Name: generation of genome-wide chromatin conformation capture libraries from tightly staged early drosophila embryos
Uploaded: 2018-10-03T13:30:00
Duration: 10 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos at JoVE.com

Bu araştırma Max Planck toplum tarafından finanse edildi. C.B.H. moleküler Biyomedikal Uluslararası Max Planck Araştırma Okulu – bir bursu tarafından desteklenmiştir. Biz Shelby Blythe ve Eric Wieschaus nazik eGFP-PCNA Drosophila melanogaster satır verdiğiniz için teşekkür ederiz.

<ol>
	<li>Bonev, B., Cavalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+function+of+the+3D+genome.">Organization and function of the 3D genome.</a> Nat Rev Genet. 17 (11), 661-678 (2016).</li><li>Lieberman-Aiden, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+mapping+of+long-range+interactions+reveals+folding+principles+of+the+human+genome.">Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome.</a> Science. 326 (5950), 289-293 (2009).</li><li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions.">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li><li>Jin, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+map+of+the+three-dimensional+chromatin+interactome+in+human+cells.">A high-resolution map of the three-dimensional chromatin interactome in human cells.</a> Nature. , (2013).</li><li>Rao, S. S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+Map+of+the+Human+Genome+at+Kilobase+Resolution+Reveals+Principles+of+Chromatin+Looping.">A 3D Map of the Human Genome at Kilobase Resolution Reveals Principles of Chromatin Looping.</a> Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).</li><li>Darbellay, F., Duboule, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+Domains,+Metagenes,+and+the+Emergence+of+Pleiotropic+Regulations+at+Hox+Loci.">Topological Domains, Metagenes, and the Emergence of Pleiotropic Regulations at Hox Loci.</a> Current topics in developmental biology. 116, 299-314 (2016).</li><li>Beagan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Genome+Topology+Can+Exhibit+an+Incompletely+Rewired+3D-Folding+State+during+Somatic+Cell+Reprogramming.">Local Genome Topology Can Exhibit an Incompletely Rewired 3D-Folding State during Somatic Cell Reprogramming.</a> Cell stem cell. 18 (5), 611-624 (2016).</li><li>Andrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+hundreds+of+regulatory+landscapes+in+developing+limbs+reveals+two+regimes+of+chromatin+folding.">Characterization of hundreds of regulatory landscapes in developing limbs reveals two regimes of chromatin folding.</a> Genome Res. 27 (2), 223-233 (2017).</li><li>Krijger, P. H. L., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+disease-associated+gene+expression+in+the+3D+genome.">Regulation of disease-associated gene expression in the 3D genome.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 771-782 (2016).</li><li>Sexton, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+folding+and+functional+organization+principles+of+the+Drosophila+genome.">Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome.</a> Cell. 148 (3), 458-472 (2012).</li><li>Ghavi-Helm, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancer+loops+appear+stable+during+development+and+are+associated+with+paused+polymerase.">Enhancer loops appear stable during development and are associated with paused polymerase.</a> Nature. 512 (7512), 96-100 (2014).</li><li>Foe, V. E., Alberts, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+nuclear+and+cytoplasmic+behaviour+during+the+five+mitotic+cycles+that+precede+gastrulation+in+Drosophila+embryogenesis.">Studies of nuclear and cytoplasmic behaviour during the five mitotic cycles that precede gastrulation in Drosophila embryogenesis.</a> J Cell Sci. 61, 31-70 (1983).</li><li>Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zygotic+Genome+Activation+Triggers+the+DNA+Replication+Checkpoint+at+the+Midblastula+Transition.">Zygotic Genome Activation Triggers the DNA Replication Checkpoint at the Midblastula Transition.</a> Cell. 160 (6), 1169-1181 (2015).</li><li>Blythe, S. A., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+and+maintenance+of+heritable+chromatin+structure+during+early+Drosophila+embryogenesis.">Establishment and maintenance of heritable chromatin structure during early Drosophila embryogenesis.</a> eLife. 5, e20148 (2016).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+and+Larva+Harvesting+and+Preparation.">Embryo and Larva Harvesting and Preparation.</a> Biology I: yeast, Drosophila and C. elegans. Drosophila melanogaster. , (2017).</li><li>Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Neuronal+Cultures+from+Midgastrula+Stage+Drosophila+Embryos.">Preparation of Neuronal Cultures from Midgastrula Stage Drosophila Embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (5), (2007).</li><li>Shermoen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Baskets+for+Drosophila+Egg+Collections,+Treatments,+and+Incubations.">Preparation of Baskets for Drosophila Egg Collections, Treatments, and Incubations.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (10), (2008).</li><li>Ay, F., Noble, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+methods+for+studying+the+3D+architecture+of+the+genome.">Analysis methods for studying the 3D architecture of the genome.</a> Genome biology. 16 (1), 183 (2015).</li><li>Lazaris, C., Kelly, S., Ntziachristos, P., Aifantis, I., Tsirigos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiC-bench:+comprehensive+and+reproducible+Hi-C+data+analysis+designed+for+parameter+exploration+and+benchmarking.">HiC-bench: comprehensive and reproducible Hi-C data analysis designed for parameter exploration and benchmarking.</a> BMC Genomics. 18 (1), (2017).</li><li>Servant, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiC-Pro:+an+optimized+and+flexible+pipeline+for+Hi-C+data+processing.">HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C data processing.</a> Genome Biology. 16 (1), (2015).</li><li>Durand, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juicer+Provides+a+One-Click+System+for+Analyzing+Loop-Resolution+Hi-C+Experiments.">Juicer Provides a One-Click System for Analyzing Loop-Resolution Hi-C Experiments.</a> Cell systems. 3 (1), 95-98 (2016).</li><li>Lajoie, B. R., Dekker, J., Kaplan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hitchhiker's+guide+to+Hi-C+analysis:+Practical+guidelines.">The Hitchhiker's guide to Hi-C analysis: Practical guidelines.</a> Methods. 72, 65-75 (2015).</li><li>Schmitt, A. D., Hu, M., Ren, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+and+analysis+of+chromosome+architecture.">Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 17 (12), 743-755 (2016).</li><li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopDom:+an+efficient+and+deterministic+method+for+identifying+topological+domains+in+genomes.">TopDom: an efficient and deterministic method for identifying topological domains in genomes.</a> Nucleic Acids Res. 44 (7), e70 (2016).</li><li>Kruse, K., Hug, C. B., Hern&#225;ndez-Rodr&#237;guez, B., Vaquerizas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TADtool:+visual+parameter+identification+for+TAD-calling+algorithms.">TADtool: visual parameter identification for TAD-calling algorithms.</a> Bioinformatics. 32 (20), 3190-3192 (2016).