Name: generation of genome-wide chromatin conformation capture libraries from tightly staged early drosophila embryos
Uploaded: 2018-10-03T13:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos at JoVE.com

Denne forskningen ble finansiert av Max Planck Society. C.B.H. ble støttet av et fellesskap fra den internasjonale Max Planck Research School-molekylær biomedisin. Vi takker Shelby Blythe og Eric Wieschaus for vennlige gir eGFP-PCNA Drosophila melanogaster linjen.

<ol>
	<li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nat Rev Genet. 17 (11), 661-678 (2016).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Jin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+map+of+the+three-dimensional+chromatin+interactome+in+human+cells.">A high-resolution map of the three-dimensional chromatin interactome in human cells.</a> Nature. , (2013).</li><li>Rao, S. S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Map+of+the+Human+Genome+at+Kilobase+Resolution+Reveals+Principles+of+Chromatin+Looping.">A 3D Map of the Human Genome at Kilobase Resolution Reveals Principles of Chromatin Looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Darbellay, F., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+Domains,+Metagenes,+and+the+Emergence+of+Pleiotropic+Regulations+at+Hox+Loci.">Topological Domains, Metagenes, and the Emergence of Pleiotropic Regulations at Hox Loci.</a> Current topics in developmental biology. 116, 299-314 (2016).</li><li>Beagan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Genome+Topology+Can+Exhibit+an+Incompletely+Rewired+3D-Folding+State+during+Somatic+Cell+Reprogramming.">Local Genome Topology Can Exhibit an Incompletely Rewired 3D-Folding State during Somatic Cell Reprogramming.</a> Cell stem cell. 18 (5), 611-624 (2016).</li><li>Andrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+hundreds+of+regulatory+landscapes+in+developing+limbs+reveals+two+regimes+of+chromatin+folding.">Characterization of hundreds of regulatory landscapes in developing limbs reveals two regimes of chromatin folding.</a> Genome Res. 27 (2), 223-233 (2017).</li><li>Krijger, P. H. L., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome.">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li><li>Sexton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+folding+and+functional+organization+principles+of+the+Drosophila+genome.">Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome.</a> Cell. 148 (3), 458-472 (2012).</li><li>Ghavi-Helm, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+loops+appear+stable+during+development+and+are+associated+with+paused+polymerase.">Enhancer loops appear stable during development and are associated with paused polymerase.</a> Nature. 512 (7512), 96-100 (2014).</li><li>Foe, V. E., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+nuclear+and+cytoplasmic+behaviour+during+the+five+mitotic+cycles+that+precede+gastrulation+in+Drosophila+embryogenesis.">Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis.</a> J Cell Sci. 61, 31-70 (1983).</li><li>Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zygotic+Genome+Activation+Triggers+the+DNA+Replication+Checkpoint+at+the+Midblastula+Transition.">Zygotic Genome Activation Triggers the DNA Replication Checkpoint at the Midblastula Transition.</a> Cell. 160 (6), 1169-1181 (2015).</li><li>Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+maintenance+of+heritable+chromatin+structure+during+early+Drosophila+embryogenesis.">Establishment and maintenance of heritable chromatin structure during early Drosophila embryogenesis.</a> eLife. 5, e20148 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+Larva+Harvesting+and+Preparation.">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila melanogaster. , (2017).</li><li>Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Neuronal+Cultures+from+Midgastrula+Stage+Drosophila+Embryos.">Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (5), (2007).</li><li>Shermoen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Baskets+for+Drosophila+Egg+Collections,+Treatments,+and+Incubations.">Preparation of Baskets for Drosophila Egg Collections, Treatments, and Incubations.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (10), (2008).</li><li>Ay, F., Noble, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+methods+for+studying+the+3D+architecture+of+the+genome.">Analysis methods for studying the 3D architecture of the genome.</a> Genome biology. 16 (1), 183 (2015).</li><li>Lazaris, C., Kelly, S., Ntziachristos, P., Aifantis, I., Tsirigos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiC-bench:+comprehensive+and+reproducible+Hi-C+data+analysis+designed+for+parameter+exploration+and+benchmarking.">HiC-bench: comprehensive and reproducible Hi-C data analysis designed for parameter exploration and benchmarking.</a> BMC Genomics. 18 (1), (2017).