक प्रतिकृति के एक कम गहराई पर ~ १५०,०००,००० पढ़ता प्रत्येक, के बजाय एक एकल प्रतिकृति बहुत उच्च गहराई पर अनुक्रमण । यह जैविक भिन्नता के आकलन की अनुमति देता है और पीसीआर दोहराव के कारण खारिज कर दिया की एक कम संख्या की ओर जाता है. दृश्य प्रतिनिधित्व के लिए, प्रतिकृति संयोजित किया जा सकता है । उच्च गहराई पर एक नमूना sequencing करने से पहले, हम के रूप में चित्रा बीमें बुनियादी पुस्तकालय गुणवत्ता मानकों का निर्धारण करने के लिए उथले अनुक्रमण (नमूना प्रति कुछ लाख पढ़ता है) का उपयोग कर नमूने चल सिफारिश.
Hi-C डेटा के विश्लेषण में महत्वपूर्ण गणनात्मक संसाधनों और bioinformatics विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है । किसी न किसी सिंहावलोकन के रूप में, युग्मित पढ़ता संदर्भ जीनोम के लिए स्वतंत्र रूप से मैप कर रहे हैं, जिसके परिणामस्वरूप संरेखण गुणवत्ता और अभिविन्यास के लिए फ़िल्टर कर रहे हैं, तो एक दिया बिन संकल्प या टुकड़ा स्तर पर संपर्कों की एक मैट्रिक्स से उत्पन्न किया जा सकता है फ़िल्टर प्रियपात्र. संपर्क मैट्रिक्स सभी आगे बहाव TADs, छोरों, और डिब्बों की खोज विश्लेषण के लिए आधार है । के प्रारंभिक विश्लेषण के लिए sequencing पढ़ता, कई bioinformatics पाइपलाइन उपलब्ध है जो raw पढ़ता के संसाधन से संपर्क मैट्रिक्स में बहुत विशिष्ट bioinformatics ज्ञान के बिना सक्षम करें18,19, 20,21,22,23. कैसे आगे विश्लेषण किया जाता है मोटे तौर पर अध्ययन के तहत सटीक जैविक प्रश्न पर निर्भर करता है और प्रोग्रामिंग में महत्वपूर्ण अनुभव और आर या पायथन में पटकथा की आवश्यकता हो सकती है । हालांकि, कई उपकरण और एल्गोरिदम TADs कॉल करने के लिए उपलब्ध हैं5,24,25,26,27,28, साथ ही सॉफ्टवेयर का विश्लेषण करने के लिए और वेब ब्राउज़र में और स्टैंड-अलोन डेस्कटॉप अनुप्रयोगों के रूप में उच्च-C डेटा का अन्वेषण करें29,30,31,३२.
एक बार संसाधित, पुस्तकालय की गुणवत्ता के विभिंन मैट्रिक्स (चित्रा बी) का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है । सबसे पहले, पीसीआर डुप्लिकेट की दर है, जो एक ही मूल अणु से उत्पंन अनुक्रम पढ़ें जोड़े की संख्या है, के रूप में संभव के रूप में व्यर्थ अनुक्रम की मात्रा की सीमा के रूप में कम होना चाहिए पढ़ता है । डुप्लिकेट फ़िल्टर कर रहे हैं, तो हालांकि, > 40% पीसीआर दोहराव के साथ भी पुस्तकालयों उच्च गुणवत्ता वाले संपर्क नक्शे में संसाधित किया जा सकता है । दूसरा, फ़िल्टर की दर उनके अभिविंयास के कारण पढ़ता है, के रूप में4में वर्णित है, लगातार संरेखित पढ़ें जोड़े के 10% से कम होना चाहिए ।
परमाणु चक्र के बीच Drosophila के पूर्व gastrular विकास के दौरान 12 और 14, परमाणु वास्तुकला काफी३३ remodeled है (चित्रा 3) । परमाणु चक्र में 12, कुछ TADs का पता चला रहे हैं, और संपर्कों के समग्र वितरण कई समझदार सुविधाओं के बिना बहुत चिकनी है । यह नाटकीय रूप से परमाणु चक्र 13 और 14 में बदल गया है, जब TADs तेजी से प्रमुख है और विशिष्ट लंबी दूरी के संपर्क समाप्त हो रहे हैं ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig1.jpg"> चित्रा 1: eGFP के प्रतिनिधि तस्वीरें-PCNA छंटाई के दौरान भ्रूण । (क) eGFP-PCNA के बाद भ्रूण का एक अनसुलझा जनसंख्या से संकेत ६० मिनट और 25 डिग्री सेल्सियस (बी ई) में 2 ज की मशीन के बाद एक हल आबादी से परमाणु चक्र 12 में भ्रूण के उदाहरण (ख), परमाणु चक्र 13 (ग), परमाणु चक्र 14 ( घ), और से तुल्यकालिक बँटवारा (ई) के दौर से गुजर भ्रूण । स्केल बार्स = २०० µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें</a> ।
