Name: generation of genome-wide chromatin conformation capture libraries from tightly staged early drosophila embryos
Uploaded: 2018-10-03T13:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos at JoVE.com

Forskningen finansierades av Max Planck Society. C.B.H. stöddes av ett stipendium från den internationella Max Planck forskarskolan – molekylär biomedicin. Vi tackar Shelby Blythe och Eric Wieschaus för vänligt att ge andra-PCNA Drosophila melanogaster linjen.

<ol>
	<li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nat Rev Genet. 17 (11), 661-678 (2016).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Jin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+map+of+the+three-dimensional+chromatin+interactome+in+human+cells.">A high-resolution map of the three-dimensional chromatin interactome in human cells.</a> Nature. , (2013).</li><li>Rao, S. S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Map+of+the+Human+Genome+at+Kilobase+Resolution+Reveals+Principles+of+Chromatin+Looping.">A 3D Map of the Human Genome at Kilobase Resolution Reveals Principles of Chromatin Looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Darbellay, F., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+Domains,+Metagenes,+and+the+Emergence+of+Pleiotropic+Regulations+at+Hox+Loci.">Topological Domains, Metagenes, and the Emergence of Pleiotropic Regulations at Hox Loci.</a> Current topics in developmental biology. 116, 299-314 (2016).</li><li>Beagan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Genome+Topology+Can+Exhibit+an+Incompletely+Rewired+3D-Folding+State+during+Somatic+Cell+Reprogramming.">Local Genome Topology Can Exhibit an Incompletely Rewired 3D-Folding State during Somatic Cell Reprogramming.</a> Cell stem cell. 18 (5), 611-624 (2016).</li><li>Andrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+hundreds+of+regulatory+landscapes+in+developing+limbs+reveals+two+regimes+of+chromatin+folding.">Characterization of hundreds of regulatory landscapes in developing limbs reveals two regimes of chromatin folding.</a> Genome Res. 27 (2), 223-233 (2017).</li><li>Krijger, P. H. L., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome.">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li><li>Sexton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+folding+and+functional+organization+principles+of+the+Drosophila+genome.">Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome.</a> Cell. 148 (3), 458-472 (2012).</li><li>Ghavi-Helm, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+loops+appear+stable+during+development+and+are+associated+with+paused+polymerase.">Enhancer loops appear stable during development and are associated with paused polymerase.</a> Nature. 512 (7512), 96-100 (2014).</li><li>Foe, V. E., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+nuclear+and+cytoplasmic+behaviour+during+the+five+mitotic+cycles+that+precede+gastrulation+in+Drosophila+embryogenesis.">Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis.</a> J Cell Sci. 61, 31-70 (1983).</li><li>Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zygotic+Genome+Activation+Triggers+the+DNA+Replication+Checkpoint+at+the+Midblastula+Transition.">Zygotic Genome Activation Triggers the DNA Replication Checkpoint at the Midblastula Transition.</a> Cell. 160 (6), 1169-1181 (2015).</li><li>Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+maintenance+of+heritable+chromatin+structure+during+early+Drosophila+embryogenesis.">Establishment and maintenance of heritable chromatin structure during early Drosophila embryogenesis.</a> eLife. 5, e20148 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+Larva+Harvesting+and+Preparation.">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila melanogaster. , (2017).</li><li>Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Neuronal+Cultures+from+Midgastrula+Stage+Drosophila+Embryos.">Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (5), (2007).</li><li>Shermoen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Baskets+for+Drosophila+Egg+Collections,+Treatments,+and+Incubations.">Preparation of Baskets for Drosophila Egg Collections, Treatments, and Incubations.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (10), (2008).</li><li>Ay, F., Noble, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+methods+for+studying+the+3D+architecture+of+the+genome.">Analysis methods for studying the 3D architecture of the genome.