</li><li>L&#233;vy-Leduc, C., Delattre, M., Mary-Huard, T., Robin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+segmentation+for+analyzing+Hi-C+data.">Two-dimensional segmentation for analyzing Hi-C data.</a> Bioinformatics. 30 (17), i386-i392 (2014).</li><li>Filippova, D., Patro, R., Duggal, G., Kingsford, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+alternative+topological+domains+in+chromatin.">Identification of alternative topological domains in chromatin.</a> Algorithms for molecular biology: AMB. 9 (1), 14 (2014).</li><li>Crane, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensin-driven+remodelling+of+X+chromosome+topology+during+dosage+compensation.">Condensin-driven remodelling of X chromosome topology during dosage compensation.</a> Nature. 523 (7559), 240-244 (2015).</li><li>Durand, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juicebox+Provides+a+Visualization+System+for+Hi-C+Contact+Maps+with+Unlimited+Zoom.">Juicebox Provides a Visualization System for Hi-C Contact Maps with Unlimited Zoom.</a> Cell systems. 3 (1), 99-101 (2016).</li><li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+long-range+genome+interactions+using+the+WashU+Epigenome+Browser.">Exploring long-range genome interactions using the WashU Epigenome Browser.</a> Nature Methods. 10 (5), 375-376 (2013).</li><li>Ram&#237;rez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+TADs+reveal+DNA+sequences+underlying+genome+organization+in+flies.">High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies.</a> bioRxiv. , 115063 (2017).</li><li>Kerpedjiev, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HiGlass:+Web-based+Visual+Comparison+And+Exploration+Of+Genome+Interaction+Maps.">HiGlass: Web-based Visual Comparison And Exploration Of Genome Interaction Maps.</a> bioRxiv. , 121889 (2017).</li><li>Hug, C. B., Grimaldi, A. G., Kruse, K., Vaquerizas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+Architecture+Emerges+during+Zygotic+Genome+Activation+Independent+of+Transcription.">Chromatin Architecture Emerges during Zygotic Genome Activation Independent of Transcription.</a> Cell. 169 (2), (2017).</li><li>Berkum, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C:+a+method+to+study+the+three-dimensional+architecture+of+genomes.">Hi-C: a method to study the three-dimensional architecture of genomes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (39), (2010).</li><li>Naumova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+the+mitotic+chromosome.">Organization of the mitotic chromosome.</a> Science. 342 (6161), 948-953 (2013).</li><li>Denker, A., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+second+decade+of+3C+technologies:+detailed+insights+into+nuclear+organization.">The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization.</a> Genes &amp; development. 30 (12), 1357-1382 (2016).</li><li>Belaghzal, H., Dekker, J., Gibcus, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hi-C+2.0:+An+optimized+Hi-C+procedure+for+high-resolution+genome-wide+mapping+of+chromosome+conformation.">Hi-C 2.0: An optimized Hi-C procedure for high-resolution genome-wide mapping of chromosome conformation.</a> Methods (San Diego, Calif). 123, 56-65 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada sunulan yüksek kaliteli haritalar kromatin mimarisinin erken Drosophila embriyo çok daha etkili kuralıdır. Bir önceki iletişim kuralı34için karşılaştırıldığında, açıklanan yaklaşım burada daha yüksek çözünürlük, daha hızlı işleme ve daha az reaktif kullanımı kaynaklanan bir güncel in situ Hi-C yordamı5, kullanır. Situ Hi-C protokolü de dahil olmak üzere genel yordam çok çeşitli aşamaları ve Drosophilayanı sıra deneysel sistemleri üzerinde çalışmak için bekleniyor. Protokol düşük giriş zorunlu olduğundan, izole hücre popülasyonlarının üzerinde de kullanılabilir. Drosophilaiçinde Aralık dışında embriyo için iletişim kuralını kullanarak, bazı parametreler tarif ederken özellikle malzeme, fiksasyonu ayarlanması etmeniz gerekebilir. Yana son derece geçirimsiz bir manikür büyük embriyo geliştirmek, formaldehit konsantrasyonu yükseltmek ve fiksasyon uzatan uygun olabilir. Embriyo nükleer döngüsü 14 farklı aşamalarında koleksiyonu için 25 ° c adım 1.4 embriyo kuluçka zamanlarında aşağıdaki gibi ayarlanması gerekir: nükleer döngüsü 12, 70 dk; Nükleer döngüsü 13, 90 dk; 3-4 hpf, 3:30 s.
13 göğüs arası bölümler (sahne 1-4), sırasında çekirdek yoğunluğu kabaca her bölümü ile iki katına çıkar. Çekirdeklerin kolayca onların parlak GFP floresans tarafından tespit edilebilir. Mitoz sırasında eGFP-PCNA çekirdeğinde yer ve onun sinyal embriyo dağınık olduğunu. Bu özellik bir zaman uyumlu bölünme bölünme mümkün geçiren tanımlayıcı embriyo yapar. Kromatin mitotik organizasyonu Interphase organizasyon35büyük ölçüde farklı olduğu için Kromatin uyum eğitimi için mitotik Bu embriyolar genellikle, istenmez. Özellikle zaman uyumlu bir mitotik bölünme geçirecek embriyo seçmek için iletişim kuralı uyum sağlamak mümkündür. Bu durumda, eGFP-PCNA dağınık, nükleer olmayan dağılımı ile tek embriyo tutulmalıdır ve diğer embriyo atılmalıdır. Nükleer yoğunluğu tespit edilemez beri sahne embriyo tarafından iletilen ışık mikroskobu izlendi onların morfolojisi için alternatif yöntemler istihdam gerekir. Kutup hücreleri ve hücre çekirdeği embriyo çevre varlığı çevre görünür cellularization nükleer döngüsü 1412gösterir, ancak gösterir embriyo en az nükleer döngüsü 9, tamamladı.
Merhaba C deneyler başarıyla enzimleri5geniş bir seçki kullanılarak gerçekleştirilebilir. Geçerli yaklaşımlar genellikle ya bir 4-base sırası, MboI veya HindIII gibi bir 6-base tanıma sitesi gibi tanımak enzimler kullanılır. 4-base kesiciler avantajı 6-base kesiciler yeterli sıralama derinlik ve kısıtlama sitelerin daha bile kapsama genom verilen yüksek potansiyel çözünürlük sundukları var. Başka bir5,23,36,37bir 4-base kesici seçiminde hiçbir avantaj olduğunu. İki en yaygın olarak kullanılan enzimler, MboI ve DpnII, her ikisi de aynı GATC tanıma sitesi tanıdım. DpnII ilgilendirmiyor DrosophilaCpG metilasyonu daha az duyarlıdır. Burada sunulan protokolü de başarılı bir şekilde DpnII Restriksiyon enzimi kullanılarak tamamlanabilir. 4.2 bölümünde. Restriksiyon enzimi ve tampon DpnII uyumluluk için ayarlanacak üreticinin önerilerini göre var.
Şekil 2Agösterildiği aralığından sıralama kitaplığı parçası boyutunu önemli ölçüde sapma sergiliyor, küme oluşumu sırasında sıralama daha az verimli veya tamamen başarısız. Bu durumda, yamultma sonra boyutu dağıtım kontrol edilmelidir ve parametreleri yamultma buna göre ayarlanır. DNA parçalarının çok küçük dağılımında tepeler (< 100 bp) veya çok büyük (> 1000 bp) boyutları gösterir taşımak örneğin boyut seçimi ile ilgili sorunlar üzerine boncuk veya atılacak beklenen süpernatant. Sık sık bu kütüphanelerin bu istenmeyen büyüklüktedir, hala bir resimde, olan gibi küçük tepeler ile başarıyla verimliliği kümeleme içinde sadece küçük bir düşüş ile sıralı.
Kullanılabilir sıra okuma sayısı büyük ölçüde azalttığı yüksek oranda PCR tekrarından kaçınılmalıdır. PCR çoğaltmaları oranı doğrudan giriş malzeme miktarı ile ilgilidir. Daha fazla giriş'i kullanarak bu nedenle genellikle PCR çoğaltma sorunları azaltır.
Okuma okuma yönelimi nedeniyle (2B rakam) filtre daha yüksek sayılar çok az enzim, çok fazla giriş malzeme veya eksik homojenizasyon embriyoların kullanılması sonucunda olabilir yetersiz sindirim gösterir.

