Name: isolation and characterization of tumor-initiating cells from sarcoma patient-derived xenografts
Uploaded: 2019-06-13T12:30:00
Duration: 7 min 18 s
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इस शोध NCI-P01-CA087497 द्वारा समर्थित किया गया था (C.C.-C करने के लिए. और डी.एच.) और NIH-U 54-0OD020353 (C.C.-C., D.H., और J.D.-D.), एगिलेंट सोचा नेता पुरस्कार (सी.सी.-सी. को), और Martel फाउंडेशन (सी.सी.-सी. और जे.डी.-डी.)

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लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

मानव सार्कोमा से ट्यूमर शुरू करने वाली कोशिकाओं को अलग करने और उनकी विशेषता के लिए इस प्रोटोकॉल की सफलता को सीमित करने वाले कई महत्वपूर्ण कदम हैं। मानव सार्कोमा में कई अलग-अलग उपप्रकार शामिल हैं। हमने देखा कि पीडीएक्स का गठन सार्कोमा उपप्रकारों पर अत्यधिक निर्भर है। नैदानिक आक्रामक सार्कोमा एक हिस्टोलॉजिकल रूप से अलग-अलग फीनोटाइप के साथ (जैसे, प्लेमॉर्फिक अपृथक्करणीय सार्कोमा [सफलता दर 100%, n ] 2], अलग-अलग liposarcomas [सफलता दर 100%, n ] 2], और synovial सार्कोमा ] सफलता दर 100%, n [ 3]) PDX गठन की एक उच्च सफलता दर है. इस बीच, विभेदित phenotypes के साथ सार्कोमा (जैसे, अच्छी तरह से अलग liposarcomas [सफलता दर 0%, n ] 3]) कम PDX गठन दर दिखा. यह संभव है कि ट्यूमर शुरू करने वाली कोशिकाएं कम घातक, विभेदित उपप्रकारों की तुलना में अधिक प्रतिशत पर अधिक घातक उपप्रकारों में मौजूद हों। इसके अलावा, हम सेल व्यवहार्यता के किसी भी नुकसान को कम करने के लिए किसी भी रोक के बिना एक दिन के भीतर ट्यूमर शुरू सेल अलगाव प्रक्रिया खत्म करने की सलाह देते हैं।
हमने पहचान की है कि मानव सार्कोमा में एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाएं व्यापक रूप से मौजूद हैं। लेकिन HLA-1-नकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत विभिन्न रोगियों से नमूनों के बीच भिन्न हो सकते हैं. इस विधि से, हमने सफलतापूर्वक ट्यूमर शुरू करने वाली कोशिकाओं को उन नमूनों से अलग कर दिया है जिनमें एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाएं हैं जो 0.5% से अधिक 30%12तक होती हैं। अलग HLA-1-नकारात्मक कोशिकाओं के ट्यूमर शुरू सेल पहचान की पुष्टि करने के लिए क्षेत्र गठन और ट्यूमर गठन assays द्वारा कार्यात्मक HLA-1-नकारात्मक कोशिकाओं की विशेषता के लिए महत्वपूर्ण है।
हालांकि, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल भी सीमाएं हैं। पिछले डेटा से पता चला है कि HLA-1 अभिव्यक्ति epigeneticly विनियमित है, जो एक ही ट्यूमर12के भीतर HLA-1 अभिव्यक्ति के सेलुलर विषमता के अवलोकन के साथ संगत है. एचएलए-1 जीनोमिक उत्परिवर्तनों का पता सार्कोमा और अन्य कैंसर प्रकारों में पाया गया। HLA-1 जीन में उत्परिवर्तन पूरे ट्यूमर में सेल सतह पर HLA-1 का पूरा नुकसान करने के लिए या nonfunctional उत्परिवर्तित HLA-1 व्यक्त करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. किसी भी मामले में, एचएलए-1 नकारात्मकता का उपयोग ट्यूमर के भीतर टीआईसी की पहचान करने के लिए नहीं किया जा सकता है।
एक नकारात्मक मार्कर के रूप में HLA-1 का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक मानव सार्कोमा subtypes की एक किस्म से TICs अलग है और कार्यात्मक विश्लेषण द्वारा हमारे परिणामों को मान्य. इस प्रकार, हम इन TICs को लक्षित विशिष्ट उपचार विकसित करने के लिए, TICs पर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण सहित आणविक अध्ययन करने में सक्षम थे.