</a> Genome biology. 16 (1), 183 (2015).</li><li>Lazaris, C., Kelly, S., Ntziachristos, P., Aifantis, I., Tsirigos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiC-bench:+comprehensive+and+reproducible+Hi-C+data+analysis+designed+for+parameter+exploration+and+benchmarking.">HiC-bench: comprehensive and reproducible Hi-C data analysis designed for parameter exploration and benchmarking.</a> BMC Genomics. 18 (1), (2017).</li><li>Servant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiC-Pro:+an+optimized+and+flexible+pipeline+for+Hi-C+data+processing.">HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C data processing.</a> Genome Biology. 16 (1), (2015).</li><li>Durand, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juicer+Provides+a+One-Click+System+for+Analyzing+Loop-Resolution+Hi-C+Experiments.">Juicer Provides a One-Click System for Analyzing Loop-Resolution Hi-C Experiments.</a> Cell systems. 3 (1), 95-98 (2016).</li><li>Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hitchhiker's+guide+to+Hi-C+analysis:+Practical+guidelines.">The Hitchhiker's guide to Hi-C analysis: Practical guidelines.</a> Methods. 72, 65-75 (2015).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopDom:+an+efficient+and+deterministic+method+for+identifying+topological+domains+in+genomes.">TopDom: an efficient and deterministic method for identifying topological domains in genomes.</a> Nucleic Acids Res. 44 (7), e70 (2016).</li><li>Kruse, K., Hug, C. B., Hern&#225;ndez-Rodr&#237;guez, B., Vaquerizas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TADtool:+visual+parameter+identification+for+TAD-calling+algorithms.">TADtool: visual parameter identification for TAD-calling algorithms.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3190-3192 (2016).</li><li>L&#233;vy-Leduc, C., Delattre, M., Mary-Huard, T., Robin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+segmentation+for+analyzing+Hi-C+data.">Two-dimensional segmentation for analyzing Hi-C data.</a> Bioinformatics. 30 (17), i386-i392 (2014).</li><li>Filippova, D., Patro, R., Duggal, G., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+alternative+topological+domains+in+chromatin.">Identification of alternative topological domains in chromatin.</a> Algorithms for molecular biology: AMB. 9 (1), 14 (2014).</li><li>Crane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensin-driven+remodelling+of+X+chromosome+topology+during+dosage+compensation.">Condensin-driven remodelling of X chromosome topology during dosage compensation.</a> Nature. 523 (7559), 240-244 (2015).</li><li>Durand, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juicebox+Provides+a+Visualization+System+for+Hi-C+Contact+Maps+with+Unlimited+Zoom.">Juicebox Provides a Visualization System for Hi-C Contact Maps with Unlimited Zoom.</a> Cell systems. 3 (1), 99-101 (2016).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+long-range+genome+interactions+using+the+WashU+Epigenome+Browser.">Exploring long-range genome interactions using the WashU Epigenome Browser.</a> Nature Methods. 10 (5), 375-376 (2013).</li><li>Ram&#237;rez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies.">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> bioRxiv. , 115063 (2017).</li><li>Kerpedjiev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiGlass:+Web-based+Visual+Comparison+And+Exploration+Of+Genome+Interaction+Maps.">HiGlass: Web-based Visual Comparison And Exploration Of Genome Interaction Maps.</a> bioRxiv. , 121889 (2017).</li><li>Hug, C. B., Grimaldi, A. G., Kruse, K., Vaquerizas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+Architecture+Emerges+during+Zygotic+Genome+Activation+Independent+of+Transcription.">Chromatin Architecture Emerges during Zygotic Genome Activation Independent of Transcription.</a> Cell. 169 (2), (2017).</li><li>Berkum, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes.">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), (2010).</li><li>Naumova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+mitotic+chromosome.">Organization of the mitotic chromosome.</a> Science. 342 (6161), 948-953 (2013).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+2.0:+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation.">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods (San Diego, Calif). 