Name: isolation and characterization of tumor-initiating cells from sarcoma patient-derived xenografts
Uploaded: 2019-06-13T12:30:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada por NCI-P01-CA087497 (a C.C.-C. e DH) e NIH-U 54-0OD020353 (a C.C.-C., DH, e J.D.-D.), o prêmio de líder do pensamento de Agilent (a C.C.-C.), e a Fundação de Martel (a C.C.-C. e a J.D.-D.).

Todos os protocolos para experimentos de mouse discutidos aqui foram de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Comitê de ética em pesquisa humana do Mount Sinai Medical Center e pelo Comitê de cuidados e uso de animais.
1. processamento da amostra de tecido do sarcoma, e formação de PDX
<ol><li>um protocolo aprovado pelo Conselho de revisão institucional, o pessoal do serviço de patologia prepara amostras de sarcoma de espécimes cirúrgicos e imediatamente coloca cada amostra no gelo em um prato de Petri de 100 mm.</li>
	<li>Coloque a amostra em um tubo cônico de poliestireno de 15 mL com 6 mL de meio de cultura de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) frio 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10% (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina. Processe a amostra de tecido imediatamente.</li>
	<li>
Opcional Para o osteosarcoma somente, siga as seguintes etapas, que podem ser ignoradas para o sarcoma macio do tecido.
	<ol>
<li>Corte o tecido em 20 mm3 peças usando um bisturi. Transfira as peças do tecido para um tubo de 15 mL contendo 3 mL de solução de colagenase (RPMI 1640 com 1 mg/mL de colagenase).</li>
		<li>Colocar o tubo num banho de água a 37 ° c durante 30 min.</li>
		<li>Completamente Vortex o tubo e, em seguida, adicionar 3 ml de RPMI 1640 suplementado com 10% FBS para neutralizar a atividade de colagenase.</li>
		<li>Centrifugar durante 5 min a 350 x g à temperatura ambiente. Retire o sobrenadante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trabalhando em um gabinete de biossegurança estéril, coloque a amostra de tecido em um prato de Petri de 100 mm. Adicionar 500 μL de soro fisiológico 1 tampão fosfato estéril (PBS) ao tecido. Com um bisturi estéril, triturar mecanicamente o tecido em partes pequenas até que nenhuma parte visível do tecido seja maior de 0,1 milímetros.</li>
	<li>Transfira a suspensão da célula 500 μL para um filtro de células de 35 μm e colete a suspensão filtrada com um tubo de poliestireno de 50 mL. Põr este tubo do poliestireno de 50 mL com a suspensão da pilha no gelo.</li>
	<li>Adicione outro 500 μL de PBS ao tecido. Triturar pela segunda vez, transferir a suspensão através do filtro de células, e recolhê-lo no mesmo tubo de 50 mL.</li>
	<li>Repita estas etapas (etapas 1.5 – 1.6) até que a seção do tecido esteja dissociada completamente, geralmente 6x-8x.</li>
	<li>Pellet a suspensão celular por centrifugação em 350 x g por 10 min à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante, Ressuspender o pellet usando 5 mL de tampão de hemólise (0,15 M NH4CL, 10 mm KHCO3e 0,1 mm EDTA), e incubar a solução por 5 min à temperatura ambiente para remover glóbulos vermelhos.</li>
	<li>Centrifugue por 5 min a 350 x g à temperatura ambiente e retire o tampão de hemólise. Lave o pellet com 5 mL de PBS. Centrifugue novamente por 5 min a 350 x g e retire o sobrenadante.</li>
	<li>Suspender a pelota com 1 mL de PBS e contar o número de células viáveis usando um hemociômetro ou qualquer outro método alternativo. Diluir as células para uma concentração final de 1 x 107 células em 200 ΜL de PBS. Deixe a suspensão celular no gelo.</li>
	<li>Deixe a matriz da membrana do porão no gelo para permitir que derrete. Adicionar 200 μL de matriz de membrana basal à suspensão da célula 200 μL. Misture suavemente e manter no gelo.</li>
	<li>Injete subcutaneously a suspensão da pilha: mistura da matriz da membrana do porão (1:1) em dois ratos da gama do scid do NOD (NSG) em seus flancos. Use 200 μL para cada injeção.</li>
	<li>Monitore a formação PDX verificando o local de injeção dos ratos 2x por semana. Remova o xenograft do tumor quando alcanga 1 cm no diâmetro.</li>
</ol>2. isolamento do tumor-iniciando células por FACS a partir do PDX
<ol><li>Remova cirùrgica o PDX dos ratos como descrito previamente12.</li>
	<li>Corte o tumor ao meio. Fixe a metade do xenograft com o paraformaldeído de 4% durante a noite. Isto é para análise histológica. Processe a outra metade do tecido como descrito acima (etapas 1,3 – 1,8) para obter uma suspensão de células tumorais.</li>