मानव कैंसर के इंट्राट्यूमरल सेलुलर विषमता को पिछले दशक1के दौरान साक्ष्य में वृद्धि करके सहायता प्रदान की गई है . सामान्य ऊतक के समान, कैंसर के ऊतकों में TICs (जिसे कैंसर स्टेम सेल भी कहा जाता है) की एक छोटी सी उपजनसंख्या होती है, जो ट्यूमर बनाने की क्षमता प्रदर्शित करती है; इस बीच, कैंसर कोशिकाओं के थोक विभेदित phenotypes2प्रदर्शन. इन TICs स्टेम सेल की तरह गुण दिखाने के लिए, एक स्टेम सेल मार्कर की अभिव्यक्ति और दोनों आत्म-नवीकरण और असममित सेल विभाजन की क्षमता सहित, और इस प्रकार, एक सेलुलर विषम ट्यूमर3के गठन आरंभ कर सकते हैं. हाल के अध्ययनों से पता चला है कि टीआईसी न केवल ट्यूमर दीक्षा के लिए जिम्मेदार हैं बल्कि ट्यूमर आक्रामकता4, मेटास्टेसिस5, और दवा प्रतिरोध6के साथ भी जुड़े हुए हैं . इसलिए, यह TICs के जीव विज्ञान को समझने के लिए महत्वपूर्ण है और, इस प्रकार, इन TICs को लक्षित एक विशिष्ट उपचार रणनीति विकसित.
FACS-आधारित विधियों का उपयोग TICs मार्करका उपयोग करके TICs की पहचान करने के लिए किया गया है, जिसमें CD133, CD24 और CD441शामिल हैं। इनमें से अधिकांश मार्कर सामान्य स्टेम कोशिकाओं7में भी व्यक्त किए जाते हैं . हालांकि, इन मार्करों में से कोई भी केवल TICs निशान. TICs की द्रोह में इन अणुओं की भूमिकाएँ अभी भी स्पष्ट नहीं हैं। उदाहरण के लिए, CD133 डीएनए मिथाइलेशन द्वारा अक्सर निष्क्रिय किया जा सकता है, और इस प्रकार, इस intertumoral विषमता इन मार्करों8की सटीकता प्रदान कर सकते हैं. ALDH1 एक मार्कर है कि भी TICs9के स्टेमनेस बनाए रखने के लिए कार्य करता है. यह स्तन कैंसर TICs की पहचान करने में अधिक प्रभावी लगता है, लेकिन अभी भी अन्य ट्यूमर प्रकार9में संदिग्ध है . कुछ संकेतन रास्ते स्टेम सेल जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, Wnt (wingless से संबंधित एकीकरण साइट), TGF-जेड (परिवर्तन विकास कारक बीटा), और हेजहॉग1सहित. लेकिन यह साबित करना मुश्किल है कि इन रास्ते टीआईसी-विशिष्ट हैं और प्राथमिक ट्यूमर से TICs को अलग करने के लिए इन रास्ते की गतिविधि का उपयोग करें। इस प्रकार, एक विश्वसनीय उपन्यास टीसी मार्कर तत्काल जरूरत है.
मानव MHC वर्ग मैं, भी HLA-1 कहा जाता है, एक सेल सतह प्रोटीन लगभग सभी नाभिकीय कोशिकाओं में व्यक्त10है. एचएलए-1 एक प्रतिजन के रूप में कार्य करता है जो एक अणु पेश करता है जिसे विशेष रूप से CD8 T कोशिकाओं10द्वारा मान्यता प्राप्त है। सीडी 8 टी कोशिकाओं के cytotoxic प्रभाव सक्रिय किया जा सकता है जब कैंसर की कोशिकाओं HLA-1 द्वारा एक ट्यूमर प्रतिजन मौजूद. इसलिए, कैंसर कोशिकाओं की कोशिका सतह पर HLA-1 की कमी साइटोटॉक्सिक सीडी 8 टी कोशिकाओं से प्रतिरक्षा से बचने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। एचएलए-1 के डाउनरेगुलेशन को विभिन्न प्रकार के मानव कैंसर में वर्णित किया गया है और यह खराब पूर्वानुमान, मेटास्टेसिस और दवा प्रतिरोध11के साथ सहसंबद्ध है। हमने दिखाया है कि कोशिका की सतह पर एचएलए-1 अभिव्यक्ति के नुकसान का उपयोग सार्कोमा में टीआईसी की पहचान करने के साथ-साथ प्रोस्टेट कैंसर6,12में किया जा सकता है।
यहाँ, हम एक नकारात्मक मार्कर के रूप में HLA-1 का उपयोग कर, और आगे मान्य और इन HLA-1-नकारात्मक TICs की विशेषता के लिए, FACS द्वारा मानव सार्कोमा PDXs से TICs को अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:708px;" width="708">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:300px;">0.2 &#956;m cell culture filter</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">450-0020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">100 mm Petri dish</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">35 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">50 mL polystyrene tube</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">96-well ultra-low attachment cell culture plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Alizarin Red S&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">B-27</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">08-0085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">bFGF</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">PHG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">dexamethasone</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">EGF</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">HLA-1-PE antibody&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Abcam</td>
			<td>ab43545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">hMSC growth medium</td>
			<td style="width:123px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">PCS-500-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">indomethacin</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">isobutylmethylxanthine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">isopropanol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:300px;">Isotype Control Antibody</td>
			<td style="width:123px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab103534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">L-ascorbic acid&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">lithium chloride&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">62476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Matrigel basement membrane matrix&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:300px;">MEM Alpha</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">N2</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">NSG mice</td>
			<td style="width:123px;">The Jackson Lab</td>
			<td style="width:119px;">005557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Oil Red O&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">PBS</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:300px;">Syringe with needle</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">&#946;-glycerophosphate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of tumor-initiating cells from sarcoma patient-derived xenografts