123, 56-65 (2017).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Det protokoll som presenteras här är mycket effektiv på att skapa högkvalitativa kartor av kromatin arkitektur i tidiga Drosophila embryon. Jämfört med ett tidigare protokoll34, använder den metod som beskrivs här en aktuell i situ Hi-C förfarande5, vilket resulterar i snabbare bearbetning, högre upplösning, och mindre reagens användning. Det övergripande förfarandet inklusive i situ Hi-C protokollet förväntas arbeta på en rad olika stadier och experimentella system förutom Drosophila. Eftersom protokollet har en låg ingång krav, kan det också användas på isolerade cellpopulationer. I Drosophila, när använda protokollet för embryon utanför intervallet som beskrivs här, vissa parametrar, kan särskilt fixering av materialet, behöva justeras. Eftersom äldre embryon utveckla en mycket tät nagelband, kan höja koncentrationen av formaldehyd och förlänga fixering vara lämpligt. För insamling av embryon i skeden än kärnkraft cykel 14, de andra inkubationstider embryon vid 25 ° C i steg 1.4 behöver justeras enligt följande: nukleära cykel 12, 70 min; nukleära cykel 13, 90 min; 3 – 4 hpf, 3:30 h.
Under divisionerna 13 klyvning (etapp 1-4), fördubblas kärnor tätheten ungefär med varje division. Atomkärnor kan lätt identifieras genom sin ljusa GFP-fluorescens. Under Mitos, andra-PCNA ligger inte i kärnan och dess signal är spridda över hela embryot. Denna funktion gör att identifiera embryon som genomgår en synkron klyvning division möjligt. För att studera kromatin konformation, är dessa mitotiska embryon oftast inte önskvärt, eftersom den mitotiska organisationen av kromatin är drastiskt annorlunda än de interphase organisation35. Det är möjligt att anpassa protokollet specifikt Markera embryon som genomgår en synkron mitotiska division. I detta fall endast embryon med spridda, icke-nukleära distribution av andra-PCNA bör hållas, och alla andra embryon ska kasseras. Eftersom den nukleära tätheten inte kan fastställas, måste alternativa metoder till scenen embryon av deras morfologi i överförda ljusmikroskopi användas. Förekomsten av pole celler och atomkärnor embryo periferi indikera att embryot har avslutat minst kärnkraft cykel 9, medan synliga cellularization i periferin indikerar nukleära cykel 1412.
Hi-C experiment kan utföras framgångsrikt med ett brett urval av restriktionsenzym5. Nuvarande metoder använder vanligtvis enzymer som känner igen antingen en 4-base-sekvens, till exempel MboI eller en 6-base erkännande webbplats, till exempel HindIII. Fördelen med 4-base fräsar över 6-base fräsar är att de erbjuder högre potentiella upplösning, gett tillräckligt sekvensering djup och en mer jämn täckning av begränsning platser över genomet. Det finns ingen tydlig fördel att välja en 4-base cutter över ytterligare5,23,36,37. De två vanligaste enzymerna, MboI och DpnII, igen båda samma GATC erkännande plats. DpnII är mindre känslig för CpG metylering, som inte berör i Drosophila. Det protokoll som presenteras här kan även slutföras med DpnII som ett restriktionsenzym. I avsnitt 4.2. restriktionsenzym och buffert måste justeras för DpnII kompatibilitet, enligt tillverkarens rekommendationer.
Om fragmentet storleken av sekvensering biblioteket avviker väsentligt från det område som visas i figur 2A, kan kluster bildas under sekvensering vara mindre effektiv eller misslyckas helt. I det här fallet storleksfördelning efter klippning bör kontrolleras och klippning parametrar justeras därefter. Toppar i fördelningen av DNA-fragment av mycket små (< 100 bp) eller mycket stora (> 1000 bp) storlekar indikerar problem med storlek urval, såsom carry över av pärlor eller supernatanten som ska kasseras. Ofta dessa bibliotek med små toppar på dessa oönskade storlekar, såsom den på bilden, är fortfarande sekvenserade framgångsrikt med endast en smärre minskning klustring effektivitet.
Höga priser för PCR dubbelarbete bör undvikas eftersom detta minskar drastiskt antalet användbara sekvensen läser. Graden av PCR dubbletter är direkt relaterad till mängden ingående material. Med mer input därför avhjälper vanligtvis problem med PCR dubbelarbete.
Högre antal läsningar filtreras på grund av Läs orientering ()figur 2B) indikera otillräcklig matsmältningen, vilket kan vara resultatet av att använda för lite enzym, för mycket insatsmaterial eller ofullständig homogenisering av embryon.