	<li>Ressuspender o pellet com PBS e contar o número de células viáveis.</li>
	<li>Diluir a suspensão celular em PBS suplementado com 5% FBS para uma concentração de 2 x 106 células/ml. Deixe a suspensão celular no gelo por 30 min. divida a suspensão da célula em dois tubos. Marque os tubos com controle isotópico e anticorpo, respectivamente. Anote o número de células em cada tubo.</li>
	<li>Prepare 2x anticorpo HLA-1-PE diluindo o anticorpo com PBS suplementado com 5% FBS (1:250). Diluir o anticorpo de controle isotipo negativo com a mesma condição. Misture a suspensão celular do tubo de "anticorpo" com anticorpo diluído (1:1) para fazer a diluição final do anticorpo 1:500. Misture a suspensão celular do tubo "controle isotópico" com controle isotópico (1:1). Coloque as suspensões celulares no gelo por 90 min.</li>
	<li>Centrifugador por 5 min a 350 x g a 4 ° c e retire o sobrenadante. Adicionar 10 mL de PBS para lavar o pellet 2x.</li>
	<li>Adicionar 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a PBS a uma concentração final de 10 μg/mL. Adicione esta solução DAPI ao pellet de célula para fazer uma suspensão de célula de 107 células/ml (usando os números de célula da etapa 2,4).</li>
	<li>Filtre a suspensão celular através de tampas de filtro de 35 μm em tubos de poliestireno de 12 mm x 75 mm.</li>
	<li>Use um citometro de fluxo para ordenar a subpopulação TIC HLA-1-Negative6. Pilhas viáveis da porta (DAPI-negative) e coletam subpopulações HLA-1-Negative e-positivas em 2 15 tubos da coleção do mL, cada um que contem 4 mL do meio de cultura de RPMI 1640.</li>
</ol>3. caracterização de células iniciantes tumorais
<ol><li>Formação de sarcosphere
	<ol>
<li>Faça meio de crescimento sarcosphere, usando o meio de cultura de células Alpha-MEM. Adicione suplementos para fazer uma concentração final de B-27 suplementos (1x), N2 suplementos (1x), fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF) (20 ng/mL), e fator de crescimento epidérmico (EGF) (20 ng/mL) e penicilina/estreptomicina (100 UI/mL). Filtre o meio com um filtro de cultura de células de 0,2 μm antes de usar.</li>
		<li>Pellet a subpopulação classificada HLA-1-negativa e positiva da etapa 2,9 e contar os números de células de cada subpopulação.</li>
		<li>Diluir 1,5 x 106 células em 15 ml do meio de crescimento sarcosphere para fazer a diluição da célula de 1 x 105 células/ml.</li>
		<li>Diluir serialmente as células com meio de crescimento da sarcofera fresca para fazer 15 mL de cada diluição celular de 104, 103e 102 células/ml. Em seguida, prepare 4 96-bem ultra-baixa placas de cultura de células de fixação, cada uma para uma diluição celular.</li>
		<li>Transferir 100 μL de suspensão celular da diluição de 105 células/ml para cada poço da primeira placa de cultura de células de fixação ultra-baixa de 96 poços. Esta placa tem 104 células em cada poço.</li>
		<li>Use as outras placas de cultura de células de fixação Ultrabaixa 3 96-bem para as outras três diluições de células: 104, 103e 102 células/ml. Transfira 100 μL de suspensão celular para cada poço das placas de cultura de células de fixação Ultrabaixa 96-bem. Estas três placas da cultura têm 1.000 pilhas/poço, 100 pilhas/poço, e 10 pilhas/poço, respectivamente.</li>
		<li>Põr as placas em um ° c 37, incubadora da cultura da pilha de 5% CO2 .</li>
		<li>Adicionar novos bFGF e EGF diretamente para o meio de cultura celular (concentração final de 20 ng/mL) a cada três dias sem alterar o meio para evitar células perdidas na cultura de suspensão.</li>
		<li>Usando um microscópio de luz, monitore a formação da sarcofera todos os dias durante três semanas, como mostrado na Figura 2a.</li>
		<li>Após três semanas, conte o número de poços sarcosphere-positivos e de poços sarcosphere-negativos de cada diluição da pilha para pilhas de HLA-1-Negative e de HLA-1-positive.</li>
		<li>Calcule a frequência da célula formando uma esfera com base em uma distribuição de probabilidade de Poisson13. Compare os tiques HLA-1-negativos com as células a granel HLA-1-positive.</li>
	</ol></li>
	<li>Ensaio de formação de tumores de diluição serial
	<ol>
<li>Conte as subpopulações HLA-1-Negative e-positive da etapa 2,9.</li>
		<li>Faça diluições seriais das pilhas com PBS às concentrações de 106, 105, 104, e 103 Cells/ml. Use 1 mL de cada diluição para a formação do tumor em 10 ratos.</li>
