Name: isolation and characterization of tumor-initiating cells from sarcoma patient-derived xenografts
Uploaded: 2019-06-13T12:30:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts at JoVE.com

Denna forskning stöddes av NCI-P01-CA087497 (till C.C.-C. och D.H.) och NIH-U 54-0OD020353 (till C.C.-C., D.H., och J.D.-D.), den Agilent tänkte Leader Award (till C.C.-C.), och Martel Foundation (till C.C.-C. och J.D.-D.).

Alla protokoll för mus experiment diskuteras här var i enlighet med institutionella riktlinjer och godkändes av Mount Sinai Medical Center institutionella mänskliga forskningsetiska kommittén och djuromsorg och användning kommittén.
1. bearbetning av sarkom-vävnadsprovet och PDX-bildning
<ol><li>Enligt en institutionell översyn Board-godkända protokoll, har patologi servicepersonal förbereda sarkom prover från kirurgiska prover och omedelbart sätta varje prov på is i en 100 mm petriskål.</li>
	<li>Placera provet i en 15 mL polystyren konisk tub med 6 mL kallt Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 odlingssubstrat kompletterat med 10% foster bovint serum (FBS) och 1% penicillin/streptomycin. Bearbeta vävnadsprovet omedelbart.</li>
	<li>
Valfritt För osteosarkom endast, Följ följande steg, som kan hoppas över för mjukdelssarkom.
	<ol>
<li>Skär vävnaden i 20 mm3 stycken med en skalpell. Överför vävnads bitarna till ett 15 mL rör innehållande 3 mL kollagenaslösning (RPMI 1640 med 1 mg/mL kollagenas).</li>
		<li>Sätt röret i ett vattenbad vid 37 ° c i 30 min.</li>
		<li>Blanda noggrant röret och tillsätt sedan 3 mL RPMI 1640 kompletterat med 10% FBS för att neutralisera kollagenasaktiviteten.</li>
		<li>Centrifugera i 5 min vid 350 x g vid rumstemperatur. Ta bort supernatanten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Arbeta i ett sterilt biosäkerhetsskåp, placera vävnadsprovet i en 100 mm petriskål. Tillsätt 500 μL steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till vävnaden. Med en steril skalpell, mekaniskt hackad vävnaden i små bitar tills ingen synlig vävnad bit är större än 0,1 mm.</li>
	<li>Överför 500 μL cellsuspension till en cell SIL med 35 μm och samla den filtrerade suspensionen med ett 50 mL polystyrenrör. Sätt denna 50 mL polystyren röret med cellsuspensionen på is.</li>
	<li>Tillsätt ytterligare 500 μL PBS till vävnaden. Triturate för andra gången, överföra suspensionen genom cellen SIL, och samla in den i samma 50 mL rör.</li>
	<li>Upprepa dessa steg (steg 1.5 – 1.6) tills vävnads sektionen är helt separerad, vanligen 6x-8x.</li>
	<li>Pelleten cellsuspensionen genom centrifugering vid 350 x g i 10 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten, Omsuspendera pelleten med 5 mL hemolyseringsbuffert (0,15 M NH4cl, 10 mm KHCO3och 0,1 mm EDTA) och inkubera lösningen i 5 minuter vid rumstemperatur för att avlägsna röda blodkroppar.</li>
	<li>Centrifugera i 5 min vid 350 x g vid rumstemperatur och ta bort hemolysbufferten. Tvätta pelleten med 5 mL PBS. Centrifugera igen i 5 min vid 350 x g och ta bort supernatanten.</li>
	<li>Omsuspendera pelleten med 1 mL PBS och räkna det livskraftiga cellnumret med hjälp av en hemocytometern eller någon annan alternativ metod. Späd ut cellerna till en slutlig koncentration av 1 x 107 celler i 200 μl PBS. Låt cellsuspensionen på isen.</li>
	<li>Lämna källaren membran matris på is så att den kan smälta. Tillsätt 200 μL basalmembran mat ris till 200 μL cellsuspension. Blanda försiktigt och håll på isen.</li>
	<li>Subkutant injicera cellsuspensionen: basalmembran Matrix (1:1) blandning i två NOD scid gamma (NSG) möss i deras flanker. Använd 200 μL för varje injektion.</li>
	<li>Övervaka PDX formation genom att kontrollera injektionsstället av möss 2x en vecka. Ta bort tumörxenograft när den når 1 cm i diameter.</li>
</ol>2. isolering av tumör-initierande celler av FACS från PDX
<ol><li>Ta bort PDX från möss som beskrivits tidigare12.</li>
	<li>Skär tumören i hälften. Fix hälften av xenograft med 4% PARAFORMALDEHYD över natten. Detta är för histologisk analys. Bearbeta den andra halvan av vävnaden som beskrivs ovan (steg 1.3 – 1.8) för att få en tumör cellsuspension.</li>
	<li>Omsuspendera pelleten med PBS och räkna det livskraftiga cellnumret.</li>
