Name: ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture
Uploaded: 2018-10-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra fonden Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), Foundation svenske læger mod AIDS (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) og Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) til Andrea Introini.

Protokol for indsamling af humane væv kan kræve etisk godkendelse af de lokale myndigheder. I tilfælde af angivne operationer såsom tonsillektomi og hysterektomi, modellerne er ikke indsamlet specifikt til forskning formål og undersøgelsen betragtes ikke som forsøgspersoner forskning (National Institutes of Health. Forskning på forsøgspersoner. https://humansubjects.NIH.gov/walkthrough-investigator#tabpanel11). Men, at opnå væv donorernes personlige og medicinske data (fx., køn, alder, nuværende sto...

<ol>
	<li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+HIV-1+phenotype+switch+as+a+causal+factor+in+acquired+immunodeficiency.">Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency.</a> Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).</li><li>Dezzutti, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+and+human+mucosal+tissue+models+to+study+HIV+biomedical+interventions:+can+we+predict+success.">Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success.</a> J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).</li><li>Lederman, M. M., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+node+in+HIV+pathogenesis.">The lymph node in HIV pathogenesis.</a> Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).</li><li>Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reservoirs+as+obstacles+and+opportunities+for+an+HIV+cure.">HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure.</a> Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induced+activation+of+CD4++T+cells+creates+new+targets+for+HIV-1+infection+in+human+lymphoid+tissue+ex+vivo.">HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo.</a> Blood. 111 (2), 699-704 (2008).</li><li>Van Laar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+secretion+of+immunoglobulin+by+long-lived+human+tonsil+plasma+cells.">Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells.</a> Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).</li><li>Introini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminal+plasma+induces+inflammation+and+enhances+HIV-1+replication+in+human+cervical+tissue+explants.">Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants.</a> PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).</li><li>Grivel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+CCR5-+but+not+CXCR4-tropic+HIV-1+in+lymphoid+tissue+by+human+herpesvirus+6.">Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6.</a> Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).</li><li>Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type-2+stimulates+HIV-1+replication+in+cervical+tissues:+implications+for+HIV-1+transmission+and+efficacy+of+anti-HIV-1+microbicides.">Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).</li><li>Lisco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+is+activated+into+a+HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+in+herpesvirus-infected+human+tissues.">Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues.</a> Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).</li><li>Vanpouille, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+anti-cytomegalovirus+drug,+ganciclovir,+inhibits+HIV-1+replication+in+human+tissues+ex+vivo.">A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo.</a> AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).</li><li>Andrei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+tenofovir,+a+microbicide+effective+against+HIV,+inhibits+herpes+simplex+virus-2+replication.">Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication.</a> Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).</li><li>Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+human+immunodeficiency+virus+infection+of+human+cervical+tissue+and+inhibition+by+vaginal+virucides.">Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides.</a> J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+sexual+transmission:+early+events+of+HIV-1+infection+of+human+cervico-vaginal+tissue+in+an+optimized+ex+vivo+model.">HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model.</a> Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+facilitates+HIV-1+transmission+to+cervico-vaginal+tissue+ex+vivo.">Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo.</a> PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+and+dynamic+immunofluorescent+cytometric+bead+assay+for+the+detection+of+HIV-1+p24.">A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24.</a> J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).</li><li>Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=War+and+peace+between+microbes:+HIV-1+interactions+with+coinfecting+viruses.">War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses.</a> Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).</li><li>Keele, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection.">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).</li><li>Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+microenvironments+in+the+human+vagina+and+cervix:+mediators+of+cellular+immunity+are+concentrated+in+the+cervical+transformation+zone.">Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone.</a> Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).</li><li>Ganor, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within+1h,+HIV-1+uses+viral+synapses+to+enter+efficiently+the+inner,+but+not+outer,+foreskin+mucosa+and+engages+Langerhans-T+cell+conjugates.">Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).</li><li>Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R5+HIV-1+envelope+attracts+dendritic+cells+to+cross+the+human+intestinal+epithelium+and+sample+luminal+virions+via+engagement+of+the+CCR5.">R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+testing+of+candidate+topical+microbicides+for+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity+and+tissue+toxicity+in+a+human+cervical+explant+culture.">Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+colorectal+explant+culture+to+evaluate+topical+microbicides+for+the+prevention+of+HIV+infection.">A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection.</a> J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Productive+HIV-1+infection+of+human+cervical+tissue+ex+vivo+is+associated+with+the+secretory+phase+of+the+menstrual+cycle.">Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle.</a> Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).</li></ol>

Brugen af menneskelige væv explants for undersøgelsen af HIV-1 infektion giver fordele frem for traditionelle bi-dimensionel og monotypisk eksperimentelle systemer, såsom primærelementer eller cellelinjer, grund af deres overlegne evne til at reproducere intercellulære interaktioner og cellulære funktioner (f.eks.cytokin produktion) som de er i vivo. Ikke desto mindre tonsillar og cervikal væv er forskellige i mange aspekter, herunder antallet og fænotypiske og funktionelle egenskaber af HIV tar...