</li><li>Servant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiC-Pro:+an+optimized+and+flexible+pipeline+for+Hi-C+data+processing.">HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C data processing.</a> Genome Biology. 16 (1), (2015).</li><li>Durand, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juicer+Provides+a+One-Click+System+for+Analyzing+Loop-Resolution+Hi-C+Experiments.">Juicer Provides a One-Click System for Analyzing Loop-Resolution Hi-C Experiments.</a> Cell systems. 3 (1), 95-98 (2016).</li><li>Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hitchhiker's+guide+to+Hi-C+analysis:+Practical+guidelines.">The Hitchhiker's guide to Hi-C analysis: Practical guidelines.</a> Methods. 72, 65-75 (2015).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopDom:+an+efficient+and+deterministic+method+for+identifying+topological+domains+in+genomes.">TopDom: an efficient and deterministic method for identifying topological domains in genomes.</a> Nucleic Acids Res. 44 (7), e70 (2016).</li><li>Kruse, K., Hug, C. B., Hern&#225;ndez-Rodr&#237;guez, B., Vaquerizas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TADtool:+visual+parameter+identification+for+TAD-calling+algorithms.">TADtool: visual parameter identification for TAD-calling algorithms.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3190-3192 (2016).</li><li>L&#233;vy-Leduc, C., Delattre, M., Mary-Huard, T., Robin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+segmentation+for+analyzing+Hi-C+data.">Two-dimensional segmentation for analyzing Hi-C data.</a> Bioinformatics. 30 (17), i386-i392 (2014).</li><li>Filippova, D., Patro, R., Duggal, G., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+alternative+topological+domains+in+chromatin.">Identification of alternative topological domains in chromatin.</a> Algorithms for molecular biology: AMB. 9 (1), 14 (2014).</li><li>Crane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensin-driven+remodelling+of+X+chromosome+topology+during+dosage+compensation.">Condensin-driven remodelling of X chromosome topology during dosage compensation.</a> Nature. 523 (7559), 240-244 (2015).</li><li>Durand, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juicebox+Provides+a+Visualization+System+for+Hi-C+Contact+Maps+with+Unlimited+Zoom.">Juicebox Provides a Visualization System for Hi-C Contact Maps with Unlimited Zoom.</a> Cell systems. 3 (1), 99-101 (2016).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+long-range+genome+interactions+using+the+WashU+Epigenome+Browser.">Exploring long-range genome interactions using the WashU Epigenome Browser.</a> Nature Methods. 10 (5), 375-376 (2013).</li><li>Ram&#237;rez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies.">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> bioRxiv. , 115063 (2017).</li><li>Kerpedjiev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiGlass:+Web-based+Visual+Comparison+And+Exploration+Of+Genome+Interaction+Maps.">HiGlass: Web-based Visual Comparison And Exploration Of Genome Interaction Maps.</a> bioRxiv. , 121889 (2017).</li><li>Hug, C. B., Grimaldi, A. G., Kruse, K., Vaquerizas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+Architecture+Emerges+during+Zygotic+Genome+Activation+Independent+of+Transcription.">Chromatin Architecture Emerges during Zygotic Genome Activation Independent of Transcription.</a> Cell. 169 (2), (2017).</li><li>Berkum, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes.">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), (2010).</li><li>Naumova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+mitotic+chromosome.">Organization of the mitotic chromosome.</a> Science. 342 (6161), 948-953 (2013).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+2.0:+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation.">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods (San Diego, Calif). 123, 56-65 (2017).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Protokollen presenteres her er svært effektiv til å generere høy kvalitet kart av den chromatin arkitekturen i tidlig Drosophila embryoer. Sammenlignet med en tidligere protokollen34, bruker tilnærming som er beskrevet her en oppdatert i situ Hi-C prosedyren5, som resulterer i raskere behandling, høyere oppløsning, og mindre reagens forbruk. Den generelle prosedyren inkludert i situ Hi-C protokoll forventes å arbeide på en rekke etapper og eksperimentelle systemer foruten Drosophila. Siden protokollen har en lav input kravet, kan den også brukes på isolerte celle populasjoner. I Drosophila, når bruker protokollen for embryoer utenfor område beskrevet her, noen parametere, kanskje spesielt fiksering av materialet, må justeres. Siden eldre embryo utvikle en svært ugjennomtrengelig cuticle, kan øke konsentrasjonen av formaldehyd og forlenge fiksering være hensiktsmessig. For innsamling av embryo på stadier enn kjernefysiske syklus 14, inkubasjon tider embryo ved 25 ° C i trinn 1.4 må justeres som følger: kjernefysiske syklus 12: 70 min; kjernefysisk syklus 13, 90 min; 3-4 hpf, 3:30 h.