	<li>Späd ut cellsuspensionen i PBS kompletterad med 5% FBS till en koncentration av 2 x 106 celler/ml. Låt cellsuspensionen på is i 30 min. dela upp cellsuspensionen över två rör. Markera rören med isotop kontroll respektive antikropp. Notera antalet celler i varje tub.</li>
	<li>Bered 2x HLA-1-PE-antikropp genom att späda antikroppen med PBS kompletterad med 5% FBS (1:250). Späd den negativa isotyp kontroll antikroppen med samma tillstånd. Blanda cellsuspensionen från "antikropp" röret med utspädd antikropp (1:1) för att göra den slutliga antikroppen utspädning 1:500. Blanda cellsuspensionen från "isotop kontroll" röret med isotop kontroll (1:1). Sätt cellsuspensioner på is för 90 min.</li>
	<li>Centrifugera i 5 min vid 350 x g vid 4 ° c och avlägsna supernatanten. Tillsätt 10 mL PBS för att tvätta pelleten 2x.</li>
	<li>Tillsätt 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) till PBS till en slutlig koncentration på 10 μg/mL. Lägg till denna DAPI-lösning till cellpelleten för att göra en cellsuspension av 107 celler/ml (med hjälp av cellnumren från steg 2,4).</li>
	<li>Filtrera cellsuspensionen genom 35 μm SIL mössor i 12 mm x 75 mm polystyren rör.</li>
	<li>Använd en flödescytometer för att sortera HLA-1-negativ TIC-subpopulationen6. Gate livskraftiga celler (DAPI-negativ) och samla in både HLA-1-negativa och positiva subpopulationer i 2 15 mL uppsamlings rör, vardera innehållande 4 mL RPMI 1640 odlingssubstrat.</li>
</ol>3. karakterisering av tumör-initierande celler
<ol><li>Sarcosphere formation
	<ol>
<li>Gör sarcosphere tillväxtmedium, med hjälp av alfa-MEM cellkulturmedium. Tillsätt kosttillskott för att göra en slutlig koncentration av B-27 kosttillskott (1x), N2 kosttillskott (1x), grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF) (20 ng/mL), och Epidermal tillväxtfaktor (EGF) (20 ng/ml) och penicillin/streptomycin (100 IU/mL). Filtrera mediet med ett cell odlings filter på 0,2 μm före användning.</li>
		<li>Pelleten den sorterade HLA-1-negativa och positiva subpopulationen från steg 2,9 och räkna cellnumren för varje subpopulation.</li>
		<li>Späd 1,5 x 106 celler i 15 ml av sarcosphere Growth medium för att göra cell utspädning av 1 x 105 celler/ml.</li>
		<li>Seriellt späda cellerna med färska sarcosphere tillväxtmedium för att göra 15 mL av varje cell utspädning av 104, 103, och 102 celler/ml. Sedan förbereda 4 96-väl ultra-låg bilaga cellkultur tallrikar, vardera för en cell utspädning.</li>
		<li>Överför 100 μL cellsuspension från 105 celler/ml utspädning till varje brunn av den första 96-väl ultra-låg bilaga cellkultur plattan. Denna platta har 104 celler i varje brunn.</li>
		<li>Använd den andra 3 96-väl ultra-låg bilaga cellkultur plattor för de andra tre cell utspädningar: 104, 103, och 102 celler/ml. Överför 100 μL cellsuspension till varje brunn i 96-och ultra-låg bilaga cellkultur plattor. Dessa tre kultur plattor har 1 000 celler/brunn, 100 celler/brunn, och 10 celler/brunn, respektive.</li>
		<li>Sätt plattorna i en 37 ° c, 5% CO2 cell Culture inkubator.</li>
		<li>Lägg till nya bFGF och EGF direkt till cell odlingsmediet (slutlig koncentration på 20 ng/mL) var tredje dag utan att ändra mediet för att undvika att celler förloras i suspensions kulturen.</li>
		<li>Med hjälp av ett ljusmikroskop, övervaka sarcosphere bildandet varje dag i tre veckor, som visas i figur 2A.</li>
		<li>Efter tre veckor, räkna antalet sarcosphere-positiva brunnar och sarcosphere-negativa brunnar i varje cell utspädning för både HLA-1-negativa och HLA-1-positiva celler.</li>
		<li>Beräkna sfär-bildande cell frekvens baserat på en Poissonsannolikhets fördelning13. Jämför HLA-1-negativa TICs med HLA-1-positiva bulkceller.</li>
	</ol></li>
	<li>Serial-utspädning tumör-formation assay
	<ol>
<li>Räkna HLA-1-negativa och positiva subpopulationer från steg 2,9.</li>
		<li>Gör seriella utspädningar av cellerna med PBS till koncentrationer av 106, 105, 104och 103 celler/ml. Använd 1 mL av varje spädning för tumörbildningen hos 10 möss.</li>
		<li>Tillsätt 1 mL basalmembran mat ris till 1 mL cellsuspensionen av varje spädning (1:1). Håll 2 mL av varje blandning på is.</li>