ट्यूमर शुरू कोशिकाओं (TICs) के अस्तित्व और महत्व पिछले एक दशक के दौरान सबूत बढ़ाने के द्वारा समर्थित किया गया है. इन TICs ट्यूमर दीक्षा, मेटास्टेसिस, और दवा प्रतिरोध के लिए जिम्मेदार होना दिखाया गया है. इसलिए, वर्तमान रसायन चिकित्सा रणनीतियों के अलावा विशिष्ट टीआईसी-लक्ष्यीकरण चिकित्सा विकसित करना महत्वपूर्ण है, जो ज्यादातर गैर-टीआईसी के थोक पर ध्यान केंद्रित करते हैं। आदेश में आगे TICs की द्रोह के पीछे तंत्र को समझने के लिए, हम एक विधि को अलग करने के लिए और मानव सार्क में TICs की विशेषता का वर्णन. इसमें, हम मानव सार्कोमा के रोगी व्युत्पन्न xenografts (PDXs) उत्पन्न करने के लिए और एक नकारात्मक मार्कर के रूप में मानव ल्यूकोसाइट प्रतिजन वर्ग मैं (HLA-1) का उपयोग कर फ्लोरोसेंट-सक्रिय सेल छँटाई (FACS) द्वारा TICs को अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल दिखा। इसके अलावा, हम वर्णन कैसे कार्यात्मक इन TICs की विशेषता के लिए, एक क्षेत्र के गठन परख और एक ट्यूमर गठन परख सहित, और mesenchymal रास्ते के साथ भेदभाव प्रेरित करने के लिए. अलगाव और PDX TICs की विशेषता संभावित लक्ष्यीकरण चिकित्सा अभिकर्मकों की खोज के लिए सुराग प्रदान करते हैं. इसके अलावा, बढ़ते सबूत पता चलता है कि इस प्रोटोकॉल को और अधिक अलग करने के लिए बढ़ाया जा सकता है और मानव कैंसर के अन्य प्रकार से TICs की विशेषता.

