Name: ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture
Uploaded: 2018-10-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

بتأييد هذا العمل بمنح من بيلت مؤسسة بلانسيفلور بونكومباني Ludovisi ني (http://blanceflor.se/)، وأطباء المؤسسة السويدية ضد الإيدز (http://www.aidsfond.se/، الرقم FOa2014-0006)، واندريا Fondazione ه لوريني الليبي (http ://fondazionelorini.it/) إلى إينترويني أندريا.

البروتوكول المتعلق بمجموعة من الأنسجة البشرية قد تتطلب الموافقة الأخلاقية من السلطات المحلية المختصة. وفي حالة العمليات الجراحية المشار إليها مثل استئصال اللوزتين واستئصال الرحم، لا تكون العينات التي تم جمعها خصيصا لغرض البحث والدراسة لا تعتبر البحوث على البشر (المعاهد الوطنية للصحة. ا...

<ol>
	<li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+HIV-1+phenotype+switch+as+a+causal+factor+in+acquired+immunodeficiency.">Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency.</a> Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).</li><li>Dezzutti, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+and+human+mucosal+tissue+models+to+study+HIV+biomedical+interventions:+can+we+predict+success.">Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success.</a> J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).</li><li>Lederman, M. M., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+node+in+HIV+pathogenesis.">The lymph node in HIV pathogenesis.</a> Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).</li><li>Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reservoirs+as+obstacles+and+opportunities+for+an+HIV+cure.">HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure.</a> Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induced+activation+of+CD4++T+cells+creates+new+targets+for+HIV-1+infection+in+human+lymphoid+tissue+ex+vivo.">HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo.</a> Blood. 111 (2), 699-704 (2008).</li><li>Van Laar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+secretion+of+immunoglobulin+by+long-lived+human+tonsil+plasma+cells.">Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells.</a> Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).</li><li>Introini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminal+plasma+induces+inflammation+and+enhances+HIV-1+replication+in+human+cervical+tissue+explants.">Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants.</a> PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).</li><li>Grivel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+CCR5-+but+not+CXCR4-tropic+HIV-1+in+lymphoid+tissue+by+human+herpesvirus+6.">Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6.</a> Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).</li><li>Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type-2+stimulates+HIV-1+replication+in+cervical+tissues:+implications+for+HIV-1+transmission+and+efficacy+of+anti-HIV-1+microbicides.">Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).</li><li>Lisco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+is+activated+into+a+HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+in+herpesvirus-infected+human+tissues.">Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues.</a> Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).</li><li>Vanpouille, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+anti-cytomegalovirus+drug,+ganciclovir,+inhibits+HIV-1+replication+in+human+tissues+ex+vivo.">A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo.</a> AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).</li><li>Andrei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+tenofovir,+a+microbicide+effective+against+HIV,+inhibits+herpes+simplex+virus-2+replication.">Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication.</a> Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).</li><li>Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+human+immunodeficiency+virus+infection+of+human+cervical+tissue+and+inhibition+by+vaginal+virucides.">Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides.</a> J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+sexual+transmission:+early+events+of+HIV-1+infection+of+human+cervico-vaginal+tissue+in+an+optimized+ex+vivo+model.">HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model.</a> Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+facilitates+HIV-1+transmission+to+cervico-vaginal+tissue+ex+vivo.">Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo.</a> PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+and+dynamic+immunofluorescent+cytometric+bead+assay+for+the+detection+of+HIV-1+p24.">A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24.</a> J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).</li><li>Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=War+and+peace+between+microbes:+HIV-1+interactions+with+coinfecting+viruses.">War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses.</a> Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).</li><li>Keele, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection.">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).</li><li>Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+microenvironments+in+the+human+vagina+and+cervix:+mediators+of+cellular+immunity+are+concentrated+in+the+cervical+transformation+zone.">Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone.</a> Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).</li><li>Ganor, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within+1h,+HIV-1+uses+viral+synapses+to+enter+efficiently+the+inner,+but+not+outer,+foreskin+mucosa+and+engages+Langerhans-T+cell+conjugates.">Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).</li><li>Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R5+HIV-1+envelope+attracts+dendritic+cells+to+cross+the+human+intestinal+epithelium+and+sample+luminal+virions+via+engagement+of+the+CCR5.">R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+testing+of+candidate+topical+microbicides+for+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity+and+tissue+toxicity+in+a+human+cervical+explant+culture.">Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+colorectal+explant+culture+to+evaluate+topical+microbicides+for+the+prevention+of+HIV+infection.">A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection.</a> J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Productive+HIV-1+infection+of+human+cervical+tissue+ex+vivo+is+associated+with+the+secretory+phase+of+the+menstrual+cycle.">Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle.</a> Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).</li></ol>