		<li>Injicera subkutant 200 μL av cellen: basalmembran Matrix blandning i flanker av NGS möss, med hjälp av HLA-1-negativa celler för en flank och HLA-1-positiva celler för den andra flanken av samma mus. Använd 10 möss för varje spädning. Använd 25 g sprutor med en nål för injektionerna.</li>
		<li>Övervaka tumör bildning i möss för fyra till åtta veckor, beroende på graden av tumörtillväxt.</li>
		<li>Beräkna tumörinitierande cell frekvens av andelen tumör bildning vid olika indatacell nummer. Jämför HLA-1-negativa TICs med HLA-1-positiva bulkceller.</li>
	</ol></li>
	<li>Inducerad differentiering längs mesenkymala vägar
	<ol>
<li>Använd sarcospheres bildas under föregående steg (steg 3.1.9). Överför sarcospheres till en ny 6-brunn tallrik. Odla sarcosphere med 2,5 mL alfa-MEM kompletterad med 10% FBS för att låta cellerna fästa på odlings plattans yta.</li>
		<li>Efter en bifogad fil i två dagar, byta kultur medium från alfa-MEM kompletteras med 10% FBS till 1:1 blandningen av alfa-MEM kompletteras med 10% FBS och Human mesenkymala stamcells (hmsc) tillväxtmedium.</li>
		<li>Efter två dagar, växla till komplett hMSC Growth medium.</li>
		<li>När cellerna når 90% confluency, aspirera hMSC mediet och tillsätt differentiering medium. För osteogen differentiering, tillsätt osteogent differentierings medium (hMSC-tillväxtmedium kompletterat med 10 nM dexametason, 5 mM β-glycerofosfat, 50 μg/mL L-Askorbinsyra och 10 mM litiumklorid). För lipogen differentiering, tillsätt fettceller differentiering medium (hmsc Growth medium kompletterat med 0,5 μm dexametason, 0,5 μm isobutylmetylxantin, och 50 μm indometacin).</li>
		<li>Ändra differentierings mediet var tredje dag.</li>
		<li>Efter tre till fyra veckor, stoppa differentieringen och tvätta cellerna med PBS. Sedan, aspirera PBS och tillsätt 2 mL 10% formalin till cellerna för fixering. Låt cellerna sitta för 45 min vid rumstemperatur. Tvätta dem med avjoniserat vatten. Cellerna är nu redo för alizarin Röd S färgning (steg 3.3.6.1) eller olja röd O färgning (steg 3.3.6.2).<ol>
<li>För att detektera osteogen differentiering, utför alizarin Röd S-färgning. Aspirera vatten och tillsätt 2 mL alizarin Röd S arbetslösning (2% alizarin Röd S, pH 6,0) till cellerna, och låt dem sitta i 5 min för färgning. Tvätta cellerna med avjoniserat vatten och observera reaktionen mikroskopiskt.</li>
			<li>För att detektera adipogen differentiering, utför olja röd O färgning.<ol>
<li>Gör en Oljeröd O-lösning. Bered en stamlösning genom att tillsätta 300 mg Oljerött O-pulver till 100 mL isopropanol.</li>
				<li>Inom 2 timmar före användning, blanda tre delar (30 mL) av olja röd O stamlösning med två delar (20 mL) av avjoniserat vatten. Låt blandningen sitta i 10 minuter vid rumstemperatur.</li>
				<li>Filtrera arbetslösningen med före användning.</li>
				<li>Ta bort vattnet från cellerna som bereds enligt steg 3.3.6. Tillsätt 2 mL 60% isopropanol för att täcka cellmonolayer och cellerna sitter i 2 min.</li>
				<li>Ta bort isopropanol och tillsätt 2 mL Oljeröd O-arbetslösning. Låt cellerna sitta i 5 minuter vid rumstemperatur.</li>
				<li>Skölj cellerna med avjoniserat vatten och observera reaktionen under ett lätt Mikroskop.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Medema, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+the+challenges+ahead.">Cancer stem cells: the challenges ahead.</a> Nature Cell Biology. 15 (4), 338-344 (2013).</li><li>Jordan, C., Guzman, M., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells.">Cancer stem cells.</a> The New England Journal of Medicine. 355 (12), 1253-1261 (2006).</li><li>Jordan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+controversial+or+just+misunderstood?.">Cancer stem cells: controversial or just misunderstood?.</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 203-205 (2009).</li><li>Bapat, S., Mali, A., Koppikar, C., Kurrey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor-like+cells+contribute+to+the+aggressive+behavior+of+human+epithelial+ovarian+cancer.">Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer.</a> Cancer Research. 65 (8), 3025-3029 (2005).</li><li>Charafe-Jauffret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature.">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Research. 69 (4), 1302-1313 (2009).