		<li>Adicione 1 mL de matriz de membrana basal à suspensão da célula de 1 mL de cada diluição (1:1). Mantenha os 2 mL de cada mistura no gelo.</li>
		<li>Injete subcutaneously 200 μL da pilha: mistura da matriz da membrana do porão nos flancos de ratos de NGS, usando pilhas HLA-1-negative para um flanco e pilhas de HLA-1-positive para o outro flanco do mesmo rato. Para cada diluição, use 10 camundongos. Use seringas de 25G com uma agulha para as injeções.</li>
		<li>Monitore a formação tumoral nos camundongos por quatro a oito semanas, dependendo da taxa de crescimento tumoral.</li>
		<li>Calcule a freqüência tumoral-iniciando da pilha pela porcentagem da formação do tumor em números de pilha diferentes da entrada. Compare os tiques HLA-1-negativos com as células a granel HLA-1-positive.</li>
	</ol></li>
	<li>Diferenciação induzida ao longo das vias mesenquimais
	<ol>
<li>Use os sarcospheres formados durante as etapas anteriores (etapa 3.1.9). Transfira os sarcospheres para uma nova placa de 6 poços. Cultura a sarcosphere com 2,5 mL de alfa-MEM suplementado com 10% FBS para deixar as pilhas anexar à superfície da placa da cultura.</li>
		<li>Após um acessório por dois dias, mude o meio de cultura de Alpha-mem suplementado com 10% FBS à mistura 1:1 de alfa-mem suplementado com o meio de crescimento de 10% FBS e da pilha de haste mesenquimais humana (hmsc).</li>
		<li>Após dois dias, mude para o meio de crescimento hMSC completo.</li>
		<li>Quando as células atingem 90% de confluência, aspiram o meio hMSC e adicionam meio de diferenciação. Para diferenciação osteogênica, adicionar meio de diferenciação osteogênica (meio de crescimento hMSC suplementado com 10 nM dexametasona, 5 mM β-glicerofosfato, 50 μg/mL de ácido L-ascórbico e 10 mM de cloreto de lítio). Para a diferenciação lipogênica, adicionar meio de diferenciação de adipócitos (meio de crescimento hMSC suplementado com 0,5 μM dexametasona, 0,5 μM isobutylmethylxanthine, e 50 μM indometacina).</li>
		<li>Mude o meio de diferenciação a cada três dias.</li>
		<li>Após três a quatro semanas, pare a diferenciação e lave as pilhas com PBS. Em seguida, aspirar a PBS e adicionar 2 mL de formalina a 10% para as células para fixação. Deixe as pilhas sentar-se para 45 minutos na temperatura ambiente. Lave-os com água desionizada. As células estão agora prontas para a coloração de alizarin Red S (Step 3.3.6.1) ou coloração de óleo vermelho O (passo 3.3.6.2).<ol>
<li>Para detectar a diferenciação osteogênica, realize coloração de alizarin Red S. Aspirar a água e adicionar 2 mL de solução de trabalho de alizarin Red S (2% alizarin Red S, pH 6,0) para as células, e deixá-los sentar-se por 5 min para a coloração. Lave as células com água deionizada e observe a reação microscopicamente.</li>
			<li>Para detectar a diferenciação adipogênica, realize a coloração de óleo vermelho O.<ol>
<li>Faça uma solução Oil Red O. Prepare uma solução de ações adicionando 300 mg de óleo vermelho O pó a 100 mL de isopropanol.</li>
				<li>Dentro de 2 h antes de usar, misture três partes (30 ml) da solução do estoque do óleo vermelho O com duas porções (20 ml) da água deionizada. Deixe a mistura sentar-se durante 10 min à temperatura ambiente.</li>
				<li>Filtre a solução de trabalho usando antes de usar.</li>
				<li>Retire a água das células preparadas de acordo com a etapa 3.3.6. Adicione 2 mL de isopropanol a 60% para cobrir a monocamada celular e as células se sentam por 2 min.</li>
				<li>Retire o isopropanol e adicione 2 mL de óleo vermelho O solução de trabalho. Permita que as células se sentem por 5 min à temperatura ambiente.</li>
				<li>Enxague as células com água deionizada e observe a reação um microscópio de luz.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Medema, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+the+challenges+ahead.">Cancer stem cells: the challenges ahead.</a> Nature Cell Biology. 15 (4), 338-344 (2013).</li><li>Jordan, C., Guzman, M., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells.">Cancer stem cells.</a> The New England Journal of Medicine. 355 (12), 1253-1261 (2006).</li><li>Jordan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+controversial+or+just+misunderstood?.">Cancer stem cells: controversial or just misunderstood?.</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 203-205 (2009).