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig2.jpg"> चित्रा 2: सीटू हाय-सी पुस्तकालय गुणवत्ता मैट्रिक्स में के उदाहरण । (एक) एक सफल हाय-सी पुस्तकालय (पुस्तकालय 1, शीर्ष) और एक पुस्तकालय है कि टुकड़ों के एक चोटी है कि अनुक्रमण के लिए बहुत बड़े है दिखाता है से (लाइब्रेरी 2, नीचे) से डीएनए टुकड़ा आकार के वितरण दिखा 2 लाइब्रेरी सफलतापूर्वक अनुक्रम किया गया था, लेकिन अवांछित डीएनए अंशों की भी बड़ी मात्रा में कम sequencing पैदावार के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । (ख) दो हाय-सी पुस्तकालयों के आँकड़े को छानने: प्रदर्शित संरेखित पढ़ें जोड़े की संख्या है कि आगे के विश्लेषण से बाहर रखा गया है अभिविंयास और दूरी पढ़ें (आवक, जावक)4 या पीसीआर दोहराव (डुप्लिकेट) के कारण । प्रत्येक बार में, फ़िल्टर (शेष) और विफल (फ़िल्टर किए गए) को पास कर रहा है पढ़ता की संख्या प्लॉट की गई हैं । फ़िल्टर गुजर पढ़ता का प्रतिशत इसके अतिरिक्त पाठ के रूप में दिखाया गया है । <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig3.jpg"> चित्रा 3: हाय-सी मंचन भ्रूण से बातचीत के नक्शे । Hi-C इंटरैक्शन मैप्स 10 kb रिज़ॉल्यूशन पर और३३से पहले बताए अनुसार संतुलित किया जाता है । दिखाया गुणसूत्र 2L पर एक क्षेत्र है । <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig3large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए</a> ।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>लायब्रेरी</td>
			<td>चरण</td>
			<td>भ्रूण की संख्या</td>
			<td>कतरन से पहले राशि डीएनए (एनजी)</td>
			<td>पीसीआर साइकिल</td>
			<td>अंतिम पुस्तकालय एकाग्रता (एनएम)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>परमाणु चक्र 12</td>
			<td>७१</td>
			<td>४६</td>
			<td>12</td>
			<td>२८.२</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>परमाणु चक्र 12</td>
			<td>४६</td>
			<td>४०</td>
			<td>12</td>
			<td>२२.२</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>परमाणु चक्र 12</td>
			<td>६०</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>१२.३</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>परमाणु चक्र 13</td>
			<td>३६</td>
			<td>३९</td>
			<td>12</td>
			<td>२२.२</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>परमाणु चक्र 13</td>
			<td>३५</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>५.०</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>परमाणु चक्र 13</td>
			<td>४८</td>
			<td>18</td>
			<td>12</td>
			<td>८.७</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>परमाणु चक्र 14</td>
			<td>३३</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>३९.८</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>परमाणु चक्र 14</td>
			<td>24</td>
			<td>३६</td>
			<td>12</td>
			<td>२०.४</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>परमाणु चक्र 14</td>
			<td>14</td>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>४.२</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>17</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>२४.०</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>18</td>
			<td>४२</td>
			<td>11</td>
			<td>१९.१</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>22</td>
			<td>६३</td>
			<td>11</td>
			<td>४८.४</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: प्रतिनिधि sequencing लाइब्रेरी आँकड़ों की सूची । सूची में प्रत्येक पुस्तकालय के लिए, भ्रूण है कि अपनी पीढ़ी के लिए इस्तेमाल किया गया की संख्या, बायोटिन pulldown और Qubit द्वारा मापा बाल काटना से पहले कुल डीएनए की राशि, प्रवर्धन के लिए इस्तेमाल किया पीसीआर चक्र की संख्या, और अनुक्रमण पुस्तकालय के अंतिम एकाग्रता शुद्धि और आकार चयन के बाद संकेत दिया जाता है ।