Under 13 cleavage divisjonene (stadium 1-4), fordobles kjerner tettheten omtrent hver avdeling. Kjerner kan lett identifiseres av deres lys GFP fluorescens. Under mitose, eGFP-PCNA finnes ikke i kjernen og dekningen er spredt over hele fosteret. Denne funksjonen gjør identifiserende embryo som er under en synkron cleavage divisjon mulig. For å studere chromatin konformasjon, er disse mitotisk embryo vanligvis ikke ønskelig, siden mitotisk organiseringen av chromatin er drastisk annerledes enn de interphase organisasjon35. Det er mulig å tilpasse protokollen for å velge spesielt embryo gjennomgår en synkron mitotisk divisjon. I dette tilfellet bare embryo med spredte, ikke-nukleære distribusjon av eGFP-PCNA bør holdes, og alle andre embryo skal kastes. Siden kjernefysiske tettheten ikke kan bestemmes, må alternative metoder til scenen embryo av deres morfologi vises i overført * lys være ansatt. Pol cellene og kjerner i fosteret periferien indikerer at fosteret har fullført minst kjernefysiske syklus 9, mens synlig cellularization i periferien angir kjernefysiske syklus 1412.
Hei-C eksperimenter utføres med hell med et bredt utvalg av begrensning enzymer5. Gjeldende tilnærminger bruker vanligvis enzymer som gjenkjenner enten en 4-base rekkefølge, for eksempel MboI eller en 6-base anerkjennelse webområdet, for eksempel HindIII. Fordelen av 4-base cutters over 6-base kniver er at de tilbyr høyere potensielle oppløsning, gitt nok sekvensering dybde og en jevnere dekning av begrensning nettsteder over genomet. Det er ingen klar fordel i å velge en 4-base kutter over ytterligere5,23,36,37. De to vanligste enzymene, MboI og DpnII, erkjenner begge det samme GATC anerkjennelse området. DpnII er mindre sensitiv for CpG metylering, som er ingen bekymring i Drosophila. Protokollen presenteres her kan også være fullført med DpnII som en begrensning enzym. I delen 4.2. begrensning enzym og buffer må justeres for DpnII kompatibilitet, i henhold til produsentens anbefalinger.
Hvis fragment størrelsen på sekvensering biblioteket avviker betydelig fra området vises i figur 2A, kan klynge formasjon under sekvensering være mindre effektiv eller ikke. I dette tilfellet størrelsesDistribusjon etter klipping bør sjekkes og klipping parametere justert tilsvarende. Toppene i fordelingen av DNA fragmenter av veldig små (< 100 bp) eller stor (> 1000 bp) størrelser indikerer problemer med størrelse utvalg, for eksempel bære perler eller nedbryting som skal forkastes. Ofte disse bibliotekene med små topper på disse uønskede størrelser, for eksempel en avbildet, er fortsatt sekvensielt vellykket med bare en mindre nedgang i klynger effektivitet.
Høy forekomst av PCR duplisering bør unngås fordi dette drastisk reduserer antall brukbare sekvens leser. Frekvensen av PCR duplikater er direkte relatert til mengden av input materiale. Bruke flere inndata derfor lindrer vanligvis problemer med PCR duplisering.
Høyere antall leseoperasjoner filtrert på grunn av Les orientering ()finne 2B) angi utilstrekkelig fordøyelsen, som kan være et resultat av bruker for lite enzym, for mye input materiale eller ufullstendig homogenisering av embryo.

Chromatin konformasjon fange (3C) har dukket opp som en svært nyttig metode for å studere topologien for chromatin i kjernen1. 3C varianten Hi-C kan måle kontakt frekvenser av alle chromatin vekselsvirkningene som kjernen i et enkelt eksperiment2. Anvendelse av Hi-C har spilt en viktig rolle i oppdagelsen og karakterisering av mange grunnleggende prinsipper for chromatin organisasjonen, som var TADs, avdelinger og looper3,4,5.