</li><li>Bapat, S., Mali, A., Koppikar, C., Kurrey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor-like+cells+contribute+to+the+aggressive+behavior+of+human+epithelial+ovarian+cancer.">Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer.</a> Cancer Research. 65 (8), 3025-3029 (2005).</li><li>Charafe-Jauffret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature.">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Research. 69 (4), 1302-1313 (2009).</li><li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells.">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer Cell. 22 (3), 373-388 (2012).</li><li>Reya, T., Morrison, S., Clarke, M., Weissman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+cancer,+and+cancer+stem+cells.">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+DNA+methylation+of+CD133+in+colorectal+and+glioblastoma+tumors.">Abnormal DNA methylation of CD133 in colorectal and glioblastoma tumors.</a> Cancer Research. 68 (19), 8094-8103 (2008).</li><li>Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome.">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li><li>Garrido, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+HLA+expression+during+tumour+development.">Natural history of HLA expression during tumour development.</a> Immunology Today. 14 (10), 491-499 (1993).</li><li>Chang, C. C., Campoli, M., Ferrone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+and+nonclassical+HLA+class+I+antigen+and+NK+cell-activating+ligand+changes+in+malignant+cells:+current+challenges+and+future+directions.">Classical and nonclassical HLA class I antigen and NK cell-activating ligand changes in malignant cells: current challenges and future directions.</a> Advances in Cancer Research. 93, 189-234 (2005).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+sarcoma+tumor-initiating+cells+through+differentiation+therapy.">Targeting sarcoma tumor-initiating cells through differentiation therapy.</a> Stem Cell Research. 21, 117-123 (2017).</li><li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELDA:+Extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays.">ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> Journal of Immunology. 347, 70-78 (2009).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Há diversas etapas críticas que limitam o sucesso deste protocolo para isolar e caracterizar pilhas tumor-iniciando do sarcoma humano PDXs. o sarcoma humano inclui muitos subtypes diferentes. Observamos que a formação de PDX é altamente dependente de subtipos de sarcoma. Sarcomas agressivos clínicos com um phenotype histològica indiferenciado (por exemplo, sarcomas indiferenciados pleomórficos [taxa de sucesso 100%, n = 2], liposarcomas desdiferenciados [taxa de sucesso 100%, n = 2], e sarcomas sinovial [ taxa de sucesso 100%, n = 3]) têm uma alta taxa de sucesso da formação PDX. Entretanto, os sarcomas com fenótipos diferenciados (por exemplo, liposarcomas bem diferenciados [taxa de sucesso 0%, n = 3]) mostram umas mais baixas taxas da formação de PDX. É possível que as pilhas tumor-iniciando estejam atuais em uns subtipos mais malignos em uma porcentagem mais elevada do que em subtipos menos malignos, diferenciados. Além, nós recomendamos terminar o tumor-iniciando o procedimento da isolação da pilha dentro de um dia sem nenhuma parada para minimizar toda a perda de viabilidade da pilha.
Nós identificamos que as pilhas HLA-1-Negative existem extensamente em sarcomas humanos. Mas a percentagem de células HLA-1-negativas pode variar entre amostras de diferentes pacientes. Por este método, Nós isolamos com sucesso pilhas tumor-iniciando das amostras que têm as pilhas HLA-1-Negative que variam de menos de 0,5% a mais de 30%12. É importante caracterizar as pilhas HLA-1-Negative funcionalmente pela formação da esfera e pelos ensaios da formação do tumor para confirmar a identidade tumor-iniciando da pilha de pilhas HLA-1-negativas isoladas.
No entanto, o protocolo aqui apresentado também tem limitações. Os dados precedentes mostraram que a expressão de HLA-1 é regulada epigeneticamente, que é consistente com a observação da heterogeneidade celular da expressão de HLA-1 dentro do mesmo tumor12. As mutações genomic de HLA-1 foram detectadas nos sarcomas e em outros tipos do cancro. As mutações em genes HLA-1 podem conduzir à perda completa de HLA-1 na superfície da pilha no tumor inteiro ou a expressar HLA-1 mutado não funcionais. Em ambos os casos, a negatividade de HLA-1 não pode ser usada para identificar tiques dentro do tumor.