Kromatin konformation capture (3C) har vuxit fram som en exceptionellt bra metod att studera topologin av kromatin i nucleus1. 3C varianten Hi-C tillåter mätning kontakt frekvenserna av alla kromatin-interaktioner som inträffar i kärnan i en enda experiment2. Tillämpningen av Hi-C har spelat en viktig roll i upptäckten och karakterisering av många grundläggande principer av kromatin organisation, till exempel TADs, fack och loopar3,4,5.
Studier av kromatin arkitektur inom ramen för utvecklingstoxicitet övergångar och celldifferentiering används alltmer att nysta upp mekanismer för genreglering vid dessa processer6,7,8, 9. En av modellorganismerna av stort intresse är Drosophila melanogaster, vars utveckling och arvsmassan är väl karakteriserade. Dock genomföras få studier som undersöker kromatin arkitektur i Drosophila utanför i vitro vävnadsodling inställningar har varit10,11. I embryon var 16 – 18 h post befruktning, TADs och fack som påminner om liknande strukturer i däggdjur identifierade10, vilket väcker frågan om vilken roll de spelar i genreglering vid Drosophila embryo utveckling. Särskilt i de tidiga stadierna av utveckling, före gastrulation, är sådana studier tekniskt utmanande. Innan gastrulation genomgå Drosophila embryon 13 synkron nukleära uppdelningar som går i en extremt snabb takt 8 – 60 min per cykel12,13. Utöver detta, bristen på visuella funktioner att skilja de olika stadierna gör det svårt att få tätt stegvis embryo material i tillräckliga mängder.
För att utveckla ett protokoll som tillåter studera kromatin arkitekturen i tidiga Drosophila utveckling på nukleära cykel upplösning, vi kombinerat två befintliga tekniker: i situ Hi-C, vilken tillåt generering av hög upplösning hela genomet kontakt kartor5och embryo iscensättning med hjälp av en transgen Drosophila uttrycker en andra-PCNA transgenens13,14. Detta transgenens lokaliserar till kärnan under interfasen och skingrar i hela den syncytial blastoderm under Mitos. Med den här egenskapen, är det möjligt att enkelt skilja olika stadier av deras nukleära densitet och mitotiska embryon av spridningen av GFP signalen.
Tillsammans, dessa tekniker möjliggör studera den tredimensionella strukturen av kromatin i hög upplösning från så få som 20 Drosophila embryon. Detta protokoll innehåller instruktionerna för skörd och sortering Drosophila embryon att få populationer av embryon från en division och kärn-cykel. Den beskriver vidare hur de erhållna embryona används för att utföra i situ Hi-C. Slutresultatet är en nukleotid bibliotek passar sekvensering på nästa generations sekvensering-maskiner. Den resulterande sekvensering läser kan sedan förädlas till detaljerad kromatin interaktion kartor som täcker hela Drosophila genomet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dATP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>19524016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MboI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0147L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase I Klenow Fragment</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0012</td>
			<td>T4 DNA Ligase Buffer included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina&#160;(Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335</td>
			<td>Sequencing Adaptor, Forward (unindexed) PCR primer and Reverse (indexed) PCR primer and USER enzyme used in the Library preparation section are components of this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645</td>
			<td>End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix and Polymerase Master Mix used in the Library preparation section are components of this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S2 AFA System</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon cell strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td>Embryo collection baskets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>437536C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>122062.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165 FC fluorescent stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165 FC DFC camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal micro pestle</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P985.1</td>
			<td>Used to lyse embryos in step 4.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3832,0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65002</td>
			<td>Streptavidin coated magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP-PCNA flies</td>
			<td>Gift from S. Blythe and E. Wieschaus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite 13%</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer pH 8.0 (1 M) for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Nucleotide Mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814362001</td>
			<td>Unmodified dCTP, dGTP, dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M solution for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate 3M pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Mixer RM-2L</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5729802</td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td>Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Embryo Collection Cages</td>
			<td>Flystuff.com</td>
			<td>59-100</td>
			<td>Egg collection cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube strips</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7202S</td>
			<td>T4 DNA Polymerase buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genome-wide chromatin conformation capture libraries from tightly staged early drosophila embryos