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Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

इस कार्य में उच्च संकल्प की पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है सीटू हाय-सी पुस्तकालयों से कसकर मंचन पूर्व gastrulation Drosophila melanogaster भ्रूण.

जीनोम की पीढ़ी चौड़ा क्रोमेटिन अनुरूप कब्जा पुस्तकालयों जल्दी Drosophila भ्रूण का मंचन

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

यह विधि क्रोमेटिन आर्किटेक्चर क्षेत्र में महत्वपूर्ण प्रश्नों के उत्तर देने में मदद कर सकती है जैसे कि क्रोमेटिन की 3डी संरचना जीन अभिव्यक्ति और विकास को कैसे प्रभावित कर सकती है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह क्रोमेटिन वास्तुकला का एक उच्च संकल्प दृश्य प्रदान करता है और ठीक फ्लाई भ्रूण का मंचन करता है। हालांकि यह विधि क्रोमेटिन संगठन और विकास में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है, लेकिन क्रोमेटिन संगठन में उनके प्रभाव का परीक्षण करने के लिए ट्रांसजेनिक फ्लाई पुस्तकालयों से मौजूदा लाइनों का भी उपयोग कर सकते हैं।प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए, पहले एकत्र भ्रूण की कुल मात्रा को पीबीएसटी के साथ दो मिलीलीटर में समायोजित करें। पानी में 37% फॉर्मलडिहाइड के छह मिलीलीटर हेप्टेन और 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। फॉर्मलडिहाइड जोड़ने के बाद, एक मिनट के लिए ट्यूब को ऊपर और नीचे तेजी से हिलाएं।जलीय और कार्बनिक चरण एक शैम्पू की तरह स्थिरता बनाने के लिए गठबंधन होगा। 10 मिनट के लिए एक रोटरी मिक्सर पर मिश्रण आंदोलन। ट्यूब के नीचे भ्रूण एकत्र करने के लिए कमरे के तापमान पर एक मिनट के लिए 500 बार जी पर ट्यूब अपकेंद्रित्र करें।पूरे शैम्पू की तरह तरल को एस्पिरेट करें और इसे त्यागें, किसी भी भ्रूण को एस्पिरेट न करने का ध्यान रखें। फॉर्मलडिहाइड को जोडऩे के 15 मिनट बाद, 125 मिलीमोलर ग्लाइसिन के साथ पीबीएसटी के पांच मिलीलीटर में भ्रूण को फिर से ढिंढाएं। भ्रूण को एक मिनट के लिए सख्ती से हिलाएं।अपकेंद्री के बाद, सुपरनेट को एस्पिरेट करें। 1, 000 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके, 100 भ्रूण के एक बैच को छंटाई के लिए उपयुक्त एक छोटे ग्लास पोत में स्थानांतरित करें, अधिमानतः एक अंधेरे पृष्ठभूमि पर और इसे बर्फ पर रखें। सुई या सिरिंज टिप का उपयोग करके परमाणु घनत्व और सेल चक्र स्थिति द्वारा भ्रूण को सॉर्ट करें।सभी मिटोटिक भ्रूण उनके फैलाया, गैर EGFP PCNA और भ्रूण है कि आंशिक रूप से एक गैर परमाणु GFP संकेत दिखाने के परमाणु वितरण से पहचानने योग्य निकालें । छंटाई सहायता करने के लिए, प्रत्येक बैच में 12, 13, और 14 में संदर्भ भ्रूण लाइन संदर्भ भ्रूण में से एक के साथ भ्रूण मैच के लिए । 1, 000 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके वांछित भ्रूण को पिपेट करें।उन्हें एक ताजा ट्यूब में स्थानांतरित करें और उन्हें बर्फ पर रखें। जब तक पर्याप्त भ्रूण की योजना बनाई प्रयोग के लिए हल कर रहे है जारी रखें । कमरे के तापमान पर 100 गुना ग्राम पर संक्षेप में स्पिन ट्यूब।सुपरनेट निकालें और सुनिश्चित करें कि भ्रूण ठंड के लिए जितना संभव हो उतना सूखा है। फ्लैश फ्रीज भ्रूण तरल नाइट्रोजन में ट्यूबों को जलमग्न करके और शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें । बर्फ पर जमे हुए भ्रूण के साथ ट्यूब रखें।