Usando HLA-1 como um marcador negativo, Nós isolamos com sucesso TICs de uma variedade de subtipos humanos do sarcoma e validamos nossos resultados pela análise funcional. Assim, pudemos realizar estudos moleculares, incluindo a análise da expressão gênica sobre os tiques, a fim de desenvolver tratamento específico visando esses tiques.

A heterogeneidade celular intratumoral de cancros humanos foi apoiada aumentando a evidência durante a década passada1. Similar ao tecido normal, o tecido do cancro consiste em uma subpopulação pequena dos tiques (igualmente chamadas pilhas de haste do cancro), que exibem a habilidade tumor-dando forma; Enquanto isso, a maior parte das células cancerosas exibem fenótipos diferenciados2. Estes tiques mostram Propriedades tipo células-tronco, incluindo a expressão de um marcador de células-tronco e a capacidade de autorenovação e divisão celular assimétrica, podendo, assim, iniciar a formação de um tumor celular heterogêneo3. Estudos recentes revelaram que os tiques não são apenas responsáveis pela iniciação tumoral, mas também estão associados à agressividade tumoral4, metástase5e resistência a fármacos6. Portanto, é importante compreender a biologia dos tiques e, assim, desenvolver uma estratégia específica de tratamento visando esses tiques.
Os métodos baseados em FACS têm sido usados para identificar tiques usando marcadores TICs, incluindo CD133, CD24 e CD441. A maioria desses marcadores também são expressos em células-tronco normais7. No entanto, nenhum desses marcadores marca apenas tiques. Os papéis que essas moléculas desempenham na malignidade dos tiques ainda não estão claros. Por exemplo, CD133 pode ser freqüentemente inativado por metilação de DNA, e assim, essa heterogeneidade intertumoral pode tornar a acurácia desses marcadores8. ALDH1 é um marcador que também funciona para manter o células de TICs9. Parece ser mais eficaz na identificação de tiques de câncer de mama, mas ainda é questionável em outros tipos de tumores9. Algumas vias de sinalização desempenham papéis importantes na biologia das células-tronco, incluindo WNT (site de integração relacionada à wingless), TGF-β (fator de crescimento transformador beta) e Hedgehog1. Mas é difícil provar que estes caminhos são TIC-específicos e usar a atividade destas vias para isolar tiques de tumores primários. Assim, um marcador de TIC novela confiável é urgentemente necessário.
A classe humana de MHC I, igualmente chamada HLA-1, é uma proteína de superfície da pilha expressada em quase todas as pilhas nucleadas10. HLA-1 funciona como um antígeno que apresenta uma molécula que seja reconhecida especificamente por pilhas de T CD810. O efeito citotóxico das células T CD8 pode ser ativado quando as células cancerosas apresentam um antígeno tumoral por HLA-1. Portanto, a falta de HLA-1 na superfície celular das células cancerosas pode levar a um escape imune das células T citotóxicas CD8. O downregulation de HLA-1 foi descrito em tipos diferentes de cancro humano e é correlacionado com o prognóstico pobre, a metástase, e a resistência de droga11. Nós mostramos que a perda da expressão de HLA-1 na superfície da pilha pode ser usada para identificar tiques nos sarcomas, assim como no cancer de próstata6,12.