Kromatin conformation yakalama (3C) çekirdeği1kromatin topolojisinin çalışmaya son derece yararlı bir yöntem olarak ortaya çıkmıştır. 3C değişken Hi-C tek deneme2çekirdeğinde ortaya tüm kromatin etkileşimler iletişim frekanslarını ölçmek sağlar. Hi-c uygulama bulma ve kromatin kuruluşun TADs, bölmeleri ve döngüler3,4,5gibi birçok temel ilkeleri karakterizasyonu önemli bir rol oynamıştır.
Kromatin mimarisi, gelişimsel geçişler ve hücre farklılaşması bağlamda çalışmaların giderek gen düzenlemesi sırasında bu işlemleri6,7,8mekanizmaları çözülmeye kullanılır, 9. Drosophila melanogasterolan geliştirme ve genom de karakterizedir, model organizmalar büyük ilgi biridir. Ancak,10,11 Drosophila kromatin mimarisinde vitro doku kültürü ayarları olmuştur dışında araştırmak kaç araştırmalar yapılmıştır. Embriyo 16-18 h sonrası döllenme, TADs ve bölmeleri memelilerde benzer yapıları anımsatan tanımlanan10, hangi yükseltir soru hangi rolü gen düzenlemesi sırasında Drosophila embriyo içinde oynuyorlar vardı geliştirme. Gastrulasyon önce geliştirme, erken evrelerinde özellikle bu tür çalışmalar Teknik olarak zor olan. Gastrulasyon önce Drosophila embriyo 8-60 dk döngüsü12,13başına son derece hızlı bir tempoda devam 13 zaman uyumlu nükleer bölünmeler tabi. Buna ek olarak, farklı aşamaları ayırt etmek için görsel özellikler eksikliği zor yapmak sıkıca aşamalı embriyo malzemesi yeterli miktarda elde etmek.
Kromatin nükleer döngüsü çözünürlükte erken Drosophila gelişiminde Hochschule'a sağlayan bir protokol geliştirmek için biz iki varolan teknikleri kombine: yüksek çözünürlüklü nesil tüm sağlayan in situ Hi-C, Genom kişi haritalar5ve eGFP-PCNA transgene13,14ifade bir transgenik Drosophila satırını kullanarak embriyo evreleme. Bu transgene çekirdeğine Interphase sırasında yerelleştirir ve mitoz sırasında sinsisyal blastoderm yayılır. Bu özelliği kullanarak, kolayca kendi nükleer yoğunluğu tarafından farklı aşamaları ve mitotik embriyo GFP sinyal dağılım tarafından ayırt etmek mümkündür.
Birlikte, bu tekniklerin kromatin olabildiğince az 20 Drosophila embriyo olarak gelen yüksek çözünürlüklü üç boyutlu yapısını eğitim etkinleştirin. Bu iletişim kuralı bir tek nükleer bölümü döngüsü embriyo olasılığını elde etmek için hasat ve Drosophila embriyo sıralama için yönergeler içerir. Daha fazla elde edilen embriyolar in situ Hi-c gerçekleştirmek için nasıl kullanılacağını açıklar Sonuçta bir sonraki nesil sıralama makinelerde sıralama için uygun bir nükleotit kütüphanesidir. Elde edilen sıralama okuma sonra tüm Drosophila genom kapsayan detaylı kromatin etkileşim haritalar işlenebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotin-14-dATP</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>19524016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MboI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0147L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA Polymerase I Klenow Fragment</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0210L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>EL0012</td>
			<td>T4 DNA Ligase Buffer included</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Polymerase</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0203L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlycoBlue</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete Ultra EDTA-free protease inhibitors</td>
			<td>Roche</td>
			<td>5892791001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos for Illumina&#160;(Index Primers Set 1)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7335</td>
			<td>Sequencing Adaptor, Forward (unindexed) PCR primer and Reverse (indexed) PCR primer and USER enzyme used in the Library preparation section are components of this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7645</td>
			<td>End Prep Enzyme Mix, End Prep Reaction Buffer, Ligation Enhancer, Ligation Master Mix and Polymerase Master Mix used in the Library preparation section are components of this kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Covaris S2 AFA System</td>
			<td>Covaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030108051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon cell strainer 100 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td>Embryo collection baskets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37% formaldehyde</td>
			<td>VWR</td>
			<td>437536C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heptane</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>122062.1612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165 FC fluorescent stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M165 FC DFC camera</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal micro pestle</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P985.1</td>
			<td>Used to lyse embryos in step 4.1.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A3832,0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads MyOne Streptavidin C1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>65002</td>
			<td>Streptavidin coated magnetic beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampure XP beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit assay tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eGFP-PCNA flies</td>
			<td>Gift from S. Blythe and E. Wieschaus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hypochlorite 13%</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AC219255000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4975</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffer pH 8.0 (1 M) for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4577</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I8896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A2263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x CutSmart buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>Restriction enzyme buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Nucleotide Mix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11814362001</td>
			<td>Unmodified dCTP, dGTP, dTTP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 0.5M solution for molecular biology</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4892</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate 3M pH 5.2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 Magnet</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>Magnetic stand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Intelli-Mixer RM-2L</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>5729802</td>
			<td>Rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer F1.5</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5384000012</td>
			<td>Mixer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small Embryo Collection Cages</td>
			<td>Flystuff.com</td>
			<td>59-100</td>
			<td>Egg collection cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5424&#160;R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube strips</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>673275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBuffer 2.1</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B7202S</td>
			<td>T4 DNA Polymerase buffer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of genome-wide chromatin conformation capture libraries from tightly staged early drosophila embryos