Studier av chromatin arkitektur i forbindelse med utviklingsmessige overganger og celledifferensiering brukes stadig å rakne mekanismer av genet regulering under disse prosessene6,7,8, 9. En modell organismer av stor interesse er Drosophila melanogaster, som utvikling og genom blir godt preget. Imidlertid gjennomført få studier som undersøker chromatin arkitektur i Drosophila utenfor i vitro vev kultur er10,11. I embryoer ble 16 til 18 h innlegget befruktning, var TADs og avdelinger minner om lignende strukturer i pattedyr identifisert10, som reiser spørsmålet om hvilken rolle de spiller i genet regulering i Drosophila embryo utvikling. Spesielt i de tidlige stadiene av utviklingen, før gastrulation, er slike studier teknisk utfordrende. Før gastrulation gjennomgå Drosophila embryo 13 synkron kjernefysiske divisjoner som fortsetter i en svært rask tempo 8 – 60 min per syklus12,13. Mangel på visuelle funksjoner til å skille de ulike fasene gjør det vanskelig å få tett trinnvis embryoet materiale i tilstrekkelige mengder.
For å utvikle en protokoll som tillater studere chromatin arkitektur i Drosophila utviklingen kjernefysiske syklus oppløsning, vi kombinert to eksisterende teknikker: i situ Hi-C, som tillater generering av høy oppløsning hele genomet kontakt kart5og embryo iscenesettelse bruke en transgene Drosophila uttrykke en eGFP-PCNA transgene13,14. Denne transgene regionaliserer til kjernen under interphase og knuses gjennom syncytial blastoderm under mitose. Med denne egenskapen, er det mulig å enkelt skille ulike stadier av tetthet deres kjernefysiske og mitotisk embryo ved spredning av GFP.
Sammen disse teknikkene kan studere tredimensjonale strukturen i chromatin i høy oppløsning fra så lite som 20 Drosophila embryoer. Denne protokollen inneholder instruksjoner for høsting og sortere Drosophila embryo hente bestander av embryoer fra en enkelt kjernefysiske divisjon syklus. Videre beskriver hvordan de innhentet embryoene brukes til å utføre i situ Hi-C. Sluttresultatet er en nukleotid biblioteket egnet for sekvensering på neste generasjons sekvensering maskiner. Den resulterende sekvensering lest kan deretter behandles i detaljert chromatin interaksjon kart som dekker hele Drosophila genomet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dATP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>19524016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MboI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0147L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase I Klenow Fragment</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0012</td>
			<td>T4 DNA Ligase Buffer included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina&#160;(Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335</td>
			<td>Sequencing Adaptor, Forward (unindexed) PCR primer and Reverse (indexed) PCR primer and USER enzyme used in the Library preparation section are components of this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645</td>
			<td>End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix and Polymerase Master Mix used in the Library preparation section are components of this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S2 AFA System</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon cell strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td>Embryo collection baskets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>437536C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>122062.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165 FC fluorescent stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165 FC DFC camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal micro pestle</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P985.1</td>
			<td>Used to lyse embryos in step 4.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3832,0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65002</td>
			<td>Streptavidin coated magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP-PCNA flies</td>
			<td>Gift from S. Blythe and E. Wieschaus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite 13%</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer pH 8.0 (1 M) for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Nucleotide Mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814362001</td>
			<td>Unmodified dCTP, dGTP, dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M solution for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate 3M pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Mixer RM-2L</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5729802</td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td>Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Embryo Collection Cages</td>
			<td>Flystuff.com</td>
			<td>59-100</td>
			<td>Egg collection cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube strips</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7202S</td>
			<td>T4 DNA Polymerase buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genome-wide chromatin conformation capture libraries from tightly staged early drosophila embryos

Undersøker tredimensjonale arkitektur chromatin tilbyr uvurderlig innsikt mekanismer av genet regulering. Her beskriver vi en protokoll for å utføre den chromatin konformasjon fange teknikk i situ Hi-C på iscenesatt Drosophila melanogaster embryoet populasjoner. Resultatet er en sekvensering bibliotek som lar tilordningen av alle chromatin vekselsvirkningene som kjernen i ett enkelt eksperiment. Fosteret sortering gjøres manuelt med fluorescerende stereo mikroskop og en transgene flua linjen som inneholder en kjernefysisk markør. Bruker denne teknikken, fosteret befolkningsgrupper fra hver kjernefysiske divisjon syklus, og med definerte celle syklus status, kan fås med svært høy renhet. Protokollen kan også tilpasses til å sortere eldre embryo utover gastrulation. Sorterte embryo brukes som inndata for i situ Hi-C. Alle eksperimenter, inkludert sekvensering biblioteket forberedelse, kan fullføres på fem dager. Protokollen har lav input krav og fungerer pålitelig med 20 blastoderm scenen embryo som inndata materiale. Sluttresultatet er en sekvensering bibliotek for neste generasjons sekvensering. Etter sekvensering, kan dataene behandles i genomet hele chromatin interaksjon kart som kan analyseres ved hjelp av en rekke tilgjengelige verktøy til å få informasjon om topologisk knytte domenestruktur (TAD), chromatin looper og chromatin rom under Drosophila utvikling.