Aqui, nós descrevemos um protocolo detalhado para isolar tiques do sarcoma humano PDXs por FACS, usando HLA-1 como um marcador negativo, e para validar mais e caracterizar estes TICs HLA-1-Negative.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:708px;" width="708">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:300px;">0.2 &#956;m cell culture filter</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">450-0020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">100 mm Petri dish</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">35 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">50 mL polystyrene tube</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">96-well ultra-low attachment cell culture plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Alizarin Red S&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">B-27</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">08-0085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">bFGF</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">PHG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">dexamethasone</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">EGF</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">HLA-1-PE antibody&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Abcam</td>
			<td>ab43545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">hMSC growth medium</td>
			<td style="width:123px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">PCS-500-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">indomethacin</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">isobutylmethylxanthine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">isopropanol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:300px;">Isotype Control Antibody</td>
			<td style="width:123px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab103534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">L-ascorbic acid&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">lithium chloride&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">62476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Matrigel basement membrane matrix&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:300px;">MEM Alpha</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">N2</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">NSG mice</td>
			<td style="width:123px;">The Jackson Lab</td>
			<td style="width:119px;">005557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Oil Red O&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">PBS</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:300px;">Syringe with needle</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">&#946;-glycerophosphate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of tumor-initiating cells from sarcoma patient-derived xenografts

A existência e a importância de pilhas tumor-iniciando (TICs) foram apoiadas aumentando a evidência durante a década passada. Estes TICs foram mostrados para ser responsáveis para a iniciação do tumor, a metástase, e a resistência da droga. Conseqüentemente, é importante desenvolver a terapia específica do TIC-alvejante além do que as estratégias atuais da quimioterapia, que focalizam na maior parte no volume de non-TICs. A fim compreender mais mais o mecanismo atrás da malignidade dos tiques, nós descrevemos um método para isolar e caracterizar tiques em sarcomas humanos. Nisto, nós mostramos um protocolo detalhado para gerar xenoenxertos paciente-derivados (PDXs) de sarcomas humanos e para isolar o TICs pela seleção fluorescência-ativada da pilha (FACS) usando a classe humana I do antígeno da leucócito (HLA-1) como um marcador negativo. Também, nós descrevemos como caracterizar funcionalmente estes tiques, incluindo um ensaio da formação da esfera e um ensaio da formação do tumor, e para induzir a diferenciação ao longo das vias mesenquimais. O isolamento e a caracterização de PDX TICs fornecem pistas para a descoberta de potenciais reagentes terapêuticos de direcionamento. Além disso, o aumento da evidência sugere que este protocolo pode ser ampliado para isolar e caracterizar tiques de outros tipos de cânceres humanos.

Um sarcoma humano PDX foi gerado e manchado. A heterogeneidade de intratumoral foi mostrada por immunohistochemistry usando o anticorpo de HLA-1. O Xenoenxerto consistiu de duas subpopulações distintas, a saber, HLA-1 positivas e negativas (Figura 1a)12. O sarcoma PDX mostrou semelhanças histológicas com o tumor primário parental (Figura 1a). O sarcoma PDX TICs foi isolado por FACS. Usando um método de triagem dupla, as células HLA-1-negativas foram altamente enriquecidas a partir da população de células parentais (Figura 1b)12.
Genes expressos em células-tronco (por exemplo, Oct4, NANOG e Myc) foram altamente expressos em células HLA-1-negativas isoladas quando comparados aos seus homólogo HLA-1-positivo (Figura 1C). Sox-9, um gene desenvolvente relatado para jogar papéis importantes em outras pilhas de haste do cancro, como na carcinoma do peito, foi expressado especificamente em pilhas de HLA-1-Negative (Figura 1D).
Para validar a subpopulação isolada de HLA-1-Negative, um ensaio da formação do sarcosphere foi executado para examinar a habilidade da Self-renovação das pilhas. As células HLA-1-negativas foram capazes de formar esferas com uma entrada inicial de tão pouco quanto 10 células (Figura 1e)12. A fim examinar a habilidade tumor-dando forma, um ensaio da tumor-formação da diluição da série foi executado. Os mesmos números de pilhas HLA-1-Negative e-positivas foram injetados por via subcutânea em cada flanco do mesmo rato. As células HLA-1-negativas mostraram uma capacidade de formação tumoral significativamente maior (Figura 1F)12, enquanto os xenoenxertos formados por subpopulações HLA-1-negativas e positivas foram tumores celulares heterogêneos (Figura 1h).