Kromatin üç boyutlu mimari soruşturma gen düzenlemesi mekanizmalarının içine çok değerli fikir sunar. Burada, kromatin conformation yakalama tekniği in situ Hi-C üzerinde gerçekleştirmek için bir protokol tarif Drosophila melanogaster embriyo nüfus düzenledi. Tek bir deney çekirdeğinde ortaya tüm kromatin etkileşimler eşleme sağlar bir sıralama kitaplığı sonucudur. Embriyo sıralama floresan stereo mikroskop ve nükleer bir işaretçi içeren bir transgenik sinek çizgi kullanarak el ile yapılır. Bu teknik, embriyo nüfus her nükleer bölünme döngüsüne ve tanımlı hücre döngüsü durumundaki kullanarak çok yüksek saflık ile elde edilebilir. İletişim kuralı da gastrulasyon ötesinde Büyük Embriyo sıralamak için adapte olabilir. Sıralanmış embriyo situ için Hi-c girişleri kullanılır Tüm deneyler Kütüphane hazırlık, sıralama dahil olmak üzere, beş gün içinde tamamlanabilir. Protokol düşük giriş gereksinimleri ve güvenilir bir şekilde 20 blastoderm sahne embriyo giriş malzeme olarak kullanarak çalışır. Sonraki nesil sıralaması için bir sıralama kitaplığı sonucudur. Sonra sıralama, veri topolojik etki alanı (TAD) yapısı, kromatin döngüler ve kromatin ilişkilendirme hakkında bilgi elde etmek için çok çeşitli araçlar kullanılarak analiz genom çapında kromatin etkileşim haritalar içine işlenebilir Drosophila geliştirme sırasında bölmeleri.

