Name: ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture
Uploaded: 2018-10-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door subsidies van de Foundation Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), de Stichting Zweedse artsen tegen AIDS (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) en Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) naar Andrea Introini.

Het protocol voor collectie van menselijke weefsels kan ethische goedkeuring vereist door de plaatselijke bevoegde autoriteiten. In het geval van aangegeven operaties zoals tonsillectomie en hysterectomie, de specimens zijn niet verzameld speciaal voor doel van het onderzoek en de studie wordt niet beschouwd als proefpersonen onderzoek (National Institutes of Health. Onderzoek op menselijke proefpersonen. https://humansubjects.NIH.gov/walkthrough-Investigator#tabpanel11). Echter, het verkrijgen van weefsel donoren persoo...

<ol>
	<li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+HIV-1+phenotype+switch+as+a+causal+factor+in+acquired+immunodeficiency.">Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency.</a> Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).</li><li>Dezzutti, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+and+human+mucosal+tissue+models+to+study+HIV+biomedical+interventions:+can+we+predict+success.">Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success.</a> J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).</li><li>Lederman, M. M., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+node+in+HIV+pathogenesis.">The lymph node in HIV pathogenesis.</a> Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).</li><li>Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reservoirs+as+obstacles+and+opportunities+for+an+HIV+cure.">HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure.</a> Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induced+activation+of+CD4++T+cells+creates+new+targets+for+HIV-1+infection+in+human+lymphoid+tissue+ex+vivo.">HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo.</a> Blood. 111 (2), 699-704 (2008).</li><li>Van Laar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+secretion+of+immunoglobulin+by+long-lived+human+tonsil+plasma+cells.">Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells.</a> Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).</li><li>Introini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminal+plasma+induces+inflammation+and+enhances+HIV-1+replication+in+human+cervical+tissue+explants.">Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants.</a> PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).</li><li>Grivel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+CCR5-+but+not+CXCR4-tropic+HIV-1+in+lymphoid+tissue+by+human+herpesvirus+6.">Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6.</a> Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).</li><li>Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type-2+stimulates+HIV-1+replication+in+cervical+tissues:+implications+for+HIV-1+transmission+and+efficacy+of+anti-HIV-1+microbicides.">Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).</li><li>Lisco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+is+activated+into+a+HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+in+herpesvirus-infected+human+tissues.">Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues.</a> Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).</li><li>Vanpouille, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+anti-cytomegalovirus+drug,+ganciclovir,+inhibits+HIV-1+replication+in+human+tissues+ex+vivo.">A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo.</a> AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).</li><li>Andrei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+tenofovir,+a+microbicide+effective+against+HIV,+inhibits+herpes+simplex+virus-2+replication.">Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication.</a> Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).</li><li>Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+human+immunodeficiency+virus+infection+of+human+cervical+tissue+and+inhibition+by+vaginal+virucides.">Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides.</a> J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+sexual+transmission:+early+events+of+HIV-1+infection+of+human+cervico-vaginal+tissue+in+an+optimized+ex+vivo+model.">HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model.</a> Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+facilitates+HIV-1+transmission+to+cervico-vaginal+tissue+ex+vivo.">Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo.</a> PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+and+dynamic+immunofluorescent+cytometric+bead+assay+for+the+detection+of+HIV-1+p24.">A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24.</a> J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).</li><li>Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=War+and+peace+between+microbes:+HIV-1+interactions+with+coinfecting+viruses.">War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses.</a> Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).</li><li>Keele, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection.">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).</li><li>Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+microenvironments+in+the+human+vagina+and+cervix:+mediators+of+cellular+immunity+are+concentrated+in+the+cervical+transformation+zone.">Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone.</a> Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).</li><li>Ganor, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within+1h,+HIV-1+uses+viral+synapses+to+enter+efficiently+the+inner,+but+not+outer,+foreskin+mucosa+and+engages+Langerhans-T+cell+conjugates.">Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).</li><li>Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R5+HIV-1+envelope+attracts+dendritic+cells+to+cross+the+human+intestinal+epithelium+and+sample+luminal+virions+via+engagement+of+the+CCR5.">R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+testing+of+candidate+topical+microbicides+for+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity+and+tissue+toxicity+in+a+human+cervical+explant+culture.">Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+colorectal+explant+culture+to+evaluate+topical+microbicides+for+the+prevention+of+HIV+infection.">A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection.</a> J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Productive+HIV-1+infection+of+human+cervical+tissue+ex+vivo+is+associated+with+the+secretory+phase+of+the+menstrual+cycle.">Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle.</a> Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).</li></ol>

Het gebruik van menselijk weefsel explants voor de studie van HIV-1 infectie voordelen ten opzichte van de traditionele bi-dimensionale en monotypisch experimentele systemen, zoals primaire cellen of cellijnen, vanwege hun superieure vermogen biedt te reproduceren intercellulaire interacties en cellulaire functies (b.v.cytokine productie) zoals ze in vivo zijn. Niettemin, tonsillar en cervicale weefsel verschillen in vele aspecten, met inbegrip van het aantal, en de fenotypische en functionele kenmerken...