Monotypisk bi-dimensionel cellekulturer, her henvises til som konventionelle, ikke højde for fysisk og funktionel kommunikationen mellem en lang række celletyper, at komponerer væv og organer. Dette aspekt er af afgørende betydning for eksperimentelle modeller af sygdommen, som interferens med homeostatiske intercellulære interaktioner er den drivende faktor af alle patologier. Væv explants tilbyder store fordele for modellering sundhed og sygdom i mennesker, fordi de bevarer cytoarchitecture og mange vigtige funktionelle aspekter af organer, som de er i vivo, men for en begrænset mængde tid1. For eksempel, på ex vivo udfordring med recall antigener, såsom difteri toxoid eller tetanustoksoid, reagerer tonsillar væv med en kraftig produktion af antigen-specifikke antistoffer2. Ligesom enhver anden ex vivo model, histoculture har sine egne begrænsninger: Inter donor variabilitet, væv polarisering, begrænset væv overlevelse og vanskeligheder i overvågning celler ud over dybden af konfokalmikroskopi1. Humant væv explants er dog fortsat en model af valg at studere homeostatiske og patogene immunologiske processer hos mennesker, herunder vært-patogen interaktioner og potentielle terapeutiske indgreb3.
De kritiske begivenheder af HIV-1 patogenese finder sted i væv. Infektion af genital slimhinden tegner sig for størstedelen af alle HIV-1 transmission begivenheder worldwide4. Lymfoide væv er den største site af virus replikering under akut infektion og havne en stor pulje af latent inficerede celler5, og deres persistens repræsenterer den vigtigste hindring for at opnå en kur6. Kultur og ex vivo udfordringen at menneskelige lymfoide og slimhinden væv giver nogle fordele i forhold til konventionelle systemer baseret på isolerede celler for studier af HIV-1. For eksempel, kan væv-resident celler støtte HIV-1 infektion i mangel af eksogene aktivering, i stedet for perifert blod mononukleære celler1. Den lymfoide væv explants har tilladt en bedre forståelse af nogle vigtige mekanismer bag CD4 T celle nedbrydningendet vil sige, tilskuer effekt7, som er kendetegnende for akut infektion. Bevarelse af strukturer som B-celle follikler i lymfoide væv8 og epitel i kvindelige kønsorganer mucosa explants9 tilbyder en unik mulighed for at integrere fysisk og funktionel funktioner af HIV-1 infektion på disse websteder. Endelig, histocultures blev med succes brugt til model og studere HIV-1 og herpesvirus Co infektion10,11, samt for præklinisk afprøvning af antiretrovirale lægemidler og multitarget mikrobicider12, 13 , 14 , 15.
Her beskriver vi en detaljeret protokol for kulturen i humant væv explants fremstillet af mandler og slimhinden væv fra den nedre kvindelige kønsorganer (livmoderhalsen), der dækker væv dissektion at explant udfordring med HIV-1 i en ikke-polariseret måde. Kulturen af væv explants på væske-luft grænseflade, ved hjælp af gelatine svampe som en støtte, maksimerer eksponering til air ilt samtidig give adgang til næringssubstratet næringsstoffer gennem svampen kapillærer, således at forskyde deres naturlige forfald. Den mest umiddelbare måde i vurderingen af HIV-1 replikation i vores system er at måle mængden af virus udgivet i dyrkningsmediet eksplantat over tid af immunassay eller qPCR. HIV-1 infektion og patogenese (fx., CD4 T celle nedbrydningen) kan også vurderes i væv explants af bulk RNA/DNA-ekstraktion og qPCR, i situ farvning eller enkelt celle-analyse på væv fordøjelsen ved flowcytometri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:941px;" width="940">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Pfizer</td>
			<td style="width:141px;">NDC:&#160; 0009-0315-08</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">SPONGOSTAN Standard 70 &#215; 50 &#215; 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge</td>
			<td>Ferrosan Medical Devices</td>
			<td>MS0002</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">RPMI 1640 with phenol red and glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Modified Eagle&#39;s medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sodium pyruvate, 100 mM (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Gentamicin 50 mg/mL (1000x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15750037</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Amphotericin B 250 &#956;g/mL (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:49px;width:280px;">Ticarcillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5639-1G</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:280px;">Potassium clavulanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33454-100MG</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:280px;">Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;">To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile cell culture grade water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile transportation container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Disinfectant solution for biological waste disposal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal forceps or tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile flat weighing metal spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile scalpels and blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">6-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">12-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Petri dish, 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>510</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>2522</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Lamivudine (3TC)</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>8146</td>
			<td style="width:345px;">Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:280px;">Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 &#176;C, 5% CO2, &#8805; 90% humidity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Water bath set at 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 &#176;C, 300 rpm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture

Histocultures giver mulighed for at studere intercellulære interaktioner inden for humane væv, og de kan blive ansat til model vært-patogen interaktioner under kontrollerede laboratorieforhold. Ex vivo infektion af væv med human immundefekt virus (HIV), blandt andre vira, har held været anvendt til at undersøge tidlig sygdom patogenese, samt en platform til at teste effekten og toksicitet af antivirale lægemidler. I denne protokol forklare vi, hvordan til at behandle og smitte med HIV-1 væv explants fra menneskelige tonsiller og cervikal mucosae, og bevare dem i kultur på toppen af gelatine svampe på grænsefladen væske-luft for omkring to uger. Indstillingen ikke-polariseret kultur maksimerer adgang til næringsstoffer i substratet og ilt, selv om fremadskridende tab af væv integritet og funktionelle arkitekturer er dens vigtigste begrænsning. Denne metode giver mulighed for overvågning af HIV-1 replikation og patogenesen ved hjælp af flere teknikker, herunder immunassays, qPCR og flowcytometri. Af betydning, kan fysiologisk variabiliteten mellem væv donorer samt mellem explants fra forskellige områder af det samme prøvemateriale, påvirke eksperimentelle resultater. For at sikre resultatet reproducerbarhed, det er afgørende for at bruge et passende antal explants, tekniske replikater og donor-matchede kontrol betingelser til at normalisere resultater af de eksperimentelle behandlinger, når indsamling af data fra flere eksperimenter (dvs. ., gennemføres ved hjælp af væv fra forskellige donorer) til statistiske analyser.

Flere teknikker kan bruges til at vurdere HIV-1 replikation i væv explants. Vores standard udlæsning er at måle mængden af HIV-1 p24gag udgivet i CM over tid med en immunassay18.
Væv explants fra forskellige donorer, inficeret med den samme inokulum af den samme HIV-1 bestand, kan give forskellige mængder af virus (tabel 1). Dette skyldes flere faktorer, såsom antallet o...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infektion med humant væv med human immundefekt virus (HIV) ex vivo giver en værdifuld 3D model af virus patogenese. Her, beskriver vi en protokol for at behandle og inficere væv prøver fra menneskelige tonsiller og kvindelige kønsorganer mucosae med HIV-1 og fastholde dem i kultur på grænsefladen væske-luft.