Embriyo nüfus nükleer döngüsü 12, 13 ve 14 sıralı (1: 30'a karşılık gelen 1:45 ve 2:10 saatleri sonrası döllenme, sırasıyla12) ve iletişim kuralında tanımlanan yordamlara göre belirleme yapılacağı elde edilen 3-4 h sonrası döllenme (hpf). Her sıralanmış embriyo toplu eGFP-PCNA sinyal fotoğraflarını alarak, aşağı akım deneylerde kullanılan her tek embriyo kesin sahne ve hücre döngüsü durumunu belgelemek mümkündür. Örnek resimler sıralanmış nüfus üzerinden embriyo Şekil 1B-Egösterilir. Situ Hi-C iletişim kuralı çıkışını sonraki nesil sıralama makinelerde sıralı hazır bir nükleotit kütüphanesidir. Bu amaçla, en az 2-4 nM son Kütüphane konsantrasyonu genellikle gereklidir. Giriş malzeme önerilen miktarda kullanarak, bu güvenilir bir şekilde bölgedir (Tablo 1)elde.
Boyut seçimi arasında yaklaşık 500 bp bağlı olarak tam yamultma (2A rakam), ve boyut seçimi parametreleri maksimum 300-600 bp sonra DNA parçalarının beklenen boyut dağılımı. Sıralama için genom içinde eşlenemez kısıtlama parçaları sayısını en aza indirmek için en az 75 bp uzunluğu eşleştirilmiş uç okuma öneririz. Yüksek çözünürlüklü haritalar 1 – 2 kb kutusu boyutu ile 400 milyon Okunma elde edilebilir. ~ 150 milyon daha düşük derinlikte birden çok biyolojik çoğaltır sıralama sıralama çok yüksek derinlikte bir tek REPLICATE yerine her okur tavsiye ediyoruz. Bu değerlendirme biyolojik çeşitlilik sağlar ve daha küçük bir numarayla PCR çoğaltma nedeniyle atılan okur yol açar. Görsel temsili için çoğaltır birleştirilebilir. Bir örnek yüksek derinlikte sıralama için taahhütte bulunmadan önce Şekil 2Bolduğu gibi temel Kütüphane kalite parametreleri belirlemek için sığ sıralama (örnek başına bir kaç milyon defa okundu) kullanarak örnekleri çalışan öneririz.
Hi-C veri analizi önemli Hesaplamalı kaynakları ve Biyoinformatik uzmanlık gerektirir. Kaba bir genel olarak eşleştirilmiş okuma bağımsız olarak başvuru genom eşleştirilir, elde edilen hizalamaları kalite ve yönlendirme için filtre uygulanır sonra bir matris kişilerin belirli depo gözü çözünürlük veya parça düzeyinde oluşturulan süzülmüş gelen hizalamaları. İletişim matris daha da aşağı akım Analizi TADs, döngüler ve bölmeleri keşfetmek için temelidir. Sıralama okuma ilk analiz için birkaç Biyoinformatik boru hatları kullanılabilir çok özel Biyoinformatik bilgi18,19, olmadan iletişim matrisler içine ham okuma işleme Etkinleştir 20,21,22,23. Daha fazla çözümleme yapılır nasıl out tam biyolojik soru altında eğitim büyük ölçüde bağlıdır ve programlama ve R veya Python komut dosyası önemli deneyim gerektirebilir. Ancak, mevcut5,24,25,26,27,28gibi yazılım analiz etmek için çeşitli araçlar ve algoritmaları TADs aramak için vardır ve Hi-C veri içinde örümcek ağı kaş ve tek başına masaüstü uygulamaları29,30,31,32olarak keşfedin.
Bir kez işlenir, Kütüphane kalitesi farklı ölçümleri (Şekil 2B) kullanarak belirlenebilir. İlk olarak, aynı özgün molekül doğan sıralı okuma çiftlerinin sayısı olan PCR çoğaltmaları, oranı boşa sıra okuma miktarını sınırlamak mümkün olduğunca düşük olmalıdır. Ancak, kütüphaneleri ile bile > % 40 PCR çoğaltma işleme yüksek kaliteli iletişim haritalar yinelenenleri filtre durumunda. İkinci olarak, yönelimleri, nedeniyle filtre uygulanmış okuma oranı4' te açıklandığı gibi sürekli olarak hizalanmış okuma çiftlerinin % 10 düşük olmalıdır.
Drosophila nükleer döngüsü 12 ve 14 arasında önceden gastrular geliştirme sırasında büyük ölçüde yenilenmiş33 (Şekil 3) nükleer bir mimaridir. Nükleer döngüsü 12, kaç TADs algılanır ve kişilerin genel dağıtım birçok discernable özellikleri olmadan çok düzgün. Bu önemli ölçüde nükleer döngüsü 13 ve 14, TADs giderek daha belirgindir ve belirsiz uzun menzilli kişiler tükenmiş değiştirilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig1.jpg"> Şekil 1: sıralama sırasında eGFP-PCNA embriyo temsilcisi resimleri. (A)eGFP-PCNA sinyal 60 dk toplama ve nükleer döngüsü 12 (B), nükleer embriyo 25 ° C (B-E) örneklerden sıralanmış nüfus itibariyle 2 h kuluçka 13 (C), nükleer döngüsü 14 (döngüsü sonra embriyo sıralanmamış bir popülasyondan D) ve zaman uyumlu mitoz (E) geçiren embriyo. Ölçek çubukları 200 µm. = <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig2.jpg"> Resim 2: in situ Hi-C Kitaplığı kalite ölçümleri örnekleri. DNA parçası boyutları başarılı bir Hi-C Library (kütüphane 1, en iyi) ve parçaları (Library 2, alt) sıralama için çok büyük bir zirve görüntüler bir kitaplıktan dağılımını gösteren(a)Bioanalyzer izlemeler. Kütüphane 2 başarıyla sıralı, ancak daha büyük miktarlarda istenmeyen DNA parçalarının azalan sıralama verimleri için neden olabilir. (B) iki Hi-C Kitaplığı istatistiklerinin filtreleme: görüntülenen okuma yön ve mesafe (içe, dışa doğru)4 veya PCR çoğaltma (yinelenen) nedeniyle daha fazla analiz bırakılır hizalanmış okuma çiftleri sayısıdır. Her barda (kalan) filtre geçen defa okundu ve başarısız (filtre) çizilir. Filtre geçen okuma yüzdesi Ayrıca metin olarak gösterilir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57001/57001fig3.jpg"> Şekil 3: Merhaba-C etkileşim haritaları hazırlanmış embriyolar. Merhaba C etkileşim haritalar 10 kb çözünürlükte binned ve33daha önce açıklandığı gibi dengeli. Kromozom 2 bir bölge gösterilir L. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57001/57001fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Kütüphane</td>
			<td>Sahne</td>
			<td>Embriyo sayısı</td>
			<td>(Ng) kesme önce DNA miktarı</td>
			<td>PCR döngüleri</td>
			<td>Son Kütüphane konsantrasyonu (nM)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>Nükleer döngüsü 12</td>
			<td>71</td>
			<td>46</td>
			<td>12</td>
			<td>28.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>Nükleer döngüsü 12</td>
			<td>46</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>22,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>Nükleer döngüsü 12</td>
			<td>60</td>
			<td>13</td>
			<td>13</td>
			<td>12,3</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>Nükleer döngüsü 13</td>
			<td>36</td>
			<td>39</td>
			<td>12</td>
			<td>22,2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>Nükleer döngüsü 13</td>
			<td>35</td>
			<td>10</td>
			<td>12</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>Nükleer döngüsü 13</td>
			<td>48</td>
			<td>18</td>
			<td>12</td>
			<td>8,7</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>Nükleer döngüsü 14</td>
			<td>33</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>39.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>Nükleer döngüsü 14</td>
			<td>24</td>
			<td>36</td>
			<td>12</td>
			<td>20,4</td>
		</tr>
<tr>
<td>9</td>
			<td>Nükleer döngüsü 14</td>
			<td>14</td>
			<td>8</td>
			<td>12</td>
			<td>4.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>10</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>17</td>
			<td>30</td>
			<td>12</td>
			<td>24.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>11</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>18</td>
			<td>42</td>
			<td>11</td>
			<td>19,1</td>
		</tr>
<tr>
<td>12</td>
			<td>3-4 hpf</td>
			<td>22</td>
			<td>63</td>
			<td>11</td>
			<td>48,4</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: temsilcisi sıralama kitaplığı istatistik listesi. Her kitaplık listesinde, onun üretme, biotin açılan ve qubit'e tarafından ölçülen kesme önce toplam DNA miktarı için kullanılan embriyo sayısı için PCR güçlendirme ve sıralama kitaplığı son konsantrasyonu için kullanılan döngüleri sayısı Arıtma ve boyutu seçimden sonra gösterilir.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos at JoVE.com