Sortert embryoet bestander på kjernefysiske syklus 12, 13 og 14 (tilsvarer 1:30 1:45 og 2:10 timer legge befruktning, henholdsvis12) og 3-4 h innlegget befruktning (hpf) ble oppnådd i henhold til prosedyrene som er beskrevet i protokollen. Ved å ta bilder av eGFP-PCNA hvert sorterte embryoet parti, er det mulig å dokumentere nøyaktig scenen og celle syklus status for hver enkelt embryo som brukes i nedstrøms eksperimenter. Eksempelbilder av embryoer fra sorterte populasjoner er vist i figur 1B-E. Resultatet av i situ Hi-C protokollen er en nukleotid biblioteket klar som ble sekvensert på neste generasjons sekvensering maskiner. For dette formålet er en siste biblioteket konsentrasjon av minst 2-4 nM vanligvis nødvendig. Bruke anbefalte mengder input materiale, denne konsentrasjonen er pålitelig oppnådd (tabell 1).
Forventet størrelsesDistribusjon av DNA etter størrelse er mellom 300-600 bp, med maksimalt 500 bp (figur 2A), avhengig av nøyaktig klippe og størrelse utvalg parametere. Sekvensering anbefaler vi sammen-end leser 75 bp lengden å minimere antall på begrensning fragmenter i genomet. Høyoppløselig kart med 1 – 2 kb bin størrelse kan fås fra 400 millioner leser. Vi anbefaler sekvensering flere biologiske gjentak med en lavere dybde av ~ 150 millioner leser hver, i stedet for sekvensering en enkelt gjenskape på svært høy dybde. Dette gjør vurdering av biologisk variasjon og fører til et lavere antall kasserte leser på grunn av PCR duplisering. For visuell representasjon, kan gjentak kombineres. Før du forplikter deg til sekvensering et utvalg på høy dybde, anbefaler vi kjører prøver ved grunne sekvensering (noen millioner leser per eksempel) å bestemme grunnleggende biblioteket kvalitet parametere som figur 2B.
Analyse av Hi-C data krever betydelig beregningsorientert ressurser og bioinformatikk kompetanse. Som en grov oversikt, den sammenkoblede lest tilordnes uavhengig referanse genomet, resulterende justeringer filtreres for kvalitet og retning, deretter en matrise av kontakter på en bestemt hylle oppløsning eller fragment kan genereres fra den filtrerte justeringer. Kontakt matrix er grunnlaget for alle ytterligere nedstrøms analyse utforske var TADs, løkker og avdelinger. Flere bioinformatikk rørledninger er tilgjengelig for den første analysen i sekvensering lyder, som aktiverer behandling av lese rådata i kontakt matriser uten mye spesialiserte bioinformatikk kunnskap18,19, 20,21,22,23. Hvordan videre analyse er gjennomført avhenger i stor grad på den eksakte biologiske spørsmålet under studien og kreve betydelig erfaring innen programmering og scripting i R eller Python. Men flere verktøy og algoritmer til ring var TADs er tilgjengelig5,,24,,25,,26,,27,,28, i tillegg til å analysere og utforske Hi-C data i webleseren og som frittstående desktop-applikasjoner29,30,31,32.
Når behandlet, kan kvaliteten på biblioteket bestemmes ved hjelp av ulike beregninger (figur 2B). Først bør frekvensen av PCR duplikater, som er antall sekvensert Les par fremkommer fra samme opprinnelige molekyl, være så lavt som mulig å begrense mengden av bortkastet sekvens. Men selv biblioteker med > 40% PCR duplisering kan bearbeides til høy kvalitet kontakt kart hvis duplikatene er filtrert. Andre bør av filtrert på grunn av retning, som beskrevet i4, prisen konsekvent være lavere enn 10% av justert Les.