Ex Vivo Infektion af menneskelige lymfoide væv og kvindelige kønsorganer slimhinde med Human immundefekt Virus 1 og Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål i hiv-området, såsom identifikation af determinanter for virusoverførsel og patogenese inden for to af de mest berørte organer ved infektionen. Faktisk, de vigtigste avancerede kørsel sygdomsprogression finder sted i væv. De funktioner og kompleksiteten af infektion er dårligt afspejles af celler i omløb eller isolerede og inficerede in vitro.Den største fordel ved ex vivo væv kultur til at studere HIV patogenese er, at det bevarer sin oprindelige spacial og funktionelle relationer mellem celler, men i to til tre uger. Til at begynde, fylde en 100 millmeter med 20 millimeter petriskål med 20 til 30 milliliter CMT. Overfør gelatine svampe i petriskålen ved hjælp af sterile kraftbefæstelser.Våd svampene på begge sider og lad svampene opsuge medium i et minut. Tryk svampene mod bunden af petriskålen i ca. to minutter ved hjælp af en steril spatel. Brug steril saks til at skære de rehydrerede gelatine svampe i stykker af samme størrelse på omkring en kvadratcentimeter.Brug derefter vicess til at overføre en svamp stykke i hver brønd af en kultur plade. Tilsæt tre til fire milliliter CMT i hver brønd af en 6-brønd plade til mandlerne og en milliliter per godt ind i en 12-brønd plade til livmoderhalsen. Placer pladerne i inkubatoren, indstillet til 37 grader Celsius, 5% CO2, og større end eller lig med 90% fugtighed, indtil vævet explants er klar til at blive lastet på svampene.Overfør mandlerne fra transportbeholderen til en 100 millimeter petriskål indeholdende 10 til 20 milliliter CMT ved hjælp af sterile kraftafgænsninger. Brug låget af petriskålen som skæreflade til at dissekere vævet. Holde vævet forsigtigt med scer, skær hver tonsil i forskellige, store stykker ved hjælp af en steril skalpel og klinge.Brug karcepper og en skalpel til at fjerne ætset, blodig, og fibroid væv, samt alle dele, der indeholder tonsilloliths eller grønlig-brun farve. Skær hvert væv stykke i skiver på omkring to millimeter i tykkelse. Fjern uønskede dele som i det forrige trin.Skær derefter vævsskiverne i to millimeter tykke strimler. Endelig skæres vævstrimler i to-millimeter-tykke blokke. Overfør explants i en ny 100 millimeter petriskål, der indeholder 10 til 20 milliliter CMT for at undgå vævudsivning, mens du fortsætter med dissektion.I slutningen af dissektionen hvirvles pladen for at randomisere den udstævne fordeling. Placer ni væv explants oven på hver gelatine svamp i en 6-brønd plade ved hjælp af spån, så rummet mellem dem. Returner pladerne til inkubatoren.Typisk er explants dyrket natten over. Inokulering med HIV udføres den næste dag. Dette er for at sikre, at ingen bakteriel eller svampeforurening udvikler sig i kulturen.Også, celler har tendens til at regress væv explants umiddelbart efter dissektion. Inspirer mediet i 6-brøndpladen med en pipette, og kassér det i en beholder med desinfektionsmiddelopløsning. Vip pladen og skub forsigtigt gelatinesvampene til den øverste del af brønden, så mediet kan samles i bunden.Aspirere og kassér mediet. Derefter tilføjes tre til fire milliliter CMT til hver brønd. Nu tø HIV-1 virus forberedelse i vandbadet ved 37 grader Celsius.Pipette virus inoculum direkte på toppen af hver af ni explants på en gelatine svamp. Returner pladen til inkubatoren. Brug låget af petriskålen som skæreflade til at dissekere vævet.Hvis vævet holdes forsigtigt med spån, adskilles slimhinden i ektocervixen og/eller endocervix fra under stromale og submucosa med en skalpel og klinge for at opnå strimler af slimhinde. Skær slimhinden i to millimeter brede strimler. Fjern og kassér så meget submucosa som muligt, så kun en to-millimeter-tykt lag af væv.Skær derefter strimlerne i to millimeter tykke blokke. Overfør vævsudstød i en ny 100 millimeter petriskål indeholdende 10 til 20 milliliter CMT for at undgå vævsudledning, mens du fortsætter med dissektionen. I slutningen af dissektionen hvirvles pladen for at randomisere den udstævne fordeling.Med sterile kraftbecer overføres explanterne til sterile 1,5 milliliter koniske rør. Fjern ethvert medie i røret ved hjælp af en pipette. For optimale resultater, bør explants af livmoderhalsen behandles og inficeres så hurtigt som muligt efter operationen, ideelt dagen for operationen.Alternativt kan væv opbevares nedsænket i CMT ved 4 grader natten over og inficeret umiddelbart efter dissektion. Tø HIV-1 forberedelse i et vandbad ved 37 grader Celsius. Når virussen er optøet, overføres den til rørene, der indeholder explanterne.Overfør rørene i en termoformørk, og inkuber i to timer ved 37 grader Celsius vuggende ved 300 rpm. Inverter forsigtigt rørene et par gange hver 30 til 60 minutter. I mellemtiden fylde en 6-brønd plade med tre til fire milliliter pr brønd af steril fosfat buffer saltlinje.Ved slutningen af inkubationen med HIV-1 skal der anvendes en pipette til at kassere alle viruspræparater i rørene, der