Utreda den tredimensionella arkitekturen av kromatin erbjuder ovärderlig inblick i mekanismerna för genreglering. Här beskriver vi ett protokoll för att utföra den kromatin konformation capture teknik i situ Hi-C på iscensatt Drosophila melanogaster embryo populationer. Resultatet är en sekvensering bibliotek som låter kartläggning av alla kromatin-interaktioner som inträffar i kärnan i ett enda experiment. Embryo sortering görs manuellt med en fluorescerande stereo Mikroskop och en transgena linan som innehåller en nukleär markör. Med hjälp av denna teknik, embryo populationer från varje nukleära division cykel, och med definierade cellcykeln status, kan erhållas med mycket hög renhet. Protokollet kan också anpassas till sortera äldre embryon bortom gastrulation. Sorterade embryon används som insatsvaror för i situ Hi-C. Alla experiment, inklusive sekvensering bibliotek förberedelse, kan slutföras i fem dagar. Protokollet har låga ingående krav och fungerar tillförlitligt med 20 blastoderm scenen embryon som insatsmaterial. Slutresultatet är en sekvensering bibliotek för nästa generations sekvensering. Efter sekvensering, kan data bearbetas till genome-wide kromatin interaktion kartor som kan analyseras med hjälp av ett brett utbud av tillgängliga verktyg för att få information om topologically associera domänstruktur (TAD), kromatin loopar och kromatin fack under Drosophila utveckling.