</li><li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells.">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer Cell. 22 (3), 373-388 (2012).</li><li>Reya, T., Morrison, S., Clarke, M., Weissman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cells,+cancer,+and+cancer+stem+cells.">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li><li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+DNA+methylation+of+CD133+in+colorectal+and+glioblastoma+tumors.">Abnormal DNA methylation of CD133 in colorectal and glioblastoma tumors.</a> Cancer Research. 68 (19), 8094-8103 (2008).</li><li>Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome.">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li><li>Garrido, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+history+of+HLA+expression+during+tumour+development.">Natural history of HLA expression during tumour development.</a> Immunology Today. 14 (10), 491-499 (1993).</li><li>Chang, C. C., Campoli, M., Ferrone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classical+and+nonclassical+HLA+class+I+antigen+and+NK+cell-activating+ligand+changes+in+malignant+cells:+current+challenges+and+future+directions.">Classical and nonclassical HLA class I antigen and NK cell-activating ligand changes in malignant cells: current challenges and future directions.</a> Advances in Cancer Research. 93, 189-234 (2005).</li><li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+sarcoma+tumor-initiating+cells+through+differentiation+therapy.">Targeting sarcoma tumor-initiating cells through differentiation therapy.</a> Stem Cell Research. 21, 117-123 (2017).</li><li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ELDA:+Extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays.">ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> Journal of Immunology. 347, 70-78 (2009).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Det finns flera kritiska steg som begränsar framgången för detta protokoll för att isolera och karakterisera tumör-initiera celler från mänskliga sarkom PDXs. Human sarkom innehåller många olika subtyper. Vi observerade att PDX formation är mycket beroende av sarkom subtyper. Kliniska aggressiva sarkom med en histologiskt odifferentierad fenotyp (t. ex., pleomorfa odifferentierade sarkom [framgång Rate 100%, n = 2], dedifferentierad liposarcomas [framgång Rate 100%, n = 2], och LED sarkom [ andelen framgångsrika 100%, n = 3]) har en hög framgång i PDX-bildningen. Under tiden, sarkom med differentierade fenotyper (t. ex., väl differentierade liposarcomas [framgång 0%, n = 3]) visar lägre PDX formation priser. Det är möjligt att tumör-initierande celler är närvarande i mer maligna subtyper på en högre andel än i mindre maligna, differentierade subtyper. Dessutom rekommenderar vi att du avslutar tumörinitierande cell isolerings proceduren inom en dag utan något stopp för att minimera förlust av cellernas lönsamhet.
Vi har identifierat att HLA-1-negativa celler finns mycket i mänskliga sarkom. Men andelen HLA-1-negativa celler kan variera mellan olika patienter. Med den här metoden har vi framgångsrikt isolerat tumör-initierande celler från prover som har HLA-1-negativa celler som sträcker sig från mindre än 0,5% till mer än 30%12. Det är viktigt att karakterisera HLA-1-negativa celler funktionellt genom sfär bildning och tumör formation analyser för att bekräfta tumörinitierande cell identiteten hos isolerade HLA-1-negativa celler.
Det protokoll som presenteras här har dock också begränsningar. Tidigare data visade att HLA-1-uttrycket är epigenetiskt reglerat, vilket är förenligt med observationen av HLA-1-uttryckets cellulära heterogenitet inom samma tumör12. HLA-1-genomiska mutationer upptäcktes i sarkom och andra cancertyper. Mutationer i HLA-1-gener kan leda till fullständig förlust av HLA-1 på cellens yta i hela tumören eller till att uttrycka icke-funktionella muterade HLA-1. I båda fallen, HLA-1 negativitet kan inte användas för att identifiera TICs inom tumören.
Med hjälp av HLA-1 som en negativ markör har vi framgångsrikt isolerat TICs från en mängd olika typer av mänskliga sarkom och validerat våra resultat genom funktionell analys. Således kunde vi utföra molekylära studier inklusive gen uttrycks analys på TICs, för att utveckla specifik behandling riktad mot dessa TICs.