बर्फ कोल्ड लाइसिस बफर के 500 माइक्रोलीटर में भ्रूण को फिर से खर्च करें। भ्रूण को ट्यूब के नीचे बसने की अनुमति देने के लिए एक मिनट प्रतीक्षा करें। इसके बाद, भ्रूण को एक धातु माइक्रो मूसल के साथ पीस लें जो बर्फ पर पूर्व-ठंडा होता है जिसे 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब को कसकर फिट करने के लिए डिज़ाइन किया गया है।भ्रूण को उत्तेजित करने से बचने के लिए, मूसल को धीरे-धीरे डालें जब तक कि यह ट्यूब के नीचे को न छू जाए। नीचे पुश करें और फिर मूसल को दोनों दिशाओं में दो बार घुमाकर पीस लें। मूसल को बहुत थोड़ा उठा।ट्यूब के नीचे फिर से पुश करें और पीसने की प्रक्रिया को 10 बार दोहराएं या जब तक भ्रूण पूरी तरह से नहीं हो जाते। समाधान समरूप होना चाहिए और भ्रूण के कोई अवशिष्ट बड़े टुकड़े नहीं रहना चाहिए । 15 मिनट के लिए बर्फ पर समरूप निलंबन इनक्यूबेट।पांच मिनट के लिए 1, 000 बार जी चार डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करें। सुपरनेट को त्यागें और 500 माइक्रोलीटर बर्फ ठंडे लाइसिस बफर में फिर से खर्च करके गोली को धोएं और ऊपर और नीचे पाइपिंग करें। एक और स्पिन के बाद, सुपरनैंट को त्यागें।0.5% सोडियम डोडेसिल सल्फेट या एसडीएस के 100 माइक्रोलीटर में धुले हुए गोली को फिर से खर्च करें। फिर एक हीटिंग ब्लॉक में 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए नमूना इनक्यूबेटिंग द्वारा नाभिक को पार करें। इसमें 10 प्रतिशत ट्राइटन X100 के 50 माइक्रोलीटर और 120 माइक्रोलीटर पानी डालें।सामग्री को मिलाने के लिए ट्यूब को झटका दें और एक हीट ब्लॉक में 15 मिनट के लिए ट्यूब को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। 10X प्रतिबंध एंजाइम बफर के 25 माइक्रोलीटर और माइक्रोलीटर MBO1 प्रति पांच इकाइयों की 20 इकाइयों को जोड़ें । सामग्री को मिलाने के लिए ट्यूब को झटका दें और डीएनए को पचाने के लिए ट्यूब को हीट ब्लॉक में इनक्यूबेट करें।MBO1 की एक और 20 इकाइयों को जोड़ें। इनक्यूबेशन को 90 मिनट तक जारी रखें। दूसरे ९० मिनट के इनक्यूबेशन के बाद, 20 मिनट के लिए ६२ डिग्री सेल्सियस पर नमूना इनक्यूबेट करने के लिए MBO1 निष्क्रिय ।इसके बाद, 0.4 मिलीमोलर बायोटिन 14-डैटपी के 18 माइक्रोलीटर, एक असंशोधित 3.3 मिलीमोलर डीसीटीपी-डीजीटीपी-डीटीटीपी मिश्रण के 2.25 माइक्रोलीटर जोड़ें, और पांच इकाइयों के आठ माइक्रोलीटर प्रति माइक्रोलीटर डीएनए पॉलीमरेज आई क्लेनो टुकड़ा। सामग्री को मिलाने के लिए ट्यूब को झटका दें और 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना को इनक्यूबेट करें। इसके बाद, 657 माइक्रोलीटर पानी, 10X टी 4 डीएनए लिगाज़ बफर के 120 माइक्रोलीटर, 10% ट्राइटन X100 के 100 माइक्रोलीटर, 20 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर गोविन सीरम एल्बुमिन के छह माइक्रोलीटर जोड़ें, और अंत में पांच इकाइयों के पांच माइक्रोलीटर प्रति माइक्रोलीटर टी 4 डीएनए लिगाज़।इसके बाद, ट्यूब को दो घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 20 आरपीएम पर धीरे से घुमाएं। माइक्रोलीटर T4 डीएनए लिगाज़ प्रति पांच इकाइयों के एक और पांच माइक्रोलीटर जोड़ें । दो घंटे के लिए घूर्णन जारी रखें, फिर पांच मिनट के लिए 2, 500 बार जी पर नाभिक नीचे स्पिन।