Sorterade embryo populationer på nukleära cykel 12, 13 och 14 (motsvarande 1:30, 1:45, och 2:10 timmar efter befruktning, respektive12) och 3-4 h efter befruktning (hpf) erhölls enligt de förfaranden som beskrivs i protokollet. Genom att ta bilder av andra-PCNA signalen av varje sorterad embryo parti, är det möjligt att dokumentera varje enda embryo som används i nedströms experiment exakt scenen och cellcykeln status. Exempel bilder av embryon från sorterade populationer visas i figur 1B-E. Produktionen av protokollet i situ Hi-C är en nukleotid bibliotek redo att sekvenseras på nästa generations sekvensering-maskiner. För detta ändamål krävs vanligtvis en sista bibliotek koncentration av minst 2 – 4 nM. Med de rekommendera mängderna insatsmaterial, denna koncentration är tillförlitligt uppnås (tabell 1).
Förväntad storlek distribution av DNA-fragment efter storlek urval är mellan 300 – 600 bp, med ett maximum på runt 500 bp ()figur 2A), beroende på den exakta klippning och storlek urvalsparametrar. För sekvensering rekommenderar vi Parade-end läsningar av minst 75 bp längd att minimera antalet unmappable begränsning fragment i genomet. Högupplösta kartor med 1 – 2 kb bin storlek kan erhållas från 400 miljoner läsningar. Vi rekommenderar sekvensering flera biologiska replikat på ~ 150 miljoner lägre djup läser varje, i stället för sekvensering en enda replikera på mycket stora djup. Detta tillåter bedömning av den biologiska variationen och leder till ett lägre antal kasserade läsningar på grund av PCR dubbelarbete. För visuell representation, kan replikerar kombineras. Innan de bestämmer sig sekvensering ett prov på hög djup, rekommenderar vi kör exempel med grunt sekvensering (några miljoner läsningar per prov) att fastställa grundläggande bibliotek kvalitetsparametrar som i figur 2B.
Analys av Hi-C data kräver betydande computational resurser och bioinformatik expertis. Som en grov översikt, den parkopplade läser mappas självständigt till referens genomet, de resulterande linjeföring filtreras för kvalitet och orientering, då en matris av kontakter på en given bin upplösning eller fragment nivå kan genereras från de filtrerade linjeföring. Kontakt matrisen är grunden för all vidare nedströms analys att utforska TADs, loopar och fack. För den inledande analysen av sekvensering läser, det finns flera bioinformatik rörledningar som aktiverar bearbetning av raw-läsningar till kontakt matriser utan mycket specialiserade bioinformatik kunskap18,19, 20,21,22,23. Hur ytterligare analys bärs ut beror till stor del på den exakta biologiska frågan under studien och kan kräva betydande erfarenhet av programmering och scripting i R eller Python. Flera verktyg och algoritmer att kalla TADs är dock tillgängliga5,24,25,26,27,28, samt programvara för att analysera och utforska Hi-C data i webbläsaren och som fristående skrivbordsprogram29,30,31,32.
När bearbetat, kan kvaliteten på biblioteket bestämmas med hjälp av olika mätvärden (figur 2B). Först, PCR dubbletter, som är antalet sekvenserade Läs par som härrör från samma ursprungliga molekyl, bör vara så låg som möjligt för att begränsa mängden bortkastad sekvens läsningar. Men även bibliotek med > 40% PCR dubbelarbete kan bearbetas till högkvalitativa kontakt kartor om dubbletter filtreras. För det andra bör graden av filtrerade läsningar på grund av sin läggning, enligt4, konsekvent lägre än 10% av justerad Läs par.
Under pre gastrular utvecklingen av Drosophila mellan nukleära cykel 12 och 14 är nukleära arkitekturen drastiskt ombyggda33 (figur 3). På nukleära cykel 12, några TADs upptäcks, och den totala fördelningen av kontakter är mycket smidigt utan många urskiljbara funktioner. Detta är dramatiskt förändrades på nukleära cykel 13 och 14, när TADs är alltmer framträdande och ospecifikt långväga kontakter är uttömda.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig1.jpg"> Figur 1: representativa bilder av andra-PCNA embryon under sortering. (A) andra-PCNA signal från en osorterade befolkning av embryon efter 60 min insamling och 2 h inkubation vid 25 ° C (B-E) exempel på embryon från sorterade populationer på nukleära cykel 12 (B), nukleära cykel 13 (C), 14 () kärntekniska cykel ( D), och från embryon som genomgår synkron Mitos (E). Skala barer = 200 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig2.jpg"> Figur 2: Exempel på i situ Hi-C bibliotek kvalitet mätvärden. (A) Bioanalyzer spår visar fördelningen av DNA fragment storlekar från en framgångsrik Hi-C bibliotek (bibliotek 1, övre) och ett bibliotek som visar en topp av fragment som är för stora för sekvensering (bibliotek 2, undre). Biblioteket 2 sekvenserades framgångsrikt, men även större mängder oönskade DNA-fragment kan leda till minskad sekvensering avkastning. (B) filtrering statistik av två Hi-C-bibliotek: visas är antalet justerad Läs par som är undantagna från ytterligare analys på grund av Läs orientering och avstånd (inåt, utåt)4 eller PCR dubbelarbete (dubbla). I varje stapel ritas antalet läsningar som passerar filtret (återstående) och sviktande (filtrerat). Procentandelen av läser passerar filtret visas dessutom som text. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig3.jpg"> Figur 3: Hej-C interaktion kartor från stegvis embryon. Hi-C interaktion kartorna är kastas i papperskorgen på 10 kb upplösning och balanserad som beskrivs innan33. Visas är en region på kromosom 2 L. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Bibliotek</td>
			<td>Skede</td>
			<td>Antal embryon</td>
			<td>Mängden DNA innan klippning (ng)</td>
			<td>PCR-cykler</td>
			<td>Slutliga bibliotek koncentration (nM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>nukleära cykel 12</td>
			<td>71</td>
			<td>46</td>
			<td>12</td>
			<td>28,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>nukleära cykel 12</td>
			<td>46</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>22,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>nukleära cykel 12</td>
			<td>60</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>12.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>nukleära cykel 13</td>
			<td>36</td>
			<td>39</td>
			<td>12</td>
			<td>22,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>nukleära cykel 13</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>nukleära cykel 13</td>
			<td>48</td>
			<td>18</td>
			<td>12</td>
			<td>8,7</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>nukleära cykel 14</td>
			<td>33</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>39,8</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>nukleära cykel 14</td>
			<td>24</td>
			<td>36</td>
			<td>12</td>
			<td>20,4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>nukleära cykel 14</td>
			<td>14</td>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>17</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>24,0</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>18</td>
			<td>42</td>
			<td>11</td>
			<td>19,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>22</td>
			<td>63</td>
			<td>11</td>
			<td>48,4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: förteckning över representativa sekvensering Statistikbiblioteket. För varje bibliotek i listan antalet embryon som användes för sin generation, mängden totala DNA innan biotin pulldown och klippning mätt med Qubit, cykler antalet PCR används för förstärkning och sekvensering biblioteket slutliga koncentration efter rening och storlek urvalet indikeras.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos at JoVE.com