Nós executamos uma análise da expressão de gene do TICs isolado HLA-1-Negative12. Os genes associados com a diferenciação de pilha mesenquimais normal eram elevados nos tiques12. Assim, nós igualmente testamos se os tiques HLA-1 podem ser induzidos à diferenciação terminal e resultam em uma habilidade diminuída da formação do tumor. Os resultados mostraram que as células HLA-1-negativas podem ser induzidas para diferenciar-se ao longo das vias lipogênicas e osteogênicas e mostrar coloração vermelha O e alizarin Red S de óleo forte (Figura 1G). Por outro lado, as células HLA-1-positivas não se diferenciam nas mesmas condições. Assim, esses resultados indicam uma estratégia de terapia diferenciada e promissora que pode ser usada para segmentar os tiques do sarcoma.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig1.jpg"> Figura 1: isolação de pilhas de HLA-1-Negative do sarcoma heterogêneo intratumoral PDXs. (A) células HLA-1-negativas (setas) foram encontradas em diferentes subtipos de sarcomas humanos por imuno-histoquímica (IHC). (a e b) Sarcoma desobstruído da pilha. (c e d) Lipossarcoma pleomórfico. (e e f) Leiomyosarcoma. (g e h) Tumor periférico maligno da bainha do nervo. (i e j) LIPOSSARCOMA, não especificado de outra forma. (k e l) Lipossarcoma desdiferenciado. Barra de escala = 100 μm. (B) o sarcoma pdxs foi histologicamente semelhante ao tumor parental (hematoxilina e eosina [H & e] mancha) e mostrou heterogeneidade celular na expressão HLA-1 por IHC. Aqui são mostrados retratos representativos do sarcoma PDXs, incluindo um sarcoma desobstruído da pilha (CCS), um chondrosarcoma desdiferenciado (DCS), e um liposarcoma desdiferenciado (DDL). Barra de escala = 100 μm. (C) a subpopulação de células HLA-1-negativas foi isolada por citometria de fluxo com método de dupla ordenação. De cima para baixo: primeira ordenação, segunda ordenação e verificação de pureza. As pilhas HLA-1-Negative isoladas e HLA-1-positive foram submetidas a uma análise funcional subseqüente, incluindo um ensaio da formação do tumor. Os resultados dessa figura são de uma publicação anterior12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig2.jpg"> Figura 2: caracterização de tiques HLA-1-negativos por ensaios funcionais. (A) um ensaio de formação de esfera mostrou que apenas 10 células HLA-1-negativas foram capazes de formar esferas de sarcoma. Esquerda: retratos representativos de esferas do sarcoma. Direita: frequência de formação de esferas; média ± DP. barra de escala = 100 μm. (B) as células HLA-1-negativas isoladas do sarcoma PDX foram altamente tumorigenic. São mostrados aqui retratos representativos do tumor dado forma por pilhas HLA-1-Negative e-positivas do DDL. Mil pilhas de pilhas de HLA-1-Negative e de HLA-1-positive DDL foram injetadas em flancos separados do mesmo rato. (C) os níveis de mRNA de genes de células estaminais Oct4, NANOGe Myc foram expressos em níveis mais elevados em células HLA-1-negativas em comparação com células HLA-1-positivas. Os dados representam a média ± DP (n = 5). (D) forte coloração positiva de óleo vermelho O e alizarin Red S mostra uma diferenciação terminal ao longo de vias lipogênicas e osteogênicas que são induzidas a partir de sarcoma TICs. (E) imunocoloração HLA-1 de pdxs formados por SUBPOPULAÇÕES HLA-1-positivas (esquerda) e-negativas (direita). Barra de escala = 100 μm. Os resultados dessa figura são de uma publicação anterior12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Nós descrevemos um protocolo detalhado para a isolação de pilhas tumor-iniciando dos xenoenxertos paciente-derivados do sarcoma humano pela seleção fluorescência-ativada da pilha, usando o antígeno-1 humano da leucócito (HLA-1) como um marcador negativo, e para a validação mais adicional e caracterização destas pilhas tumor-iniciando HLA-1-Negative.

Isolamento e caracterização de células iniciantes tumorais de sarcoma de xenoenxertos derivados do paciente

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Descobrimos que o HLA-I é epigeneticamente para baixo regulado em uma subpopulação de células cancerosas que exibem propriedades de células-tronco e capacidade de início de tumor. A baixa regulação do HLA-I está diretamente relacionada à fuga imunológica, proporcionando vantagens de sobrevivência para células-tronco cancerosas, tornando assim a negatividade HLA-I um marcador funcional preciso para essas células. Demonstrando o procedimento será Sudeh Izadmehr, um pós-doutor do nosso laboratório.Após a aquisição da amostra, coloque o tecido em uma placa de Petri de 100 milímetros em um armário de bio segurança esterilizado, e adicione 500 microliters de PBS estéril ao prato. Use um bisturi estéril para triturar mecanicamente o tecido em pequenos pedaços até que nenhum fragmento seja maior que 0,1 milímetro. Transfira todo o volume de 500 microliter de PBS através de um coador de células poros de 35 micrômetros em um tubo cônico de 50 mililitros.Adicione mais 500 microliters de PBS aos fragmentos de tecido, e pique os tecidos novamente. Em seguida, filtre o supernascer através do coador celular no mesmo tubo de coleta, e continue a picar os pedaços de tecido até que a amostra seja completamente