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Bu eser bir protokolünü açıklar yüksek çözünürlüklü in situ Hi-C kitaplıklardan nesil sıkıca öncesi gastrulasyon Drosophila melanogaster sahnelenen için embriyo.

Genom çapında kromatin Conformation yakalama kitaplıklardan sıkıca aşamalı erken Drosophila embriyo nesil

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Bu yöntem, kromatin in 3Boyutlu yapısının gen ekspresyonunu ve gelişimini nasıl etkileyebileceği gibi kromatin mimarisi alanındaki anahtar soruların yanıtlatmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı kromatin mimarisinin yüksek çözünürlüklü bir görünüm ve tam olarak sahnelenen sinek embriyoları sağlar. Bu yöntem kromatin organizasyonu ve gelişimi hakkında bilgi sağlasa da, transgenik sinek kütüphanelerinden gelen mevcut hatları kromatin organizasyonundaki etkilerini test etmek için de kullanabilirsiniz.Protokolü başlatmak için, daha önce toplanan embriyoların toplam hacmini PBST ile iki mililitreye ayarlayın. Suda altı mililitre heptane ve 100 mikrolitre %37 formaldehit ekleyin. Formaldehit ekledikten sonra, şiddetle bir dakika boyunca tüp yukarı ve aşağı sallayın.Sulu ve organik faz bir şampuan gibi tutarlılık oluşturmak için birleştirir. Karışımı bir döner mikserde 10 dakika çalkalayın. Tüpün alt kısmında embriyo toplamak için oda sıcaklığında bir dakika için 500 kez g tüpü santrifüj.Tüm şampuan benzeri sıvı aspire ve herhangi bir embriyo aspire değil dikkat alarak, atın. Formaldehit eklenmesinden 15 dakika sonra, 125 milimoler glisin ile PBST beş mililitre embriyolar resuspend. Bir dakika boyunca embriyoları şiddetle aşağı yukarı sallayın.Santrifüjden sonra, supernatant aspire. 1,000 mikrolitrelik pipet kullanarak, 100 embriyodan oluşan bir toplu işlemi sıralamaiçin uygun küçük bir cam kapa aktarın, tercihen koyu bir arka plan üzerine yerleştirin ve buzun üzerine yerleştirin. Bir iğne veya şırınga ucu kullanarak nükleer yoğunluk ve hücre döngüsü durumuna göre sıralamak embriyolar.EGFP PCNA ve kısmen nükleer olmayan GFP sinyali gösteren embriyoların dağınık, nükleer olmayan dağılımlarıyla tanınan tüm mitotik embriyoları çıkarın. Sıralamaya yardımcı olmak için, her bir toplu işlemde 12, 13 ve 14 numaralı nükleer döngülerde referans embriyoları sıraya dizerek embriyoları referans embriyolardan biriyle eşleştirin. 1,000 mikrolitrelik pipet kullanarak istenilen embriyoları yükseltin.Onları taze bir tüpe aktarın ve buza yerleştirin. Planlanan deney için yeterli embriyo sıralanana kadar devam edin. Oda sıcaklığında 100 kez g kısa bir süre tüpler spin.Supernatant çıkarın ve embriyolar donma için mümkün olduğunca kuru olduğundan emin olun. Flaş dondurma embriyolar sıvı azot tüpleri batırarak ve eksi 80 santigrat derece de saklayın. Dondurulmuş embriyolu tüpleri buza yerleştirin.500 mikrolitre buz soğuk lisis tamponundaki embriyoları yeniden askıya alın. Embriyotüp altında yerleşmek için izin vermek için bir dakika bekleyin. Daha sonra, 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne sıkıca sığacak şekilde tasarlanmış buz üzerinde önceden soğutulmuş metal mikro havanele ile embriyoları öğütün.Embriyoların ajitasyonunu önlemek için, tüpün dibine değene kadar zararlımaddeyi yavaşça takın. Aşağı itin ve sonra her iki yönde iki kez pestle döndürerek eziyet. Havaneleri çok hafifçe kaldırın.Tüpün dibine tekrar itin ve taşlama işlemini 10 kez veya embriyolar tamamen lysed olana kadar tekrarlayın. Çözelti homojen olmalı ve embriyoların hiçbir kalıntı büyük parçaları kalmalıdır. Homojenize süspansiyonu 15 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın.1,000 kez g dört santigrat derece beş dakika spin. Supernatant atın ve 500 mikrolitre likis soğuk lysis tampon ve yukarı ve aşağı borulama resuspend tarafından pelet yıkayın. Başka bir spin sonra, supernatant atın.Yıkanmış peleti %0,5 Sodyum Dodecyl Sülfat veya SDS'nin 100 mikrolitresinde yeniden askıya alın. Daha sonra bir ısıtma bloğunda 65 santigrat derece 10 dakika boyunca örnek kuluçka tarafından çekirdekleri geçirin. %10 Triton X100 50 mikrolitre ve 120 mikrolitre su ekleyin.