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Detta arbete beskriver ett protokoll för generering av hög upplösning i situ Hi-C bibliotek från iscensatt tätt före gastrulation Drosophila melanogaster embryon.

Generation av Genome-wide kromatin konformation fånga bibliotek från tätt stegvis tidiga Drosophila embryon

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom kromatinarkitekturfältet som hur kromatinens 3D-struktur kan påverka genuttryck och utveckling. Den största fördelen med denna teknik är att det ger en hög upplösning syn på kromatin arkitektur och exakt iscensatt flyga embryon. Fast denna metod kan ge inblick i kromatinorganisation och utveckling, kan man också använda existerande fodrar från transgenic flugaarkiv för att testa deras verkställer i kromatinorganisation.För att börja protokollet, justera den totala volymen av tidigare insamlade embryon till två milliliter med PBST. Tillsätt sex milliliter heptan och 100 mikroliter av 37%formaldehyd i vatten. Efter att ha lagt till formaldehyd, kraftigt skaka röret upp och ner i en minut.Den vattenhaltiga och organiska fasen kommer att kombineras för att bilda en schampo-liknande konsistens. Agitera blandningen på en roterande mixer i 10 minuter. Centrifugera röret vid 500 gånger g under en minut vid rumstemperatur för att samla embryon i botten av röret.Aspirera hela schampo-liknande vätska och kasta den, var noga med att inte aspirera några embryon. 15 minuter efter tillsats av formaldehyd, resuspend embryona i fem milliliter PBST med 125 millimolar glycin. Skaka embryona upp och ner kraftigt i en minut.Efter centrifugering, aspirera supernatanten. Med hjälp av en 1, 000 mikroliterpipett, överför ett parti av 100 embryon till ett litet glaskärl som lämpar sig för sortering, helst på en mörk bakgrund och placera den på is. Sortera embryon efter kärntäthet och cellcykelstatus med hjälp av en nål eller sprutspets.Avlägsna alla mitotiska embryon som känns igen genom deras spridda, icke-nukleära distribution av EGFP PCNA och embryon som delvis visar en icke-nukleär GFP-signal. Som stöd till sorteringen radas referensembryon i kärncyklerna 12, 13 och 14 i varje parti för att matcha embryon med ett av referensembryonen. Pipa upp de önskade embryona med hjälp av en 1, 000 microliter pipett.Överför dem till ett nytt rör och placera dem på is. Fortsätt tills tillräckligt med embryon sorteras för det planerade experimentet. Spinnrör kort vid 100 gånger g vid rumstemperatur.Ta bort supernatanten och se till att embryona är så torra som möjligt för frysning. Flash frysa embryon genom att dränka rören i flytande kväve och lagra på minus 80 grader Celsius. Placera rören med frysta embryon på is.Resuspend embryona i 500 mikroliter av iskall lysbuffert. Vänta en minut så att embryot kan lägga sig i botten av röret. Därefter slipa embryona med en metallmikropestels förkyld på is som är utformad för att tätt passa ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör.För att undvika att agitera embryona, sätt in mortelstöten långsamt tills den vidrör botten av röret. Tryck ner och slipa sedan genom att rotera mortelstöten två gånger i båda riktningarna. Lyft mortelstöten mycket något.Tryck till botten av röret igen och upprepa slipningsproceduren 10 gånger eller tills embryona är helt lyst. Lösningen ska vara homogen och inga kvarstående stora bitar av embryon bör finnas kvar. Inkubera den homogeniserade suspensionen på is i 15 minuter.Snurra på 1, 000 gånger g fyra grader Celsius i fem minuter. Kassera supernatant och tvätta pelleten genom att återständer i 500 microliter iskall lysbuffert och pipettering upp och ner. Efter en annan spinn, kasta supernatanten.Resuspend den tvättade pelleten i 100 mikroliter av 0,5%Natrium dodecyl Sulfate eller SDS. Sedan genomsyra kärnorna genom att inkubera provet i 10 minuter vid 65 grader Celsius i ett värmeblock. Tillsätt 50 mikroliter av 10%Triton X100 och 120 mikroliter vatten.Snärta röret för att blanda innehållet och inkubera röret i 37 grader Celsius i 15 minuter i ett värmeblock. Tillsätt 25 mikroliter av 10X restriktionsenzymbuffert och 20 enheter om fem enheter per mikroliter MBO1. Snärta röret för att blanda innehållet och inkubera röret i ett värmeblock för att smälta DNA.Lägg till ytterligare 20 enheter av MBO1. Fortsätt inkubationen i 90 minuter. Efter den andra inkubationen på 90 minuter inkubering, inkubera provet i 62 grader Celsius i 20 minuter för att inaktiv MBO1.Därefter lägger du till 18 mikroliter av 0,4 millimolar biotin 14-dATP, 2,25 mikroliter av en omodifierad 3,3 millimolar dCTP-dGTP-dTTP mix, och åtta mikroliter av fem enheter per mikroliter DNA-polymeras I Klenow fragment. Snärta på röret för att blanda innehållet och inkubera provet i 37 grader Celsius i 90 minuter. Därefter lägger 657 mikroliter