एक मानव सार्कोमा PDX उत्पन्न और दाग था. इंट्राट्यूमरल विषमजनता एचएलए-1 एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री द्वारा दिखाया गया था। एक्सोग्रेफ्ट में दो अलग-अलग उप-जनसंख्याएं शामिल हैं , नामत एचएलए-1 धनात्मक और नकारात्मक (चित्र 1क)12. सार्कोमा पीडीएक्स ने माता-पिता के प्राथमिक ट्यूमर के साथ हिस्टोलॉजिकल समानताएं दिखाईं (चित्र 1क) . Sarcoma PDX TICs FACS द्वारा अलग किया गया. दोहरी छँटाई विधि का उपयोग करते हुए एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाओं को पैतृक कोशिका जनसंख्या से अत्यधिक समृद्ध किया गया (चित्र 1ख)12.
स्टेम कोशिकाओं में व्यक्त जीन (उदाहरण के लिए, Oct4, Nanog, और Myc) अत्यधिक अलग HLA-1-नकारात्मक कोशिकाओं में व्यक्त किया जा करने के लिए जब उनके HLA-1 सकारात्मक समकक्ष की तुलना में पाया गया (चित्र 1C). Sox-9, एक विकासात्मक जीन अन्य कैंसर स्टेम कोशिकाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने की सूचना दी, जैसे स्तन कार्सिनोमा में, विशेष रूप से HLA-1-नकारात्मक कोशिकाओं में व्यक्त किए गए (चित्र 1D).
अलग HLA-1-नकारात्मक subpopulation को मान्य करने के लिए, एक sarcosphere गठन परख कोशिकाओं के आत्म नवीनीकरण क्षमता की जांच करने के लिए किया गया था. एचएलए-1-ऋणात्मक कोशिकाएं 10 कोशिकाओं के प्रारंभिक निवेश के साथ गोले बनाने में सक्षम थीं (चित्र 1ई)12. ट्यूमर बनाने की क्षमता की जांच करने के लिए, एक सीरियल-डिल्यूशन ट्यूमर-निर्माण परख किया गया था। एचएलए-1-नकारात्मक और -सकारात्मक कोशिकाओं की एक ही संख्या एक ही माउस के प्रत्येक पार्श्व में subcutaneously इंजेक्शन थे. एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाओं ने काफी अधिक ट्यूमर निर्माण क्षमता दिखाई (चित्र 1 एफ)12, जबकि एचएलए-1-नकारात्मक और सकारात्मक उपजनसंख्या दोनों द्वारा बनाई गई एक्सोग्रैफ्ट्स सेलुलर विषमतापूर्ण ट्यूमर थे (चित्र 1 एच) ।
हमने पृथक एचएलए-1-नकारात्मक TICs12का जीन व्यंजक विश्लेषण किया। सामान्य मेसेन्काइमल कोशिका विभेद से जुड़े जीनों को टिसीएस12में ऊंचा किया गया . इस प्रकार, हम भी परीक्षण किया है कि क्या HLA-1 TICs टर्मिनल भेदभाव करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है और एक कम ट्यूमर गठन की क्षमता में परिणाम. परिणामों से पता चला है कि HLA-1-नकारात्मक कोशिकाओं दोनों lipogenic और ऑस्टियोजेनिक रास्ते के साथ अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है और मजबूत तेल लाल ओ और Alizarin लाल एस धुंधला दिखाने के लिए (चित्र 1 जी). इसके विपरीत, HLA-1-सकारात्मक कोशिकाओं को एक ही परिस्थितियों में अंतर नहीं है. इस प्रकार, इन परिणामों को एक आशाजनक विभेदित चिकित्सा रणनीति है कि सार्कोमा TICs लक्ष्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है संकेत मिलता है.