indeholder explanterne, i en beholder med desinfektionsmiddelopløsning. Brug derefter kraftforeskninger og en pipette til at overføre explants i den 6-brøndplade, der indeholder PBS. Efter at explants at hvile i PBS i et minut ved stuetemperatur, vaskes dem ved forsigtigt pipettering PBS op og ned i brønden to til tre gange.Kassér derefter PBS i en beholder med desinfektionsmiddelopløsning ved hjælp af en pipette. Tilføj tre til fire milliliter ny PBS til hver brønd. Gentag to gange mere for i alt tre vaske.Kassér PBS lige før overførsel af explants til svampene for at undgå vævsudledning. Brug nu vicess til at overføre fem til otte explants oven på hver gelatine svamp i en 12-brønd plade. Returner pladen til inkubatoren.Saml en prøve af kultur medium med en pipette, og overføre det til sterile 1,5 eller to milliliter skruelåg rør til opbevaring på minus 80 grader Celsius. Høst væv explants med sterile stæcener, og overføre explants i sterile 1,5 eller to milliliter skruelåge. Proterne eller opbevaringen af vævsprøverne som krævet i forsøget.Inspirer restkulturmediet i brønden med en pipette, og kassér det i en beholder med desinfektionsmiddelopløsning. Vip pladen og skub forsigtigt gelatinesvampene til den øverste del af brønden, så mediet kan samles i bunden, og derefter aspirere og kassere det. Nu tilføje tre til fire milliliter kultur medium til hver brønd.Brug sterile kraftbecer, returnere eventuelle væv explants, der faldt i mediet til gelatine svamp, før du returnerer pladen til rugemaskinen. Ved kulturens afslutning skal alt biologisk affald bortskaffes i passende beholdere i henhold til instituttets regler om håndtering af farlige biologiske stoffer samt den specifikke risikovurdering. Variation mellem donorer kan påvirke HIV-1-replikationen målt ved koncentrationen af hiv-kerneprotein p24 gag i vævseksplantekultursupernatant, som påvist for livmoderhalsvæv fra tre forskellige donorer, der er inficeret med samme virusinokuculum.For den første donor, ophobning af p24 gag i kultur medium af explants inficeret med HIV-1 BaL alene klart angiver et produkt infektion. Det antiretrovirale lægemiddel 3TC, der fuldstændig ophæver hiv-replikation, blev brugt som en negativ kontrol. Mængden af p24 gag målt i dyrgtium af 3TC-behandlede explants afslører den fraktion af virus inoculum aspecifically absorberes og frigives af væv explants under kultur.I vævsudstød fra den anden donor resulterer HIV-1-tarminfektion i et støt fald i koncentrationen af p24 gag over tid, hvilket indikerer en afbrydelse af infektionen eller målbart ved p24 gag kvantificering. Dette bekræftes af 3TC-behandlede kontrol explants, der viser en lignende HIV replikation kinetisk. Infektion af væv explants fra den tredje donor giver ringe mængde virus.I dette tilfælde er det nødvendigt at medtage 3TC-behandlingen som en negativ kontrol for at fastslå tilstedeværelsen af infektion med de novo virusproduktion. Efter denne procedure kan analysemetoder som flowcytometri eller immunstaining udføres på forskellige tidspunkter for at besvare spørgsmål om fænotype, proportion eller vævsplacering for den cellepopulation af interesse. Ved udformningen af eksperimentet er det vigtigt at vurdere virkningen af variation mellem donorer på den eksperimentelle udlæsning af valg.Variation mellem donorer kan delvist kontrolleres ved at fastsætte strenge kliniske og eventuelt eksperimentelle inklusions- og udelukkelseskriterier. Ex vivo humane væv kulturer kan bruges til at studere patogenese af mikrober andre end HIV, såsom vaccinia virus eller herpes virus. De er også blevet brugt som en præklinisk platform for antimikrobiel toksicitet og etik undersøgelser.Vær opmærksom på, at alle menneskelige prøver, selv fra raske personer, kan huse smitsomme stoffer. Passende uddannelse, uddannelse og beskyttelse er forpligtet til at håndtere humane væv for at sikre sikkerheden for dig og dine kolleger.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolering af lymfocytter fra Mouse Genital Tract mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Vurdering af Innate Sensing af HIV-1 inficerede CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler ved plasmacytoide dendritiske celler ved hjælp af en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-dyrkningssystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocyt Isolering fra menneskehud for Fænotypisk Analyse og<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Parvis Growth Konkurrence Assay til Bestemmelse af Replication Fitness af Human Immunodeficiency Virus

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo infektion af murint Epidermis med herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse af lymfocyt Ekstravasation Ved anvendelse af en<em&gt; In vitro</em&gt; Model af humant blod-hjernebarrieren

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optisk Screening af roman bakterier-specifikke sonder på Ex Vivo menneskelige lungevæv ved Konfokal Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...