استخدام الأنسجة البشرية explants لدراسة الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 يوفر مزايا أكثر من مونوتيبيك وثنائي الأبعاد التجريبية النظم التقليدية، مثل الخلايا الأولية أو خطوط الخلايا، سبب قدرتهم الفائقة على استنساخ التفاعلات بين الخلايا و الوظائف الخلوية (مثلاً، إنتاج سيتوكين) كما ال...

لا تراعي الثقافات monotypic خلية ثنائية الأبعاد، يشار هنا إلى التقليدية، للاتصال المكانية والوظيفية بين مجموعة كبيرة ومتنوعة من أنواع الخلايا التي تؤلف الأنسجة والأجهزة. هذا الجانب من الأهمية بالنسبة لنماذج تجريبية للمرض، كما تدخل في التفاعلات بين الخلايا التماثل الساكن هو العوامل الدافعة لجميع الأمراض. الأنسجة explants تتيح المزايا الرئيسية للنمذجة الصحة والمرض في البشر نظراً لأنها تحتفظ سيتوارتشيتيكتوري والعديد من الجوانب الفنية الهامة من الأجهزة كما الحال في فيفو، على الرغم من أن لكمية محدودة من الوقت1. على سبيل المثال، عند السابقين فيفو التحدي مع المستضدات التذكير، مثل توكسيد الدفتيريا أو الكزاز، تستجيب الأنسجة تونسيلار بإنتاج أجسام مضادة محددة مستضد2قوية. مثل أي أخرى السابقين فيفو النموذجي، هيستوكولتوري لها حدودها الخاصة: تقلب بين الوكالات المانحة، والأنسجة الاستقطاب وبقاء الأنسجة محدودة، وصعوبة في رصد الخلايا يتجاوز عمق مجهرية [كنفوكل]1. ومع ذلك، تظل explants الأنسجة البشرية نموذجا لاختيار دراسة العمليات المناعية التماثل الساكن والمسببة للأمراض في البشر، بما في ذلك التفاعلات المضيف الممرض و التدخلات العلاجية المحتملة3.
الأحداث الحرجة لأمراض فيروس نقص المناعة البشرية-1 تجري في الأنسجة. عدوى الغشاء المخاطي للأعضاء التناسلية للإناث تمثل أغلبية جميع فيروس نقص المناعة البشرية-1 انتقال الأحداث في جميع أنحاء العالم4. الأنسجة اللمفاوية هو الموقع الرئيسي للنسخ المتماثل الفيروس أثناء الإصابة الحادة وتؤوي مجموعة كبيرة من الخلايا المصابة خفية5، وثباتها يمثل العقبة الرئيسية أمام تحقيق علاج6. تحدي الثقافة و السابقين فيفو الأنسجة اللمفاوية والأغشية المخاطية البشرية توفر بعض المزايا على النظم التقليدية القائمة على الخلايا المعزولة للدراسة لفيروس نقص المناعة البشرية-1. على سبيل المثال، يمكن أن تدعم خلايا الأنسجة-المقيم العدوى بفيروس نقص المناعة البشرية-1 في غياب التنشيط الخارجية، بدلاً من الدم المحيطي الخلايا وحيدات النوى1. وقد يسمح باستخدام الأنسجة اللمفاوية explants فهم أفضل لبعض الآليات الرئيسية الكامنة وراء CD4 تي خلية استنزاف، أي، تأثير متفرجا7، وهي السمة المميزة للإصابة الحادة. الحفاظ على هياكل مثل المسام بالخليه في الأنسجة اللمفاوية8 والظهاره في الغشاء المخاطي الأعضاء التناسلية للإناث explants9 يوفر فرصة فريدة لدمج الميزات المكانية والوظيفية للإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 في هذه المواقع. وأخيراً، هيستوكولتوريس استخدمت بنجاح للنموذج ودراسة فيروس نقص المناعة البشرية-1 وهربس الإصابة المشتركة10،11، وكذلك للتجارب الإكلينيكية من مولتيتارجيت ومضادات الميكروبات12، 13 , 14 , 15.