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig1.jpg"> चित्रा 1: एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाओं का अंत:ट्यूमरीय विषम सार्कोमा पीडीएक्स से अलगाव। (ए) एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाएं (एरो) इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) द्वारा मानव सार्कोमा के विभिन्न उपप्रकारों में पाई गई थीं। (क और ख) साफ सेल सार्कोमा. (ग और घ) प्लीमोमॉर्फिक लिपोसरकोमा। (ई और च) लेयोमियोसरकोमा। (जी और ज) घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर. (मैं और जम्मू) Liposarcoma, अन्यथा निर्दिष्ट नहीं. (के और एल) विभेदित लिपोसरकोमा। स्केल बार - 100 डिग्री मीटर (बी) सार्कोमा PDXs histologically माता पिता के ट्यूमर के समान थे (hematoxylin और eosin [एच एंड ई] दाग) और IHC द्वारा HLA-1 अभिव्यक्ति में सेलुलर विषमता से पता चला. यहाँ एक स्पष्ट सेल सार्कोमा (सीसीएस), एक अलग-अलग कोन्ड्रोसार्कोमा (डीसीएस), और एक अलग liposarcoma (DDL) सहित सार्कोमा PDXs के प्रतिनिधि चित्र दिखाए जाते हैं। स्केल बार - 100 डिग्री मी. (ग) एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाओं की उपजनसंख्या को द्वि-वर्ग विधि के साथ प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा अलग किया गया था। ऊपर से नीचे तक: पहला सॉर्ट, दूसरा सॉर्ट, और शुद्धता की जांच। अलग HLA-1-नकारात्मक और HLA-1-सकारात्मक कोशिकाओं एक बाद कार्यात्मक विश्लेषण के अधीन थे, एक ट्यूमर गठन परख सहित. इस आंकड़े के परिणाम पिछले प्रकाशन12से हैं. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig2.jpg"> चित्र 2: कार्यात्मक परख द्वारा HLA-1-नकारात्मक TICs की विशेषता. (क) एक गोले के निर्माण परख से पता चला कि लगभग 10 एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाएं सार्कोमा गोलों को बनाने में सक्षम थीं। बाएँ: सार्कोमा क्षेत्रों के प्रतिनिधि चित्र. सही: क्षेत्र बनाने आवृत्ति; मतलब - एसडी स्केल बार $ 100 डिग्री मी. (बी) एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाओं को सार्कोमा पीडीएक्स से अलग अत्यधिक ट्यूमरीजनिक थे। यहाँ दिखाया HLA-1-नकारात्मक और DDL से सकारात्मक कोशिकाओं द्वारा गठित ट्यूमर के प्रतिनिधि तस्वीरें हैं. एचएलए-1-नकारात्मक और एचएलए-1-सकारात्मक डीएल कोशिकाओं के एक हजार कोशिकाओं को एक ही माउस के अलग-अलग पार्श्वों में इंजेक्ट किया गया था। (ग) एचएलए-1-सकारात्मक कोशिकाओं की तुलना में एचएलए-1-नकारात्मक कोशिकाओं में स्टेम सेल जीनों के एम आर ए स्तर अक्टूबर4, नानोगऔर माइक को उच्च स्तर पर व्यक्त किया गया था। ये आंकड़े इस बात का प्रतिनिधित्व करते हैं कि एसडी (द र् 5)। (घ) तेल लाल ओ और अलीजारिन रेड एस का मजबूत सकारात्मक दाग लिपोजेनिक और ऑस्टियोजेनिक पथों के साथ एक टर्मिनल विभेद दर्शाता है जो सार्कोमा टिक्स से प्रेरित होते हैं। (ई) एचएलए-1 एचएलए-1-सकारात्मक (बाएं) और -नकारात्मक (दाएं) उप-जनसंख्या द्वारा निर्मित पीडीएक्स का इम्यूनोस्टेनिंग। स्केल बार ] 100 डिग्री मी. इस आंकड़े के परिणाम पिछले प्रकाशन12से हैं. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