dissociada. Quando o último volume de células tiver sido coletado, gire as células tumorais por centrifugação, e suspenda a pelota em cinco mililitros de tampão de hemólise.Depois de cinco minutos em temperatura ambiente, colete as células com outra centrifugação, e lave a pelota com outros cinco mililitros de PBS. Suspenda a pelota em um mililitro da PBS, e conte as células viáveis. Diluir as células para uma única vezes 10 a sete células por 200 microliters de concentração de PBS no gelo, e adicionar 200 microliters de matriz de membrana de porão às células com mistura suave.Em seguida, injete a matriz de membrana de suspensão celular subcutânea no flanco de um rato gama scid scid nod, e verifique o crescimento do tumor no local da injeção duas vezes por semana. Quando o tumor atingir um centímetro de diâmetro, corte o tumor ao meio e fixe metade do xenoenxerto com 4% de paraformaldeído durante a noite para análise histológica. Processe a segunda metade do tumor como apenas demonstrado para alcançar uma única suspensão celular, e dilua as células para duas vezes 10 para as seis células por mililitro de PBS suplementado com concentração de 5% de FBS.Mantenha as células no gelo por 30 minutos antes de dividir a suspensão celular entre um controle isótipo e um tubo de anticorpos. Observe o número de células em cada tubo, e misture as células no tubo de anticorpo com anticorpos anti-HLA e as células no tubo de controle do isótipo com um anticorpo de controle anti-isótipo apropriado para uma incubação de 90 minutos no gelo. Ao final da incubação, coletar ambas as populações celulares por centrifugação, seguida por duas lavagens pbs de 10 mililitros por centrifugação.Após a segunda lavagem, suspenda as pelotas em 10 microgramas por mililitro de DAPI para uma única vezes 10 às sete células por concentração mililitro. Em seguida, filtre cada suspensão celular através de um filtro de poros de 35 micrômetros em tubos individuais de poliestireno de 12 por 75 milímetros. Após a triagem celular ativada pela fluorescência, dilui as populações celulares HLA-I-negativas e positivas para indivíduos uma vez 10 a cinco concentrações celulares em 15 mililitros do meio de crescimento da sarcósfera por subconjunto.Diluir as células em uma vez 10 para a quarta, 10 para a terceira, e 10 para a segunda concentrações em 15 mililitros de crescimento fresco sarcosfera médio por diluição, e adicionar 100 microliters de células de cada diluição a cada poço de uma placa de cultura celular de 96 poços ultra-baixos por diluição. Coloque as placas em uma incubadora de cultura de células de dióxido de carbono de 37 graus Celsius, 5%, monitorando a formação da sarcosfera diariamente por microscopia leve e adicionando fator de crescimento de fibroblasto básico fresco e fator de crescimento epidérmico a cada poço sem alterar o meio a cada três dias. Após três semanas, conte o número de poços positivos e sarcosfera-negativos para cada diluição celular de células HLA-I-negativas e HLA-I-positivas para permitir o cálculo da frequência celular formadora de esferas com base em uma distribuição de probabilidade de Poisson.Tipicamente, os xenerxertos de sarcoma derivados do paciente humano consistem em duas populações distintas de HLA-I-positivo e negativo, com uma histologia semelhante à demonstrada pelo tumor primário parental. A triagem celular ativada pela fluorescência de células cancerígenas derivadas do paciente sarcoma, como demonstrado, facilita o enriquecimento de um alto número de células HLA-I-negativas da população celular parental. As células HLA-I-negativas são capazes de formar esferas com uma entrada inicial de apenas 10 células e apresentar uma maior capacidade de formação tumoral do que o paciente hla-i-positivo sarcoma chegou células que iniciam tumores de xenoenxerto.A injeção do mesmo número de células negativas e positivas HLA-I subcutâneas em flancos opostos do mesmo rato demonstra que as células HLA-I-negativas possuem uma capacidade significativamente maior de formação de tumores. Enquanto os xenoenxertos formados por subpopulações negativas e positivas do HLA-I são tumores celularmente heterogêneos. Além disso, a análise da expressão genética das células iniciadoras do tumor revela que as células HLA-I-negativas expressam marcadores de diferenciação de células-tronco e podem ser induzidas a se diferenciar ao longo das vias lipogênicas e osteogênicas, demonstrando fortes manchas e cultura de Óleo-Vermelho-O e Alizarin-Red-S.Este método pode ser usado para isolar células-tronco cancerígenas em vários cânceres humanos. A carbonização molecular, por exemplo, pelo sequenciamento de próxima geração pode revelar marcadores comuns para atingir as células terapeuticamente. Nossa descoberta demonstra que a restauração do HLA-I é um passo crítico para o sucesso das estratégias de aumento de células imunes da unidade funcional.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Rotulagem de cancro da mama xenoenxertos derivados do paciente com rastreáveis ​​Repórteres para o crescimento de tumores e metástases Estudos

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Pesquisa do câncer

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