هنا، نحن وصف بروتوكول مفصلة لثقافة explants الأنسجة البشرية التي تم الحصول عليها من اللوزتين والأنسجة المخاطية من انخفاض الأنثى التناسلي (عنق الرحم)، تغطي تشريح الأنسجة explant التحدي مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 بطريقة غير الاستقطاب. ثقافة الأنسجة explants في واجهة الهواء السائل، استخدام الأسفنج الجيلاتين كدعم، يزيد من التعرض للهواء الأكسجين مع توفير إمكانية الوصول إلى المواد الغذائية المتوسطة الثقافة من خلال الأسفنج الشعيرات الدموية، مما أدى إلى تأخير عن الاضمحلال الطبيعي. الطريقة الأكثر مباشرة لتقييم فيروس نقص المناعة البشرية-1 النسخ المتماثل في نظامنا لقياس كمية الفيروس أصدرته المناعة أو qPCR في الأجلين المتوسط والثقافة explant على مر الزمن. الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 والمرضية (مثلاً.، استنفاد الخلايا CD4 T) يمكن أيضا تقييم في الأنسجة explants بالجملة استخراج الحمض النووي الريبي/الحمض النووي وقبكر في الموقع تلطيخ أو تحليل خلية واحدة عند الهضم الأنسجة بالتدفق الخلوي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:941px;" width="940">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Pfizer</td>
			<td style="width:141px;">NDC:&#160; 0009-0315-08</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">SPONGOSTAN Standard 70 &#215; 50 &#215; 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge</td>
			<td>Ferrosan Medical Devices</td>
			<td>MS0002</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">RPMI 1640 with phenol red and glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Modified Eagle&#39;s medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sodium pyruvate, 100 mM (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Gentamicin 50 mg/mL (1000x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15750037</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Amphotericin B 250 &#956;g/mL (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:49px;width:280px;">Ticarcillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5639-1G</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:280px;">Potassium clavulanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33454-100MG</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:280px;">Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;">To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile cell culture grade water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile transportation container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Disinfectant solution for biological waste disposal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal forceps or tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile flat weighing metal spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile scalpels and blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">6-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">12-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Petri dish, 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>510</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>2522</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Lamivudine (3TC)</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>8146</td>
			<td style="width:345px;">Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:280px;">Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 &#176;C, 5% CO2, &#8805; 90% humidity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Water bath set at 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 &#176;C, 300 rpm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture

هيستوكولتوريس السماح بدراسة التفاعلات بين الخلايا داخل الأنسجة البشرية، وأنها يمكن أن تستخدم لنموذج المضيف الممرض التفاعلات تحت ظروف المختبر التي تسيطر عليها. السابقين فيفو العدوى للأنسجة البشرية مع فيروس نقص المناعة البشرية (الفيروس)، وبين غيرها من الفيروسات، قد استخدمت بنجاح للتحقيق في أوائل المرض المرضية، فضلا عن منصة لاختبار مدى فعالية وسمية العقاقير المضادة للفيروسات. في هذا البروتوكول، نشرح كيفية معالجة وتصيب بفيروس نقص المناعة البشرية-1 الأنسجة explants من اللوزتين البشرية وعنق الرحم موكوساي، والحفاظ عليها في الثقافة على رأس الأسفنج الجيلاتين في واجهة الهواء السائل لمدة أسبوعين تقريبا. هذا الإعداد غير الاستقطاب الثقافة إلى أقصى حد الوصول إلى المواد المغذية في الثقافة المتوسطة والأكسجين، على الرغم من الفقدان التدريجي لسلامة الأنسجة والبنى الوظيفية ويظل قصره الرئيسي. يسمح هذا الأسلوب لرصد فيروس نقص المناعة البشرية-1 تكرارها والمرضية باستخدام العديد من التقنيات، بما في ذلك تحديدكم، قبكر، والتدفق الخلوي. من الأهمية، أن التغير الفسيولوجي بين المانحين الأنسجة، وكذلك بين اكسبلانتس من مناطق مختلفة من نفس العينة، قد تؤثر تأثيراً كبيرا على النتائج التجريبية. للتأكد من إمكانية تكرار نتائج نتيجة، من الأهمية بمكان استخدام عدد كاف من اكسبلانتس، replicates التقنية وشروط مراقبة مطابقة الجهات المانحة لتطبيع نتائج العلاجات التجريبية عند جمع البيانات من تجارب متعددة (أي .، ويجري استخدام أنسجة من مختلف الجهات المانحة) للتحليل الإحصائي.

يمكن استخدام العديد من التقنيات لتقييم فيروس نقص المناعة البشرية-1 تكرارها في الأنسجة explants. القراءة لدينا معيار لقياس الكمية من فيروس نقص المناعة البشرية-1 p24اسكت صدر في سم على مر الزمن مع المناعة18.
الأنسجة explants من مختلف...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

العدوى للأنسجة البشرية مع فيروس نقص المناعة البشرية (فيروس الإيدز) السابقين فيفو يوفر نموذج ثلاثي الأبعاد قيماً من الفيروسات المرضية. هنا، يمكننا وصف بروتوكولا للعملية وتصيب عينات الأنسجة من اللوزتين البشرية وماكس تشويه الأعضاء التناسلية للإناث مع فيروس نقص المناعة البشرية-1 والمحافظة عليها في الثقافة في واجهة الهواء السائل.

السابقين فيفو التهاب الغشاء المخاطي للأعضاء التناسلية أنثى والأنسجة اللمفاوية البشرية مع فيروس نقص المناعة البشرية 1 وهيستوكولتوري