İçeriği karıştırmak için tüpü hafifçe uçurun ve tüpü bir ısı bloğunda 15 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. 10X restriksiyon enzim tampon 25 mikrolitre ve mikrolitre MBO1 başına beş birim 20 birim ekleyin. İçeriği karıştırmak için tüpü hareket ettirin ve DNA'yı sindirmek için tüpü Bir ısı bloğuna yerleştirin.20 adet Daha MBO1 ekleyin. Kuluçkaya 90 dakika devam edin. İkinci 90 dakikalık kuluçkadan sonra, mbo1'i etkisiz katmak için numuneyi 62 derecede 20 dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra, 0.4 milimolar biotin 14-dATP 18 mikrolitre, değiştirilmemiş bir 3.3 milimolar dCTP-dGTP-dTTP karışımı 2.25 mikrolitre ve mikrolitre DNA polimeraz I Klenow parçası başına beş birim sekiz mikrolitre ekleyin. İçeriği karıştırmak için tüpü hafifçe vurun ve numuneyi 90 dakika boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Sonra, su 657 mikrolitre ekleyin, 10X T4 DNA ligaz tampon 120 mikrolitre, 100 mikrolitre 100 mikrolitre 10% Triton X100, mililitre başına 20 miligram altı mikrolitre sığır serum albumin, ve son olarak mikrolitre Başına beş mikrolitre T4 DNA ligaz.Daha sonra, iki saat oda sıcaklığında 20 RPM yavaşça tüp döndürün. Mikrolitre Başına beş birim lik başka bir beş mikrolitre daha ekleyin T4 DNA ligaz. İki saat daha dönmeye devam edin, ardından çekirdekleri 2,500 kez beş dakika boyunca aşağı doğru döndürün.Santrifüjden sonra, supernatant atın. Ekstraksiyon tampon 500 mikrolitre pelet resuspend ve mililitre proteinaz K.Flick tüp başına 20 mililitre 20 mikrolitre ekleyin ve protein sindirmek için tüp inkübün. De-crosslink için beş azı lı sodyum klorür ve tüpuv bir gecede 130 mikrolitre ekleyin.Ertesi gün, pipet düşük DNA bağlama özellikleri ile yeni bir iki mililitretüp içine örnek. Üç azı lı sodyum asetat ve mililitre GlikoBlue başına 15 miligram iki mikrolitre 0.1X hacim ekleyin. 1,6 cilt saf mutlak etanol ekleyin ve içeriğini tersine çevirin, ardından numuneyi eksi 80 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın.Kuluçkadan sonra, içindekileri santrifüj edin. Sadece GlycoBlue tarafından tespit edilebilir DNA pelet bulun. Pipet ucunu DNA peletinden karşı duvar boyunca tüpe taşıyarak supernatant'ı dikkatlice çıkarın.Peleti %70 etanolün 800 mikrolitresiyle yıkayın. Beş dakika oda sıcaklığında 20,000 kez g olarak ters çevirerek ve santrifüj tarafından karıştırın. Bu adımda kalan damlacıkları çıkarın ve aşağıdaki bir P10 ucu ile tüpler dışarı iterek yıkar, sonra beş dakika kadar kuru hava kapağı nı açın.Sıvı kaldıktan sonra, 10 milimolar tris klorür 50 mikrolitre ekleyin. Tekrar tekrar pelet DNA'yı yatıştırmak için bulunduğu alan üzerinde çözüm pipet. Tüpü hareket ettirerek mililitre RNase A.Mix başına 20 miligram lık bir mikrolitre ekleyin.RNA'yı sindirmek için numuneyi 37 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın. Son olarak, kütüphane hazırlanmasıkadar dondurucu veya buzdolabında örnek saklayın. Her sıralanmış embriyo toplu EGFP PCNA sinyal görüntüleri downstream deneyler için her bir embriyo nun kesin sahne ve hücre döngüsü durumlarını ortaya koymaktadır.Biyoanalizör izleri, boyut seçiminden sonra DNA parçalarının boyut dağılımının 300 ila 700 baz çifti arasında olduğunu ve maksimum 450 baz çiftinin olduğunu göstermektedir. Hi-C etkileşim haritaları, nükleer döngü 12'de, az sayıda Topolojik İlişkili Etki Alanı veya TAD'nin tespit edildiğine ve taD'lerin giderek daha belirgin hale geldiğinde ve belirsiz uzun menzilli temaslar tükendiğinde 13 ve 14'lü nükleer döngülerde önemli ölçüde değişiklikler tespit edildiğini göstermektedir. Bu prosedürü çalışırken, boncukları iyice yıkamayı ve düşük kaliteli Hi-C kütüphanelerine yol açabileceğinden, özellikle yüksek sıcaklıklarda kuluçka sürelerini gereksiz yere uzatmamayı unutmamak önemlidir.Doğru evreleme ve yüksek çözünürlüklü kromatin onay haritalama birleştiren bu teknik, epigenetik alanında araştırmacılar ın in vivo gelişim ortamında üç boyutlu kromatin organizasyonunun rolünü keşfetmelerinin önünü açmıştır.