Intratumoral cellulära heterogenitet av mänskliga cancerformer har fått stöd av ökande bevis under det senaste decenniet1. Liknar normal vävnad, cancervävnad består av en liten subpopulation av TICs (även kallad cancer stamceller), som uppvisar tumörbildande förmåga; samtidigt, huvuddelen av cancerceller uppvisar differentierade fenotyper2. Dessa TICs visar stamcells-liknande egenskaper, inklusive uttrycket av en stamcells markör och förmågan hos både självförnyelse och asymmetrisk celldelning, och därmed kan initiera bildandet av en cellulär heterogena tumör3. Nyligen genomförda studier har visat att TICs är inte bara ansvarig för tumör initiering men är också förknippade med tumör aggressivitet4, metastaser5, och läkemedelsresistens6. Därför är det viktigt att förstå TICs biologi och därmed utveckla en specifik behandlingsstrategi som riktar sig till dessa TICs.
FACS-baserade metoder har använts för att identifiera TICs med hjälp av TICs markörer, inklusive CD133, CD24 och CD441. De flesta av dessa markörer uttrycks också i normala stamceller7. Ingen av dessa markörer markerar dock enbart TICs. Rollerna dessa molekyler spelar i malignitet av TICs är fortfarande oklart. Till exempel kan CD133 ofta inaktiveras genom DNA-metylering, och därmed kan denna intertumoral heterogenitet göra riktigheten av dessa markörer8. ALDH1 är en markör som också fungerar för att bibehålla stemness av TICs9. Det verkar vara mer effektivt för att identifiera bröstcancer TICs men är fortfarande tveksamt i andra tumörtyper9. Vissa signalvägar spelar viktiga roller i stamcellsbiologi, inklusive WNT (Wingless-relaterade integration site), TGF-β (omvandla tillväxtfaktor beta), och Hedgehog1. Men det är svårt att bevisa att dessa vägar är TIC-specifika och att använda aktiviteten av dessa vägar för att isolera TICs från primära tumörer. Därför är en tillförlitlig roman TIC markör akut behövs.
Human MHC klass I, även kallad HLA-1, är ett cellytprotein som uttrycks i nästan alla kärn celler10. HLA-1 fungerar som ett antigen som presenterar en molekyl som är specifikt erkänd av CD8 T-celler10. Den cytotoxiska effekten av CD8 T-celler kan aktiveras när cancerceller presentera en tumörantigen av HLA-1. Därför, saknar HLA-1 på cellytan av cancerceller kan leda till en immun flykt från cytotoxiska CD8 T celler. Nedregleringen av HLA-1 har beskrivits i olika typer av Human cancer och är korrelerad med dålig prognos, metastaser och läkemedelsresistens11. Vi har visat att förlusten av HLA-1-uttrycket på cellytan kan användas för att identifiera TICs i sarcomas, samt i prostatacancer6,12.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att isolera TICs från mänskliga sarkom PDXs av FACS, med hjälp av HLA-1 som en negativ markör, och för att ytterligare validera och karakterisera dessa HLA-1-negativa TICs.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:708px;" width="708">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:300px;">0.2 &#956;m cell culture filter</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:119px;">450-0020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">100 mm Petri dish</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">15 mL conical tube</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">35 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">50 mL polystyrene tube</td>
			<td style="width:123px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">96-well ultra-low attachment cell culture plate</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">7007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Alizarin Red S&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">B-27</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">08-0085SA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">bFGF</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">PHG0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">dexamethasone</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">EGF</td>
			<td style="width:123px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">PHG0311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">HLA-1-PE antibody&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Abcam</td>
			<td>ab43545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">hMSC growth medium</td>
			<td style="width:123px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">PCS-500-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">indomethacin</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">isobutylmethylxanthine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I5879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">isopropanol</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">W292907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:300px;">Isotype Control Antibody</td>
			<td style="width:123px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab103534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">L-ascorbic acid&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5960</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">lithium chloride&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">62476</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Matrigel basement membrane matrix&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">354230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:300px;">MEM Alpha</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">N2</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">NSG mice</td>
			<td style="width:123px;">The Jackson Lab</td>
			<td style="width:119px;">005557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Oil Red O&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">O0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">PBS</td>
			<td style="width:123px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">RPMI 1640&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;width:300px;">Syringe with needle</td>
			<td style="width:123px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">309626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">&#946;-glycerophosphate</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of tumor-initiating cells from sarcoma patient-derived xenografts