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال فيروس نقص المناعة البشرية، مثل تحديد محددات انتقال الفيروس والتهيئات المرضية في اثنين من أكثر الأعضاء إصابة بالعدوى. في الواقع، فإن تطور مرض القيادة المتقدمة الرئيسية يحدث في الأنسجة. وتنعكس خصائص وتعقيدات العدوى بشكل سيئ من قبل الخلايا في الدورة الدموية أو معزولة والمصابة في المختبر.الميزة الرئيسية لثقافة الأنسجة الحية السابقة لدراسة مرض فيروس نقص المناعة البشرية هو أنه يحتفظ بعلاقاتها الأصلية spacial والوظيفية بين الخلايا على الرغم من أن لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع. للبدء، ملء 100 ميلمتر من قبل 20 ملليمتر طبق بيتري مع 20 إلى 30 ملليلتر من CMT. نقل الإسفنج الجيلاتين في طبق بيتري باستخدام ملقط معقمة.الرطب الإسفنج على كلا الجانبين والسماح للإسفنج لامتصاص المتوسطة لمدة دقيقة واحدة. اضغط على الإسفنج ضد الجزء السفلي من طبق بيتري لمدة دقيقتين تقريبا باستخدام ملعقة معقمة. استخدام مقص معقمة لقطع الإسفنج الجيلاتين rehydrated إلى قطع متساوية الحجم من حوالي سنتيمتر مربع واحد.ثم استخدام ملقط لنقل قطعة واحدة من الإسفنج في كل بئر من لوحة الثقافة. إضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من CMT في كل بئر من لوحة 6-جيدا اللوزتين وميليلتر واحد في بئر في لوحة 12 جيدا لرشق الرحم. ضع اللوحات في الحاضنة، التي تم تعيينها عند 37 درجة مئوية، 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وأكبر من أو تساوي رطوبة 90٪، حتى تكون الأنسجة جاهزة للتحميل على الإسفنج.نقل اللوزتين من حاوية النقل إلى 100 ملليمتر طبق بيتري تحتوي على 10 إلى 20 ملليلتر من CMT باستخدام ملقط معقمة. استخدم غطاء طبق بيتري كسطح قطع لتشريح الأنسجة. عقد الأنسجة بلطف مع ملقط، وقطع كل لوزة إلى قطع مختلفة، كبيرة باستخدام مشرط عقيمة وشفرة.استخدام ملقط ومشرط لإزالة الكي، والأنسجة الدموية، والأورام الليفية، فضلا عن أي أجزاء تحتوي على tonsilloliths أو اللون البني المخضر. قطع كل قطعة الأنسجة إلى شرائح من حوالي مليمترين في سمك. إزالة أي جزء غير مرغوب فيه كما في الخطوة السابقة.ثم قطع شرائح الأنسجة إلى شرائط بسمك 2 مليمتر. وأخيراً، قطع شرائط الأنسجة إلى كتل بسمك 2 مليمتر. نقل explants في طبق جديد من 100 ملليمتر بيتري يحتوي على 10 إلى 20 ملليلتر من CMT لتجنب جفاف الأنسجة أثناء المضي قدما في تشريح.في نهاية التشريح، دوامة لوحة لتعشية توزيع explant. ضع تسعة أنسجة على رأس كل إسفنجة الجيلاتين في لوحة 6-جيدا باستخدام ملقط، مما يسمح الفضاء بينهما. أعيدوا الأطباق إلى الحاضنة.عادة، يتم زراعة explants بين عشية وضحاها. يتم إجراء التلقيح مع فيروس نقص المناعة البشرية في اليوم التالي. هذا هو للتأكد من أن أي تلوث البكتيرية أو الفطرية يتطور في الثقافة.أيضا، الخلايا تميل إلى تراجع الأنسجة explants مباشرة بعد تشريح. استلهم الوسط في لوحة 6-جيدا مع ماصة، والتخلص منه في وعاء مع محلول مطهر. إمالة لوحة ودفع بلطف الإسفنج الجيلاتين إلى الجزء العلوي من البئر للسماح للوسط لجمع في الجزء السفلي.التعرق وتجاهل المتوسطة. ثم إضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من CMT إلى كل بئر. الآن ذوبان إعداد فيروس نقص المناعة البشرية-1 في حمام الماء في 37 درجة مئوية.Pipette الفيروس inoculum مباشرة على رأس كل من 9 explants على الإسفنج الجيلاتين. أعيدوا الصحن إلى الحاضنة. استخدم غطاء طبق بيتري كسطح قطع لتشريح الأنسجة.