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Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

हम एक नकारात्मक मार्कर के रूप में मानव ल्यूकोसाइट प्रतिजन-1 (HLA-1) का उपयोग कर, फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई द्वारा मानव सार्कोमा रोगी व्युत्पन्न xenografts से ट्यूमर शुरू कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन, और आगे सत्यापन के लिए और इन HLA-1-नकारात्मक ट्यूमर शुरू कोशिकाओं की विशेषता.

अलगाव और सरकोमा रोगी व्युत्पन्न Xenografts से ट्यूमर शुरू कोशिकाओं की विशेषता

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

हमें पता चला कि एचएलए-1 कैंसर कोशिकाओं की एक उपआबादी में विनियमित नीचे है जो स्टेम सेल गुणों और ट्यूमर-शुरू करने की क्षमता का प्रदर्शन करता है। एचएलए-आई डाउनरेगुलेशन सीधे प्रतिरक्षा भागने से संबंधित है, कैंसर स्टेम कोशिकाओं के लिए अस्तित्व के लाभ प्रदान करता है, इसलिए एचएलए-I नकारात्मकता को इन कोशिकाओं के लिए एक सटीक कार्यात्मक मार्कर बना रहा है। प्रक्रिया का प्रदर्शन Sudeh Izadmehr, हमारी प्रयोगशाला से एक postdoc होगा ।नमूने के अधिग्रहण पर, ऊतक को एक निष्फल जैव सुरक्षा कैबिनेट में 100 मिलीमीटर पेट्री डिश में रखें, और डिश में बाँझ पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें। ऊतक को छोटे टुकड़ों में यांत्रिक रूप से त्रिकोणीय बनाने के लिए बाँझ स्केलपेल का उपयोग करें जब तक कि कोई टुकड़ा 0.1 मिलीमीटर से बड़ा न हो जाए। 35-माइक्रोमीटर पोर सेल छलनी के माध्यम से पीबीएस की पूरी 500-माइक्रोलीटर मात्रा को 50 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें।ऊतक के टुकड़ों में पीबीएस के एक और 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, और ऊतकों को फिर से कीमा लें। फिर एक ही संग्रह ट्यूब में सेल छलनी के माध्यम से सुपरनेट को फ़िल्टर करें, और नमूना पूरी तरह से अलग होने तक ऊतक के टुकड़ों को कीमा बनाना जारी रखें। जब कोशिकाओं की अंतिम मात्रा एकत्र की गई है, तो ट्यूमर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र द्वारा स्पिन करें, और हीमोलिसिस बफर के पांच मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।कमरे के तापमान पर पांच मिनट के बाद, एक और अपकेंद्रित्र के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा, और PBS के एक और पांच मिलीलीटर के साथ गोली धोने । पीबीएस के एक मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें, और व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें। कोशिकाओं को बर्फ पर पीबीएस एकाग्रता के 200 माइक्रोलीटर प्रति सातवीं कोशिकाओं के लिए एक बार 10 से पतला करें, और कोमल मिश्रण के साथ कोशिकाओं में बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।फिर सेल निलंबन-तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स को एक NOD scid गामा माउस के पार्श्व में चमड़े के इंजेक्शन, और इंजेक्शन साइट पर ट्यूमर के विकास की जांच दो बार एक सप्ताह । जब ट्यूमर व्यास में एक सेंटीमीटर तक पहुंचता है, तो ट्यूमर को आधे में काट लें, और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए रात भर 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ ज़ेनोबेड़ा के आधे हिस्से को ठीक करें। ट्यूमर की दूसरी छमाही की प्रक्रिया के रूप में सिर्फ एक सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया है, और पीबीएस के मिलीलीटर प्रति छह कोशिकाओं के लिए एक दो बार 10 के लिए कोशिकाओं को पतला 5% FBS एकाग्रता के साथ पूरक ।एक आइसोटाइप नियंत्रण और एक एंटीबॉडी ट्यूब के बीच सेल निलंबन को विभाजित करने से पहले 30 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को बनाए रखें। प्रत्येक ट्यूब में कोशिकाओं की संख्या पर ध्यान दें, और एंटी-एचएलए एंटीबॉडी के साथ एंटीबॉडी ट्यूब में कोशिकाओं और आइसोटाइप कंट्रोल ट्यूब में कोशिकाओं को बर्फ पर 90 मिनट के इनक्यूबेशन के लिए उपयुक्त एंटी-आइसोटाइप कंट्रोल एंटीबॉडी के साथ मिलाएं। इनक्यूबेशन के अंत में, अपकेंद्रित्र द्वारा दोनों सेल आबादी को इकट्ठा करें, इसके बाद दो 10-मिलीलीटर पीबीएस अपकेंद्रित्र द्वारा धोता है।