Förekomsten och betydelsen av tumör-initierande celler (TICs) har fått stöd av ökande bevis under det senaste decenniet. Dessa TICs har visat sig vara ansvarig för tumör initiering, metastaser, och läkemedelsresistens. Därför är det viktigt att utveckla specifika TIC-targeting terapi utöver nuvarande kemoterapi strategier, som främst fokuserar på merparten av icke-TICs. För att ytterligare förstå mekanismen bakom malignitet av TICs, beskriver vi en metod för att isolera och karakterisera TICs i mänskliga sarcomas. Häri visar vi ett detaljerat protokoll för att generera patient-härledda xenograft (pdxs) av mänskliga sarkom och att isolera TICs genom fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) med hjälp av humant leukocytantigen klass I (HLA-1) som en negativ markör. Dessutom beskriver vi hur man funktionellt karakterisera dessa TICs, inklusive en sfär formation analys och en tumör formation assay, och att framkalla differentiering längs mesenkymala vägar. Isoleringen och karaktäriseringen av PDX TICs ger ledtrådar för upptäckten av potentiella mål terapi reagenser. Dessutom tyder ökande bevis på att detta protokoll kan utvidgas ytterligare för att isolera och karakterisera TICs från andra typer av mänskliga cancerformer.

En mänsklig sarkom PDX genererades och färgas. Intratumoral heterogenitet visades av immunohistokemi med HLA-1 antikropp. Xenografatet bestod av två distinkta subpopulationer, nämligen HLA-1-positiva och negativa (figur 1a)12. Den sarkom PDX visade histologiska likheter med föräldrarnas primära tumör (figur 1a). Sarcoma PDX TICs isolerades av FACS. Med hjälp av en dubbel sorteringsmetod, var HLA-1-negativa celler starkt berikade från föräldra cellpopulationen (figur 1b)12.
Gener uttryckta i stamceller (t. ex. Oct4, nanog och MYC) konstaterades vara starkt uttryckta i isolerade HLA-1-negativa celler jämfört med deras HLA-1-positiva motsvarighet (figur 1c). SOX-9, en utvecklings-gen rapporterade att spela viktiga roller i andra cancer stamceller, såsom i bröstcancer, uttrycktes särskilt i HLA-1-negativa celler (figur 1d).
För att validera isolerade HLA-1-negativ subpopulation, en sarcosphere formation assay utfördes för att undersöka självförnyelse förmåga cellerna. HLA-1-negativa celler kunde bilda sfärer med en initial inmatning av så lite som 10 celler (figur 1e)12. För att undersöka tumörbildande förmåga, en seriell-utspädning tumör-formation assay utfördes. Samma antal HLA-1-negativa och positiva celler injicerades subkutant i varje flank av samma mus. HLA-1-negativa celler uppvisade en signifikant högre tumör bildnings förmåga (figur 1f)12, medan xenografter som bildas av både HLA-1-negativa och positiva subpopulationer var cellulära heterogena tumörer (figur 1H).
Vi utförde en gen uttrycks analys av de isolerade HLA-1-negativa TICs12. Gener förknippade med normal mesenkymala celldifferentiering höjdes i TICs12. Således testade vi också om HLA-1 TICs kan induceras till Terminal differentiering och resultera i en minskad tumör bildning förmåga. Resultaten visade att HLA-1-negativa celler kan induceras för att differentiera längs både lipogena och Osteogena vägar och Visa stark olja röd O och alizarin Röd S färgning (figur 1G). HLA-1-positiva celler skiljer sig däremot inte under samma förhållanden. Sålunda, dessa resultat indikerar en lovande differentierad terapi strategi som kan användas för att rikta sarkom TICs.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig1.jpg"> Figur 1: isolering av HLA-1-negativa celler från intratumorala heterogena sarkom PDXs. (A) HLA-1-negativa celler (pilar) hittades i olika subtyper av Human sarkom av immunohistokemi (IHC). (a och b) Rensa cell sarkom. (c och d) Pleomorphic liposarkom. (e och f) Leiomyosarkom. (g och h) Malign perifer nerv mantel tumör. (i och j) Liposarkom, inte annat specificerat. (k och l) Dedifferentierad liposarkom. Skalstapel = 100 μm. (B) sarkom pdxs histologiskt liknar den föräldra tumör (hematoxylin och eosin [H & E] fläcken) och visade cellulära HETEROGENITET i HLA-1 uttryck av IHC. Här visas representativa bilder av sarkom pdxs, inklusive en klar cell sarkom (CCS), en dedifferentierad kondrosarkom (DCS), och en dedifferentierad liposarkom (DDL). Skalstapel = 100 μm.C) SUBPOPULATIONEN av HLA-1-negativa celler isolerades med flödescytometri med en dubbel sorteringsmetod. Uppifrån och ned: första sortering, andra sorterings-och renhetskontroll. Isolerade HLA-1-negativa och HLA-1-positiva celler utsattes för en efterföljande funktionell analys, inklusive en tumörbildande analys. Resultaten från denna siffra är från en tidigare publikation12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig2.jpg"> Figur 2: karakterisering av HLA-1-negativa TICs genom funktionella analyser. Aen sfär bildnings analys visade att så få som 10 HLA-1-negativa celler kunde bilda sarkom-sfärer. Vänster: representativa bilder av sarkom sfärer. Höger: sfär-formnings frekvens; medelvärde ± SD. Scale bar = 100 μm.B) HLA-1-negativa celler som isolerats från sarkom PDX var mycket tumorigena. Här visas representativa bilder av tumören som bildas av HLA-1-negativa och-positiva celler från DDL. Tusen celler av HLA-1-negativa och HLA-1-positiva DDL-celler injicerades i separata flanker av samma mus. (C) mRNA-nivåerna för stamcellsgener Oct4, nanogoch MYC uttrycktes på högre nivåer i HLA-1-negativa celler jämfört med HLA-1-positiva celler. Data representerar medelvärdet ± SD (n = 5). (D) stark positiv färgning av olja röd O och alizarin Red S visar en Terminal differentiering längs lipogena och Osteogena vägar som induceras från sarkom TICs. E) HLA-1-immunofärgning av pdxs som bildas av HLA-1-positiva (vänster) och-negativa (högra) subpopulationer. Skalstapel = 100 μm. Resultaten från denna siffra är från en tidigare publikation12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts at JoVE.com