عقد الأنسجة بلطف مع ملقط، وفصل الغشاء المخاطي لل ectocervix و / أو endocervix من تحت السترومال و submucosa مع مشرط وشفرة للحصول على شرائط من الغشاء المخاطي. قطع الغشاء المخاطي إلى شرائط بعرض 2 ملليمتر. إزالة والتخلص من أكبر قدر ممكن submucosa، وترك فقط طبقة من الأنسجة سمكها 2 ملليمتر.ثم قطع الشرائط إلى كتل بسمك 2 مليمتر. نقل الأنسجة explants في جديد 100 ملليمتر بتري طبق يحتوي على 10 إلى 20 ملليلتر من CMT لتجنب جفاف الأنسجة أثناء المضي قدما في تشريح. في نهاية التشريح، دوامة لوحة لتعشية توزيع explant.مع ملقط معقمة، ونقل explants في أنابيب مخروطية معقم 1.5 ملليلتر. إزالة أي وسيلة في أنبوب باستخدام ماصة. للحصول على أفضل النتائج، يجب معالجة explants من عنق الرحم والمصابين في أقرب وقت ممكن بعد الجراحة، ومن الناحية المثالية يوم الجراحة.بدلا من ذلك، يمكن تخزين الأنسجة المغمورة في CMT في 4 درجات بين عشية وضحاها والمصابة مباشرة بعد تشريح. اذيب إعداد فيروس نقص المناعة البشرية-1 في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. بمجرد إذابة، نقل الفيروس إلى الأنابيب التي تحتوي على explants.نقل الأنابيب إلى شكل حراري، واحتضان لمدة ساعتين في 37 درجة مئوية هزاز في 300 دورة في الدقيقة. عكس بلطف الأنابيب عدة مرات كل 30 إلى 60 دقيقة. وفي الوقت نفسه، ملء لوحة 6-جيدا مع ثلاثة إلى أربعة ملليلتر في بئر من الفوسفات المعقم المالحة المخزنة.في نهاية الحضانة مع فيروس نقص المناعة البشرية-1، واستخدام ماصة للتخلص من جميع إعداد الفيروس في الأنابيب التي تحتوي على explants في حاوية مع محلول مطهر. ثم استخدام ملقط وماصة لنقل explants في لوحة 6-جيدا تحتوي على برنامج تلفزيوني. بعد السماح explants للراحة في برنامج تلفزيوني لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة، وغسلها عن طريق الأنابيب بلطف برنامج تلفزيوني صعودا وهبوطا في البئر مرتين إلى ثلاث مرات.ثم تجاهل برنامج تلفزيوني في وعاء مع محلول مطهر باستخدام ماصة. إضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من برنامج تلفزيوني جديد لكل بئر. كرر مرتين أكثر لمجموع ثلاثة يغسل.تجاهل برنامج تلفزيوني فقط قبل نقل explants إلى الإسفنج لتجنب جفاف الأنسجة. الآن استخدام ملقط لنقل خمسة إلى ثمانية explants على رأس كل الإسفنج الجيلاتين في لوحة 12 جيدا. أعيدوا الصحن إلى الحاضنة.جمع عينة من المتوسطة الثقافة مع ماصة، ونقلها إلى العقيمة 1.5 أو اثنين من أنابيب غطاء المسمار ملليلتر للتخزين في ناقص 80 درجة مئوية. حصاد النسيج explants مع ملقط معقمة، ونقل explants إلى العقيمة 1.5 أو اثنين من أنابيب غطاء المسمار ملليلتر. معالجة أو تخزين عينات الأنسجة كما هو مطلوب من التجربة.استلهمي الوسيلة الثقافية المتبقية في البئر مع ماصة، وتجاهلها في حاوية مع محلول مطهر. إمالة لوحة ودفع بلطف الإسفنج الجيلاتين إلى الجزء العلوي من البئر للسماح للوسط لجمع في الجزء السفلي، ومن ثم التعرق وتجاهله. الآن إضافة ثلاثة إلى أربعة ملليلتر من الثقافة المتوسطة لكل بئر.باستخدام ملقط معقمة، والعودة أي explants الأنسجة التي سقطت في المتوسطة إلى الاسفنج الجيلاتين قبل إعادة لوحة إلى الحاضنة. وفي نهاية هذه الاستزراع، التخلص من جميع النفايات البيولوجية في حاويات نفايات مقرها وفقاً للوائح المعهد بشأن مناولة المواد البيولوجية الخطرة وكذلك تقييم المخاطر المحددة. يمكن أن تؤثر التقلبات بين المانحين على تكرار فيروس نقص المناعة البشرية-1 كما يقاس بتركيز هفوة البروتين الأساسي P24 في زراعة الأنسجة المستفِدَة، كما هو مُبيَّن بالنسبة لأنسجة عنق الرحم من ثلاثة مانحين مختلفين مصابين بنفس الفيروس المُصابين بالفيروس نفسه.