दूसरे धोने के बाद, DAPI के 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर में छर्रों को फिर से निलंबित करें एक बार 10 मिलीलीटर एकाग्रता प्रति सात कोशिकाओं को। फिर प्रत्येक सेल निलंबन को 35-माइक्रोमीटर पोर छलनी के माध्यम से व्यक्तिगत 12-बाय-75 मिलीमीटर पॉलीस्टीरिन ट्यूबों में फ़िल्टर करें। फ्लोरेसेंस-सक्रिय सेल छंटाई के बाद, एचएलए-आई-निगेटिव और पॉजिटिव सेल आबादी को एक बार 10 से घटाकर सरकॉस्पर विकास माध्यम प्रति सबसेट के 15 मिलीलीटर में पांचवीं सेल सांद्रता के लिए ।कोशिकाओं को क्रमिक रूप से एक बार 10 से चौथे, 10 से तीसरे, और 10 को दूसरी सांद्रता के लिए ताजा सारकोस्फीयर विकास माध्यम प्रति कमजोर पड़ने के 15 मिलीलीटर में कमजोर पड़ने के लिए, और प्रत्येक कमजोर पड़ने से कोशिकाओं के १०० माइक्रोलीटर जोड़ें प्रत्येक कुएं में एक ९६-अच्छी तरह से अल्ट्रा-लो अटैचमेंट सेल कल्चर प्लेट प्रति कमजोर पड़ने । प्लेटों को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाइऑक्साइड सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें, प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रतिदिन सारकोस्फीयर गठन की निगरानी करें और हर तीन दिनों में माध्यम को बदले बिना प्रत्येक कुएं में ताजा बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक और एपिडर्मल विकास कारक जोड़ें। तीन सप्ताह के बाद, एक Poisson संभावना वितरण के आधार पर क्षेत्र बनाने सेल आवृत्ति की गणना की अनुमति देने के लिए दोनों HLA-I-नकारात्मक और एचएलए-I-सकारात्मक कोशिकाओं के प्रत्येक कोशिका कमजोर पड़ने के लिए सरकोस्फीयर-पॉजिटिव और सरसोस्पायर-नकारात्मक कुओं की संख्या गिनें ।आमतौर पर, मानव रोगी-व्युत्पन्न सारकोमा ज़ेनोग्राफ्ट दो अलग-अलग एचएलए-आई-पॉजिटिव और नकारात्मक आबादी से मिलकर बनता है, जिसमें माता-पिता के प्राथमिक ट्यूमर द्वारा प्रदर्शित समान हिस्टोलॉजी होता है। फ्लोरेसेंस-सक्रिय कोशिका छंटाई सारकोमा रोगी-व्युत्पन्न xenograft ट्यूमर की शुरुआत कोशिकाओं के रूप में प्रदर्शन माता पिता की कोशिका आबादी से एचएलए-I-नकारात्मक कोशिकाओं की एक उच्च संख्या के संवर्धन की सुविधा । एचएलए-आई-नकारात्मक कोशिकाएं 10 कोशिकाओं के प्रारंभिक इनपुट के साथ क्षेत्र बनाने में सक्षम हैं और एचएलए-आई-पॉजिटिव सारकोमा रोगी की तुलना में उच्च ट्यूमर गठन की क्षमता प्रदर्शित करती हैं।एचएलए-1 नकारात्मक और सकारात्मक कोशिकाओं की एक ही संख्या का इंजेक्शन एक ही माउस के विरोध में नीचे से दर्शाता है कि एचएलए-I-नकारात्मक कोशिकाओं में काफी अधिक ट्यूमर गठन की क्षमता होती है। जबकि एचएलए-1 नकारात्मक और सकारात्मक उपआबादी दोनों द्वारा गठित ज़ेनोग्राफ़ सेलुलर विषम ट्यूमर हैं। इसके अलावा, ट्यूमर शुरू करने वाली कोशिकाओं के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चलता है कि एचएलए-आई-निगेटिव कोशिकाएं स्टेम सेल विभेदन मार्कर व्यक्त करती हैं और उन्हें लिपिजेनिक और ऑस्टियोजेनिक दोनों रास्तों के साथ अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है, जो मजबूत तेल-लाल-ओ और अलीजारिन-रेड-एस धुंधला और संस्कृति का प्रदर्शन करते हैं ।इस विधि का उपयोग विभिन्न मानव कैंसर में कैंसर स्टेम कोशिकाओं को अलग करने के लिए किया जा सकता है। आणविक कार्बोनेशन, उदाहरण के लिए, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण से कोशिकाओं को चिकित्सीय रूप से लक्षित करने के लिए सामान्य मार्कर प्रकट हो सकते हैं। हमारी खोज दर्शाता है कि एचएलए-1 की बहाली कार्यात्मक इकाई प्रतिरक्षा सेल वृद्धि रणनीतियों की सफलता के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है।