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

Vi beskriver ett detaljerat protokoll för isolering av tumör-initierande celler från humana sarkom-patientbaserade xenografter genom fluorescensaktiverad cell sortering, med humant leukocytantigen-1 (HLA-1) som en negativ markör, och för ytterligare validering och karakteriseringen av dessa HLA-1-negativa tumör-initierande celler.

Isolering och karakterisering av tumör-initiera celler från sarkom patient-derived xenografts

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

Vi upptäckte att HLA-I är epigenetically ner regleras i en subpopulation av cancerceller som uppvisar stamceller egenskaper och tumör-initierande kapacitet. HLA-I nedreglering är direkt relaterad till immun flykt, vilket ger överlevnad fördelar för cancer stamceller, därför gör HLA-I negativitet en korrekt funktionell markör för dessa celler. Demonstrera förfarandet kommer att Sudeh Izadmehr, en postdoc från vårt laboratorium.Vid förvärvet av provet, placera vävnaden i en 100-millimeters Petri-skålen i en steriliserad bio säkerhetsskåp, och tillsätt 500 mikroliter av sterila PBS till skålen. Använd en steril skalpell för att mekaniskt triturera vävnaden i små bitar tills inget fragment är större än 0,1 millimeter. Överför hela 500-mikrolitervolymen av PBS genom en 35-mikrometer porcellsil till ett koniskt rör på 50 milliliter.Tillsätt ytterligare 500 mikroliter pbs till vävnadsfragmenten och finhacka vävnaderna igen. Filtrera sedan supernatanten genom cellsilen i samma uppsamlingsrör, och fortsätt att finhacka vävnadsbitarna tills provet är helt dissocierat. När den sista volymen av celler har samlats in, snurra ner tumörcellerna genom centrifugeringen, och åter avbryta pelleten i fem milliliter av hemolys buffert.Efter fem minuter i rumstemperatur, samla cellerna med en annan centrifugering, och tvätta pelleten med ytterligare fem milliliter PBS. Åter upphäva pelleten i en milliliter av PBS, och räkna livskraftiga celler. Späd cellerna till en en gånger 10 till de sjunde cellerna per 200 mikroliter av PBS koncentration på is, och tillsätt 200 mikroliter av källaren membran matris till cellerna med mild blandning.Injicera sedan cellen suspension-källaren membran matris subkutant i flanken av en NOD scid gamma mus, och kontrollera tillväxten av tumören vid injektionsstället två gånger i veckan. När tumören når en centimeter i diameter, skär tumören i hälften, och fix hälften av xenograft med 4%paraformaldehyd över natten för histologisk analys. Bearbeta den andra halvan av tumören som just visat att uppnå en enda cell suspension, och späda cellerna till en två gånger 10 till de sex cellerna per milliliter PBS kompletteras med 5%FBS koncentration.Underhåll cellerna på is i 30 minuter innan cellupphängningen mellan en isotypkontroll och ett antikroppsrör divideras. Notera antalet celler i varje rör, och blanda cellerna i antikroppsröret med anti-HLA-antikropp och cellerna i isotypkontrollröret med en lämplig anti-isotypkontrollantikropp för en 90-minuters inkubation på is. I slutet av inkubationen, samla båda cellpopulationerna genom centrifugeringen, följt av två 10-milliliter PBS tvättar genom centrifugeringen.Efter den andra tvätten, åter upphäva pellets i 10 mikrogram per milliliter av DAPI till en gånger 10 till de sju cellerna per milliliter koncentration. Filtrera sedan varje cellupphängning genom en 35-mikrometer porsil till enskilda 12-by-75-millimeters polystyrenrör. Efter fluorescens-aktiverad cellsortering, späd HLA-I-negativa och positiva cellpopulationer till enskilda en gånger 10 till den femte cellkoncentrationerna i 15 milliliter av sarcosfärens tillväxtmedium per delmängd.Seriellt späd cellerna till en gånger 10 till den fjärde, 10 till den tredje, och 10 till den andra koncentrationerna i 15 milliliter av färska sarcosfär tillväxt medium per spädning, och tillsätt 100 mikroliter celler från varje utspädning till varje brunn av en 96-väl ultra-låg fäst cellsodling tallrik per spädning. Placera plattorna i en 37-graders Celsius, 5% koldioxid cell kultur inkubator, övervaka sarcosphere bildning dagligen genom lätt mikroskopi och lägga till färska grundläggande fibroblast tillväxtfaktor och epidermal tillväxtfaktor till varje brunn utan att ändra mediet var tredje dag. Efter tre veckor, räkna antalet sarcosphere-positiva och sarcosphere-negativa brunnar för varje cell utspädning av både HLA-I-negativa och HLA-I-positiva celler för att möjliggöra beräkning av den sfärbildande cellfrekvensen baserat på en Poisson sannolikhetsfördelning.Typiskt, mänskliga patient-härledda sarkom xenografts består av två distinkta HLA-I-positiva och negativa populationer, med en liknande histologi som visats av den föräldraprimär tumör. Fluorescence-aktiverad cell sortering av sarkom patient-härledda xenograft tumör-initiera celler som visat underlättar anrikning av ett högt antal HLA-I-negativa celler från den parental cell befolkningen. HLA-I-negativa celler kan bilda sfärer med en inledande ingång på så lite som 10 celler och uppvisar en högre tumör bilda förmåga än HLA-I-positiva sarkom patienten anlände xenograft tumör-initiera celler.Injektion av samma antal HLA-jag negativa och positiva celler subkutant i motsatta flankerna av samma mus visar att HLA-I-negativa celler har en betydligt högre tumör bildas förmåga. Medan xenografts bildas av både HLA-I negativa och positiva subpopulationer är cellularly heterogena tumörer. Vidare, gen uttryck analys av tumör-initierande celler visar att HLA-I-negativa celler uttrycker stamceller differentiering markörer och kan induceras att differentiera längs både lipogena och osteogenic vägar, visar stark Oil-Red-O och Alizarin-Red-S färgning och kultur.Denna metod kan användas för att isolera cancer stamceller i olika mänskliga cancerformer. Molekylär karbonisering, till exempel genom nästa generations sekvensering kan avslöja vanliga markörer för att rikta cellerna terapeutiskt. Vår upptäckt visar att återställandet av HLA-I är ett kritiskt steg för framgång en funktionell enhet immuncell augmentation strategier.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Labeling of Breast Cancer Patient-derived Xenografts with Traceable Reporters for Tumor Growth and Metastasis Studies