Under pre gastrular utviklingen av Drosophila mellom kjernefysiske syklus 12 og 14 er kjernefysiske arkitektur drastisk ombygde33 (Figur 3). Noen var TADs oppdages kjernefysiske syklus 12, og den generelle fordelingen av kontakter er svært glatt uten mange merkes funksjoner. Dette er dramatisk endret på kjernefysiske syklus 13 og 14, når var TADs er stadig mer fremtredende og uspesifikke langtrekkende kontakter er oppbrukt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig1.jpg"> Figur 1: representant bilder av eGFP-PCNA embryo under sortering. (A) eGFP-PCNA signalet fra en usortert befolkning av embryo etter 60 min samling og 2t inkubasjon på 25 ° C (B-E) eksempler på embryoer fra sorterte populasjoner på kjernefysiske syklus 12 (B), kjernefysiske syklus 13 (C), 14 () kjernefysiske syklus D), og fra embryo gjennomgår synkron mitose (E). Skalere barer = 200 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig2.jpg"> Figur 2: Eksempler på i situ Hi-C biblioteket kvalitet beregninger. (A) Bioanalyzer spor viser fordelingen av DNA fragment størrelser fra en vellykket Hi-C library (bibliotek 1, topp) og et bibliotek som viser en topp på fragmenter som er for stor for sekvensering (biblioteket 2, bunn). Biblioteket 2 var vellykket sekvensert, men enda større mengder uønsket DNA fragmenter kan føre til redusert sekvensering avkastning. (B) filtrering statistikk over to Hei-C-bibliotek: vises er antall justert Les par som er utelatt fra videre analyse på grunn av Les retning og avstand (innover, utover)4 eller PCR duplisering (like). I hver bar tegnes leser passerer filteret (gjenværende) og sviktende (filtrert). Andelen leser passerer filteret vises i tillegg som tekst. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig3.jpg"> Figur 3: Hei-C samhandling kart fra trinnvis embryoer. Hei-C samhandling kartene er binned 10 kb oppløsning og balansert som beskrevet før33. Vist er et område på Kromosom 2 L. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Biblioteket</td>
			<td>Scenen</td>
			<td>Antall embryo</td>
			<td>Beløp DNA før klipping (ng)</td>
			<td>PCR sykluser</td>
			<td>Siste biblioteket konsentrasjon (nM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>kjernefysisk syklus 12</td>
			<td>71</td>
			<td>46</td>
			<td>12</td>
			<td>28,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>kjernefysisk syklus 12</td>
			<td>46</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>kjernefysisk syklus 12</td>
			<td>60</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>kjernefysisk syklus 13</td>
			<td>36</td>
			<td>39</td>
			<td>12</td>
			<td>22.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>kjernefysisk syklus 13</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>kjernefysisk syklus 13</td>
			<td>48</td>
			<td>18</td>
			<td>12</td>
			<td>8.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>kjernefysisk syklus 14</td>
			<td>33</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>39.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>kjernefysisk syklus 14</td>
			<td>24</td>
			<td>36</td>
			<td>12</td>
			<td>20.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>kjernefysisk syklus 14</td>
			<td>14</td>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>17</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>24,0</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>18</td>
			<td>42</td>
			<td>11</td>
			<td>19.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>22</td>
			<td>63</td>
			<td>11</td>
			<td>48,4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: liste over representant sekvensering biblioteket statistikk. For hvert bibliotek i listen antall embryo som ble brukt til sin generasjon, mengden totalt DNA før biotin pulldown og skråstilling målt ved FROLINA, sykluser antall PCR for forsterkning og endelige konsentrasjonen av sekvensering biblioteket etter rensing og størrelse er angitt.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos at JoVE.com

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Dette verket beskriver en protokoll for generering av høy oppløsning i situ Hi-C biblioteker fra tett iscenesatt pre gastrulation Drosophila melanogaster embryoer.