अपकेंद्रित्र के बाद, सुपरनेट को त्यागें। निष्कर्षण बफर के 500 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से रीसस्ट करें और 20 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर प्रोटीन के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें और ट्यूब को पचाने के लिए ट्यूब को इनक्यूबेट करें। पांच मोलर सोडियम क्लोराइड के 130 माइक्रोलीटर जोड़ें और डी-क्रॉसलिंक करने के लिए रात भर इनक्यूबेट करें।अगले दिन, कम डीएनए बाध्यकारी विशेषताओं के साथ एक नई दो मिलीलीटर ट्यूब में नमूना पिपेट करें। तीन मोलर सोडियम एसीटेट के 0.1X वॉल्यूम और 15 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर ग्लाइकोब्लू के दो माइक्रोलीटर जोड़ें। शुद्ध निरपेक्ष इथेनॉल के 1.6 संस्करण जोड़ें और सामग्री को उलटा करें, फिर नमूने को 15 मिनट के लिए शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, सामग्री को अपकेंद्रित्र करें। डीएनए गोली का पता लगाएं जिसे केवल ग्लायकोब्लू द्वारा देखा जा सकता है। डीएनए गोली से विपरीत दीवार के साथ ट्यूब में पिपेट टिप को स्थानांतरित करें।70% इथेनॉल के 800 माइक्रोलीटर के साथ गोली धोएं। पांच मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 20, 000 बार जी पर उलटा और अपकेंद्रित्र द्वारा नमूना मिलाएं। इस चरण के दौरान शेष बूंदों को हटा दें और निम्नलिखित धोता उन्हें P10 टिप के साथ ट्यूबों से बाहर धकेलकर, फिर पांच मिनट तक हवा में सूखने के लिए ढक्कन खोलें।एक बार कोई तरल शेष नहीं होने के बाद, 10 मिलीमोलर ट्राइस क्लोराइड के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें। डीएनए को घुलनशील करने के लिए जिस क्षेत्र में गोली स्थित थी, उस पर समाधान को बार-बार पिपेट करें। ट्यूब को फ्लिक करके 20 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर RNase A.Mix का एक माइक्रोलीटर जोड़ें।आरएनए को पचाने के लिए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूना इनक्यूबेट करें। अंत में, पुस्तकालय की तैयारी तक फ्रीजर या फ्रिज में नमूना स्टोर करें। प्रत्येक हल भ्रूण बैच के EGFP PCNA संकेत की छवियां नीचे प्रयोगों के लिए हर एक भ्रूण के सटीक चरण और सेल चक्र स्थितियों का पता चलता है ।Bioanalyzer निशान बताते है कि आकार चयन के बाद डीएनए टुकड़े का आकार वितरण ३०० से ७०० आधार जोड़े के बीच है जिसमें अधिकतम लगभग ४५० आधार जोड़े हैं । हाय-सी इंटरैक्शन मैप्स से पता चलता है कि परमाणु चक्र 12 में, कुछ टोथोलॉजिकल रूप से संबद्ध डोमेन या TADs का पता लगाया जाता है जो परमाणु चक्र 13 और 14 में नाटकीय रूप से बदलता है जब TADs तेजी से प्रमुख होते हैं और अविशिष्ट लंबी दूरी के संपर्क समाप्त हो जाते हैं। इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, मोतियों को अच्छी तरह से धोना याद रखना महत्वपूर्ण है और इनक्यूबेशन बार अनावश्यक रूप से विशेष रूप से उच्च तापमान पर लम्बा नहीं करना चाहिए क्योंकि इससे कम गुणवत्ता वाले हाई-सी पुस्तकालय हो सकते हैं।सटीक मंचन और उच्च संकल्प क्रोमेटिन पुष्टि मानचित्रण के संयोजन वाली इस तकनीक ने एपिजेनेटिक्स के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए वीवो विकासात्मक सेटिंग में त्रि-आयामी क्रोमेटिन संगठन की भूमिका का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त किया।