Märkning av bröstcancerpatient som härrör xenografter med spår Reportrar för tumörtillväxt och metastas studier

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many ...

Establishment of a Primary Culture of Patient-derived Soft Tissue Sarcoma

Inrättandet av en primär kultur av patientderiverade mjukdelssarkom

Soft tissue sarcomas (STS) represent a spectrum of heterogeneous malignancies with a difficult diagnosis, classification, and management. To date, more ...

Flow Cytometry to Estimate Leukemia Stem Cells in Primary Acute Myeloid Leukemia and in Patient-derived-xenografts, at Diagnosis and Follow Up

Flödescytometri för att uppskatta leukemi stamceller i primär akut myeloisk leukemi och i Patient-härrör-xenograft, vid diagnos och följa upp

Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogeneous, and if not treated, fatal disease. It is the most common cause of leukemia-associated mortality in ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modeling osteosarkom med Li-Fraumeni syndrom patientderiverade inducerade pluripotenta stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Physiologic Patient Derived 3D Spheroids for Anti-neoplastic Drug Screening to Target Cancer Stem Cells

Fysiologisk patient härledda 3D spheroids för anti-neoplastisk drog screening för att rikta cancer stamceller

In this protocol, we outline the procedure for generation of tumor spheroids within 384-well hanging droplets to allow for high-throughput screening of ...

Isolation and Characterization of Patient-derived Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Organoid Models

Isolering och karakterisering av patient-derived bukspottskörteln ductal adenocarcinom Organoid modeller

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is amongst the most lethal malignancies. Recently, next-generation organoid culture methods enabling the ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Testa riktade terapier i cancer med strukturell DNA-ändringsanalys och patientbaserade Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Enhanced Viability for Ex vivo 3D Hydrogel Cultures of Patient-Derived Xenografts in a Perfused Microfluidic Platform

Förbättrad livskraft för Ex vivo 3D Hydrogel Kulturer av patient-derived Xenografts i en Perfused mikrofluidisk plattform

Patient-derived xenografts (PDX), generated when resected patient tumor tissue is engrafted directly into immunocompromised mice, remain biologically ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Läkemedelsscreening av primär patient härledd tumör Xenografts i Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

Establishing 3-Dimensional Spheroids from Patient-Derived Tumor Samples and Evaluating their Sensitivity to Drugs

Etablera 3-dimensionella sfäroider från patient-härledda tumörprover och utvärdera deras känslighet för läkemedel

Despite remarkable advances in understanding tumor biology, the vast majority of oncology drug candidates entering clinical trials fail, often due to a ...