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस अध्ययन के लिए Traceable पत्रकारों के साथ स्तन कैंसर के रोगी व्युत्पन्न Xenografts की लेबलिंग

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

रोगी की एक प्राथमिक संस्कृति की स्थापना-कोमल ऊतक सार्कोमा व्युत्पंन

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

प्राथमिक तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया में और रोगी-व्युत्पंन-xenografts में ल्यूकेमिया स्टेम कोशिकाओं का अनुमान करने के लिए प्रवाह Cytometry, निदान पर और अनुवर्ती

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

ली-Fraumeni सिंड्रोम रोगी-व्युत्पंन प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल का उपयोग ऑस्टियो मॉडलिंग

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

कैंसर स्टेम सेल को लक्षित करने के लिए एंटी-नोप्लास्टिक दवा स्क्रीनिंग के लिए फिजियोलॉजी रोगी व्युत्पन्न 3 डी स्फिरॉइड्स

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

रोगी-व्युत्पन्न अग्नाशय डक्टल एडेनोकार्सिनोमा ऑर्गेनॉइड मॉडल का अलगाव और लक्षण वर्णन

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

संरचनात्मक डीएनए परिवर्तन विश्लेषण और रोगी-व्युत्पन्न Xenografts का उपयोग कर कैंसर में लक्षित चिकित्सा का परीक्षण

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

एक Perfused Microfluidic मंच में रोगी-व्युत्पन्न Xenografts के पूर्व वीवो 3 डी हाइड्रोजेल संस्कृतियों के लिए बढ़ी हुई व्यवहार्यता

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

जेब्राफिश में प्राथमिक रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर ज़ेनोग्राफ्ट की दवा जांच

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

रोगी-व्युत्पन्न ट्यूमर नमूनों से 3-आयामी स्फेरॉइड स्थापित करना और दवाओं के प्रति उनकी संवेदनशीलता का मूल्यांकन करना

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...