Research

JoVE Journal

Genetics

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

DNA İçerik Ölçüm tarafından Memeli Çoğaltma Zamanlama genom Tayini

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Nucleosome yoğunluk analiz için kitaplıklarına sıralama yerli Kromatin Immunoprecipitation nesil

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Mapping Genome-wide Accessible Chromatin in Primary Human T Lymphocytes by ATAC-Seq

Birincil insan T lenfositler tarafından ataç-Seq genom genelinde erişilebilir Kromatin eşleme

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high-throughput sequencing (ATAC-seq) is a method used for the identification of open (accessible) regions ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Kromatin döngü yapısı yeniden yapılanma CRISPR-aracılı

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Ökaryotlarda transkripsiyon hataları genom çapında gözetim

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture (4C)

Identification of Enhancer-Promoter Contacts in Embryoid Bodies by Quantitative Chromosome Conformation Capture 4C

Kantitatif Kromozom Konformasyon Yakalama (4C) ile Embriyoid Cisimlerde Arttırıcı-Organizatör Kontalarının Belirlenmesi

During mammalian development, cell fates are determined through the establishment of regulatory networks that define the specificity, timing, and spatial ...

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

Magnaporthe oryzae'de Kromatin İmmün Önkapipitasyon Dizileme Yöntemi Kullanılarak Histone Modifikasyonlarının Genom Çapında Analizi

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

Chromosome Conformation Capture (3C) for Undergraduate Research and Teaching

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates

Getting an A with the 3Cs: Chromosome Conformation Capture for Undergraduates (Video) | JoVE 

3C'lerle A Almak: Lisans Öğrencileri için Kromozom Konformasyon Yakalama

Chromosome conformation capture (3C) is a powerful tool that has spawned a family of similar techniques (e.g., Hi-C, 4C, and 5C, referred to here as 3C ...