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

डीएनए सामग्री माप द्वारा स्तनधारी प्रतिकृति समय के जीनोम चौड़ा निर्धारण

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nucleosome घनत्व विश्लेषण के लिए देशी क्रोमेटिन Immunoprecipitation अनुक्रमण पुस्तकालयों की पीढ़ी

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

मानचित्रण जीनोम-वाइड सुलभ क्रोमेटिन प्राथमिक मानव टी लिम्फोसाइटों में ATAC-Seq द्वारा

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

प्रमोटर कब्जा हाय-सी: उच्च संकल्प, जीनोम-व्यापक प्रमोटर बातचीत की रूपरेखा

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-क्रोमेटिन लूप संरचना की मध्यस्थता पुनर्गठन

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

जीनोम-Eukaryotic जीवों में प्रतिलेखन त्रुटियों की व्यापक निगरानी

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

परिपत्र गुणसूत्र अनुरूप कब्जा की अगली पीढ़ी के अनुक्रमण का उपयोग जीन विनियामक अनुक्रम का उच्च प्रवाह पहचान (4c-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

मात्रात्मक गुणसूत्र संरचना कैप्चर (4C) द्वारा भ्रूण निकायों में एन्हांस्ड-प्रमोटर संपर्कों की पहचान

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

मैग्नापोर्टे ओरिज़ा में क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन अनुक्रमण पद्धति का उपयोग करके हिस्टोन संशोधनों के जीनोम-वाइड विश्लेषण

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Chromosome Conformation Capture (3C) for Undergraduate Research and Teaching

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates (Video) | JoVE 

3 सी के साथ ए प्राप्त करना: अंडरग्रेजुएट्स के लिए क्रोमोसोम अनुरूपता कैप्चर।

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...