Generasjon av genomet hele Chromatin konformasjon fange biblioteker fra tett trinnvis tidlig Drosophila embryo

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Denne metoden kan bidra til å svare på viktige spørsmål i kromatinarkitekturfeltet, for eksempel hvordan 3D-strukturen av kromatin kan påvirke genuttrykk og utvikling. Den største fordelen med denne teknikken er at den gir en høyoppløselig visning av kromatinarkitektur og nøyaktig iscenesatte flyembryoer. Selv om denne metoden kan gi innsikt i kromatin organisasjon og utvikling, kan man også bruke eksisterende linjer fra transgene flybiblioteker for å teste effekten i kromatin organisasjon.For å starte protokollen, juster det totale volumet av tidligere innsamlede embryoer til to milliliter med PBST. Tilsett seks milliliter heptan og 100 mikroliter med 37% formaldehyd i vann. Etter å ha lagt formaldehyd, kraftig riste røret opp og ned i ett minutt.Den vandige og organiske fasen vil kombineres for å danne en sjampolignende konsistens. Agitate blandingen på en roterende mikser i 10 minutter. Sentrifuger røret ved 500 ganger g i ett minutt ved romtemperatur for å samle embryoer nederst på røret.Aspirer hele sjampolignende væsken og kast den, og ta vare på å ikke aspirere noen embryoer. 15 minutter etter tilsetning av formaldehyd, resuspend embryoene i fem milliliter PBST med 125 millimolar glycin. Rist embryoene opp og ned kraftig i ett minutt.Etter sentrifugering, aspirerer supernatanten. Bruk en 1000 mikroliter pipette, overfør en batch på 100 embryoer til et lite glassfartøy som passer for sortering, helst på mørk bakgrunn og legg den på is. Sorter embryoer etter kjernefysisk tetthet og cellesyklusstatus ved hjelp av en nål- eller sprøytespiss.Fjern alle mititotiske embryoer som er gjenkjennelige ved deres spredte, ikke-kjernefysiske fordeling av EGFP PCNA og embryoer som delvis viser et ikke-kjernefysisk GFP-signal. For å hjelpe sorteringen, linje opp referanse embryoer på kjernefysiske sykluser 12, 13, og 14 i hver batch for å matche embryoer med en av referanse embryoer. Pipette opp de ønskede embryoene ved hjelp av en 1000 mikroliter pipette.Overfør dem til et friskt rør og legg dem på is. Fortsett til nok embryoer er sortert for det planlagte eksperimentet. Spin rør kort på 100 ganger g ved romtemperatur.Fjern det overnaturlige og sørg for at embryoene er så tørre som mulig for frysing. Flash fryse embryoer ved å senke rørene i flytende nitrogen og lagre på minus 80 grader Celsius. Plasser rørene med frosne embryoer på is.Resuspend embryoene i 500 mikroliter iskald lysis buffer. Vent ett minutt for å la embryoet bosette seg på bunnen av røret. Deretter sliper embryoene med en metallmikro pestle forkjølt på is som er designet for å passe godt til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør.For å unngå å røre embryoene, sett pestle sakte inn til den berører bunnen av røret. Skyv ned og slip deretter ved å rotere pestle to ganger i begge retninger. Løft pestle veldig litt.Skyv til bunnen av røret igjen og gjenta slipeprosedyren 10 ganger eller til embryoene er helt lyset. Løsningen skal være homogen og ingen gjenværende store biter av embryoer bør forbli. Inkuber den homogeniserte suspensjonen på is i 15 minutter.Spinn på 1, 000 ganger g fire grader Celsius i fem minutter. Kast det overnaturlige og vask pelleten ved å gjenbruke i 500 mikroliter iskald lysisbuffer og pipettering opp og ned. Etter et nytt spinn, kast supernatanten.Resuspend vasket pellet i 100 mikroliter på 0,5% Natrium Dodecyl Sulfate eller SDS. Deretter gjennomsyrer du kjernene ved å inkubere prøven i 10 minutter ved 65 grader Celsius i en varmeblokk. Tilsett 50 mikroliter med 10 % Triton X100 og 120 mikroliter vann.Knips røret for å blande innholdet og inkubere røret ved 37 grader Celsius i 15 minutter i en varmeblokk. Tilsett 25 mikroliter med 10X begrensningsenzymbuffer og 20 enheter med fem enheter per mikroliter MBO1. Knips røret for å blande innholdet og inkubere røret i en varmeblokk for å fordøye DNA.Legg til ytterligere 20 enheter MBO1. Fortsett inkubasjonen i 90 minutter. Etter den andre 90-minutters inkubasjonen inkuberer du prøven ved 62 grader Celsius i 20 minutter til inaktiv MBO1.Deretter legger du til 18 mikroliter med 0,4 millimolar biotin 14-dATP, 2,25 mikroliter av en uendret 3,3 millimolar dCTP-dGTP-dTTP-blanding, og åtte mikroliter med fem enheter per mikroliter DNA polymerase I Klenow fragment. Knips røret for å blande innholdet og inkuber prøven på 37 grader Celsius i 90 minutter. Deretter legger du til 657 mikroliter vann, 120 mikroliter 10X T4 DNA ligase buffer, 100 mikroliter på 10% Triton X100, seks