بالنسبة للمتبرع الأول، فإن تراكم هفوة p24 في الوسط الثقافي للطاردات المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 BaL وحدها يشير بوضوح إلى عدوى المنتج. وقد استخدم دواء 3TC المضاد للفيروسات العكوسة الذي يلغي تماماً تكرار الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية كمكافحة سلبية. كمية هفوة p24 تقاس في الوسط ثقافة explants المعالجة 3TC يكشف عن جزء من الفيروس استيعابها بشكل خاص وأفرج عنه من قبل explants الأنسجة أثناء الزرع.في الأنسجة explants من المتبرع الثاني، يؤدي عدوى الأمعاء HIV-1 إلى انخفاض مطرد في تركيز هفوة P24 بمرور الوقت، مما يشير إلى إجهاض العدوى أو لا يمكن اكتشافها بواسطة الكم الكم الكمومي p24. وهذا ما يؤكده 3TC- المعالجة السيطرة explants التي تظهر حركية مماثلة تكرار فيروس نقص المناعة البشرية. عدوى الأنسجة explants من المانح الثالث غلة كمية قليلة من الفيروس.في هذه الحالة، إدراج العلاج 3TC كمكافحة سلبية ضروري للتأكد من وجود العدوى مع إنتاج فيروس دي نوفو. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق تحليلية مثل تدفق الخلايا أو المناعة في نقاط زمنية مختلفة للإجابة على أسئلة حول النمط الظاهري، نسبة، أو موقع الأنسجة من السكان الخلية من الفائدة. وعند تصميم التجربة، من المهم تقدير أثر التباين بين المانحين على القراءة التجريبية المختارة.ويمكن السيطرة على التباين بين المانحين جزئياً عن طريق وضع معايير صارمة للإدماج والاستبعاد السريريين، وربما التجريبيين. يمكن استخدام الثقافات السابقة الأنسجة البشرية vivo لدراسة التسبب في الميكروبات غير فيروس نقص المناعة البشرية، مثل فيروس التشنج أو فيروس الهربس. كما أنها تستخدم كمنصة قبل التخصصات للمواد المضادة للميكروبات ودراسات الأخلاقيات.يرجى أن تكون على علم بأن جميع العينات البشرية، حتى من الأفراد الأصحاء، يمكن أن تؤوي العوامل المعدية. التعليم المناسب، والتدريب، والحماية مطلوبة للتعامل مع الأنسجة البشرية لضمان سلامة لكم وزملاء العمل.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA - الإيج بناء خلايا مولدة الاصطناعي تقديم الكفء لل خارج الحي توسيع CTL الإنسان

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

عزل الخلايا اللمفاوية من المسالك التناسلية الماوس الغشاء المخاطي

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

تقييم الفطرية الاستشعار من HIV-1 CD4 المصابة<sup&gt; +</sup&gt; T الخلايا عن طريق الخلايا الجذعية بلازماوية الشكل باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; المشارك ثقافة النظام.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

عزل الخلايا اللمفاوية من الجلد البشري لتحليل المظهري و<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; زراعة الخلايا

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

زوجيا النمو الفحص التنافس على تحديد النسخ المتماثل للياقة البدنية من الفيروسات نقص المناعة البشرية

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

العدوى فيفو السابقين الفئران البشرة مع فيروس الهربس البسيط من النوع 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

تحقيقات الفحص البصري للرواية الخاصة بالبكتيريا في أنسجة الرئة البشرية السابقين فيفو بالليزر [كنفوكل] اندوميكروسكوبي

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...