vatten, 120 mikroliter av 10X T4 DNA ligase buffert, 100 mikroliter av 10%Triton X100, sex mikroliter av 20 milligram per milliliter bovin serumalbumin, och slutligen fem mikroliter av fem enheter per microliter T4 DNA ligase.Därefter roterar du röret försiktigt vid 20 RPM i rumstemperatur i två timmar. Lägg till ytterligare fem mikroliter av fem enheter per mikroliter T4 DNA ligase. Fortsätt rotera i ytterligare två timmar, snurra sedan ner kärnorna vid 2, 500 gånger g i fem minuter.Efter centrifugeringen kasserar du supernatanten. Resuspend pelleten i 500 mikroliter av extraktionsbuffert och tillsätt 20 mikroliter på 20 milligram per milliliter proteinas K.Flick röret och inkubera röret för att smälta proteinet. Tillsätt 130 mikroliter av fem molarnatriumklorid och inkubera över natten till de-crosslink.Nästa dag pipettera provet till ett nytt två milliliterrör med låg DNA-bindningsegenskaper. Tillsätt 0.1X volym av tre molar natriumacetat och två mikroliter på 15 milligram per milliliter GlycoBlue. Tillsätt 1,6 volymer ren absolut etanol och invertera innehållet, sedan inkubera provet på minus 80 grader Celsius i 15 minuter.Efter inkubation, centrifug innehållet. Lokalisera DNA-pelleten som bara kan upptäckas av GlycoBlue. Ta bort supernatanten försiktigt, flytta pipettspetsen in i röret längs den motsatta väggen från DNA-pelleten.Tvätta pelleten med 800 mikroliter av 70%etanol. Blanda provet genom att invertera och centrifugera det vid 20, 000 gånger g i rumstemperatur i fem minuter. Ta bort kvarvarande droppar under detta steg och följande tvättar genom att trycka ut dem ur rören med en P10-spets, öppna sedan locket för att lufttorka i upp till fem minuter.När ingen vätska återstår, tillsätt 50 mikroliter av 10 millimolar tris klorid. Upprepade gånger pipettera lösningen över det område där pelleten var belägen för att solubilisera DNA. Lägg till en mikroliter på 20 milligram per milliliter RNase A.Mix genom att snärta röret.Inkubera provet vid 37 grader Celsius i 15 minuter för att smälta RNA. Slutligen, förvara provet i frysen eller kylen tills biblioteket tillredning. Bilder av EGFP PCNA signalen av varje sorterade embryo parti avslöjar exakta skede och cell cykel status varje enskilt embryo för nedströms experiment.Bioanalyzer-spår visar att storleksfördelningen av DNA-fragment efter storleksval är mellan 300 till 700 baspar med maximalt runt 450 baspar. Hi-C interaktion kartor visar att vid kärnkraftscykeln 12, få Topologically Associated Domains eller TADs upptäcks som förändras dramatiskt vid nukleära cykler 13 och 14 när TADs blir allt mer framträdande och ospecifik långväga kontakter är uttömda. Medan du försöker detta förfarande, det är viktigt att komma ihåg att tvätta pärlorna noggrant och inte förlänga inkubationstider i onödan särskilt vid höga temperaturer eftersom detta kan leda till låg kvalitet Hi-C bibliotek.Denna teknik som kombinerar noggrann iscensättning och högupplöst kromatin bekräftelse kartläggning banade väg för forskare inom epigenetik att utforska den roll som tredimensionella kromatin organisation i en in vivo utvecklingsmässiga inställning.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genomvid Fastställande av däggdjur Replication Timing av DNA-innehåll Mätning

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation av infödda kromatin Immunoprecipitation sekvensering bibliotek för Nucleosome densitet analys

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Mappning av Genome-wide tillgängliga kromatin i primära humana T-lymfocyter av ATAC-Seq

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Arrangören Capture-C: Högupplösta, Genome-wide profilering av promotorn interaktioner

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-medierad omorganiseringen av kromatin Loop struktur

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genome-wide övervakning av transkription fel i eukaryota organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Hög genomströmning identifiering av reglerande gensekvenser som använder nästa generations sekvensering av cirkulär kromosom konformation fånga (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Identifiering av förstärkare-promotor kontakter i embryoid organ av kvantitativa kromosom konformation Capture (4C)

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Genomomfattande analys av fördelning av histonmodifieringar med hjälp av chromatinimmunprecipitationssekvenseringsmetoden i Magnaporthe oryzae

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Chromosome Conformation Capture (3C) for Undergraduate Research and Teaching

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates (Video) | JoVE 

Få ett A med 3Cs: Kromosomkonformationsfångst för studenter

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...