mikroliter på 20 milligram per milliliter storfe serum albumin, og til slutt fem mikroliter på fem enheter per mikroliter T4 DNA-ligase.Deretter roterer du røret forsiktig ved 20 RPM ved romtemperatur i to timer. Tilsett ytterligere fem mikroliter på fem enheter per mikroliter T4 DNA-ligase. Fortsett å rotere i to timer til, og spinn deretter ned kjernene ved 2 500 ganger g i fem minutter.Etter sentrifugering, kast supernatanten. Resuspend pellet i 500 mikroliter ekstraksjon buffer og tilsett 20 mikroliter på 20 milligram per milliliter proteinase K.Flick røret og inkubere røret for å fordøye proteinet. Tilsett 130 mikroliter av fem molarnatriumklorid og inkuber over natten for å de-krysslink.Neste dag pipetter prøven inn i et nytt to milliliterrør med lave DNA-bindende egenskaper. Tilsett 0,1 x volum av tre molarnatriumacetat og to mikroliter på 15 milligram per milliliter GlycoBlue. Tilsett 1,6 volumer ren absolutt etanol og inverter innholdet, og inkuber deretter prøven ved minus 80 grader Celsius i 15 minutter.Etter inkubasjon, sentrifuge innholdet. Finn DNA pellet som bare kan oppdages av GlycoBlue. Fjern den overnaturlige forsiktig, flytte pipette spissen inn i røret langs motsatt vegg fra DNA pellet.Vask pelleten med 800 mikroliter på 70% etanol. Bland prøven ved å invertere og sentrifuge den ved 20 000 ganger g ved romtemperatur i fem minutter. Fjern gjenværende dråper i løpet av dette trinnet, og følgende vasker ved å skyve dem ut av rørene med en P10-spiss, og åpne deretter lokket for å lufttørke i opptil fem minutter.Når ingen væske er igjen, tilsett 50 mikroliter på 10 millimolar tris klorid. Pipette oppløsningen gjentatte ganger over området der pelleten var plassert for å løse DNA-et. Legg til en mikroliter på 20 milligram per milliliter RNase A.Mix ved å knipse røret.Inkuber prøven ved 37 grader Celsius i 15 minutter for å fordøye RNA. Til slutt, lagre prøven i fryseren eller kjøleskapet til biblioteket forberedelse. Bilder av EGFP PCNA-signalet fra hvert sorterte embryoparti avslører nøyaktige stadium- og cellesyklusstatuser for hvert enkelt embryo for nedstrøms eksperimenter.Bioanalyzer spor viser at størrelsesfordelingen av DNA fragmenter etter størrelsesvalg er mellom 300 til 700 base par med maksimalt på rundt 450 base par. Hi-C interaksjonskart viser at ved kjernefysisk syklus 12 oppdages få topologisk tilknyttede domener eller TADer som endres dramatisk ved kjernefysiske sykluser 13 og 14 når TADs blir stadig mer fremtredende og uspesifisiske langdistansekontakter er utarmet. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktig å huske å vaske perlene grundig og ikke forlenge inkubasjonstiden unødvendig, spesielt ved høye temperaturer, siden dette kan føre til høykvalitets Hi-C-biblioteker.Denne teknikken som kombinerer nøyaktig iscenesettelse og høyoppløselig kromatinbekreftelseskartlegging banet vei for forskere innen epigenetikk for å utforske rollen som tredimensjonal kromatinorganisasjon i en in vivo utviklingsinnstilling.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genome-wide Fastsettelse av pattedyr Replication Timing av DNA innhold Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generasjon av innfødte Chromatin Immunoprecipitation sekvensering biblioteker til Nucleosome tetthet analyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Kartlegging genomet hele tilgjengelig Chromatin i primære menneskelige T-lymfocytter av ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Promotoren fange Hei-C: Med høy oppløsning, genomet-bred profilering av arrangøren interaksjoner

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-mediert reorganisering av Chromatin Loop struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genomet hele overvåking av transkripsjon feil i eukaryote organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Høy gjennomstrømming identifikasjon av regulatoriske gensekvenser med neste generasjons sekvensering av runde kromosom konformasjon fange (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identifikasjon av enhancer-promoter kontakter i embryoid organer av kvantitative kromosom conformation capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Genomomfattende analyse av histone modifikasjoner Distribusjon ved hjelp av Chromatin Immunoprecipitation Sekvensering Metode i Magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Chromosome Conformation Capture (3C) for Undergraduate Research and Teaching

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates (Video) | JoVE 

Få en A med 3Cs: Kromosomkonformasjonsfangst for studenter

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...