Monotypisch bi-dimensionale celculturen, aangeduid als conventionele, geen rekening met de ruimtelijke en functionele communicatie tussen de grote verscheidenheid aan celtypes waaruit weefsels en organen. Dit aspect is van het allergrootste belang voor experimentele modellen van ziekte, zoals interferentie met homeostatische intercellulaire interacties de drijvende factor van alle pathologieën is. Weefsel explantaten bieden grote voordelen voor de modellering van gezondheid en ziekte bij de mens, omdat zij behouden de cytoarchitecture en veel belangrijke functionele aspecten van organen zoals ze zijn in vivo, hoewel het voor een beperkte hoeveelheid tijd1. Bijvoorbeeld bij ex vivo challenge met terugroepen antigenen, zoals difterie tetanustoxoïd of tetanus tetanustoxoïd, reageert tonsillar weefsel met een krachtige productie van antigeen-specifieke antilichamen2. Net als ieder ander ex vivo model, histoculture heeft zijn eigen beperkingen: Inter donor variabiliteit, weefsel polarisatie, beperkte weefsel overleven en moeilijkheden bij de controle op cellen buiten de diepte van de confocal microscopie1. Niettemin blijven de menselijk weefsel explantaten een model van keuze om homeostatische en pathogene immunologische processen bij de mens, met inbegrip van gastheer-pathogeen interacties en potentiële therapeutische interventies3te bestuderen.
De kritieke gebeurtenissen van de pathogenese van HIV-1 plaatsvinden in weefsels. Infecties van de genitale mucosa rekeningen voor de meerderheid van alle HIV-1 transmissie evenementen wereldwijd4. Lymfoïde weefsel is de belangrijkste site voor replicatie van het virus tijdens de acute infectie en herbergt een grote pool van latent geïnfecteerde cellen5, en hun persistentie vertegenwoordigt de voornaamste hinderpaal voor het bereiken van een genezing6. De cultuur en ex vivo uitdaging van menselijke lymfe en mucosal weefsels bieden een aantal voordelen ten opzichte van conventionele systemen op basis van geïsoleerde cellen voor de studie van HIV-1. Weefsel-ingezeten cellen kunnen bijvoorbeeld, HIV-1 infectie ondersteunen bij gebrek aan exogene activering, in tegenstelling tot perifere bloed mononucleaire cellen1. Het gebruik van lymfoïde weefsel explantaten heeft toegestaan een beter begrip van sommige belangrijke mechanismen die ten grondslag liggen aan CD4 T-cel uitputtingdat wil zeggen, de omstander effect7, dat is het kenmerk van een acute infectie. Het behoud van structuren zoals B cel follikels in de lymfoïde weefsel8 en het epithelium in vrouwelijke genitale mucosa explantaten9 biedt de unieke mogelijkheid om ruimtelijke en functionele eigenschappen van HIV-1 infectie op deze sites te integreren. Tot slot werden histocultures met succes gebruikt voor model en studie van HIV-1 en herpesvirus co-infectie10,11, alsmede voor preklinische testen van antiretrovirale en multitarget microbiciden12, 13 , 14 , 15.
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de cultuur van menselijk weefsel explantaten verkregen van amandelen en mucosale weefsel van de lagere vrouwelijke genitale landstreek (baarmoederhals), die betrekking hebben op weefsel dissectie om explant challenge met HIV-1 in een niet-gepolariseerde manier. De cultuur van weefsel explantaten op de vloeibare-lucht-interface, met behulp van gelatine sponzen als ondersteuning, maximaliseert blootstelling aan zuurstof lucht terwijl het verstrekken van toegang tot kweekmedium voedingsstoffen via de spons haarvaten, dus vertragen hun natuurlijke verval. De meest directe manier van het evalueren van HIV-1 replicatie in ons systeem is voor het meten van de hoeveelheid virus in het kweekmedium explant vrijgegeven na verloop van tijd door immunoassay of qPCR. HIV-1 infectie en pathogenese (bv., CD4 T-cel depletie) kan ook worden geëvalueerd in weefsel explantaten door bulk RNA/DNA-extractie en qPCR, in situ kleuring, of één cel-analyse op weefsel vertering door stroom cytometry.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:941px;" width="940">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Pfizer</td>
			<td style="width:141px;">NDC:&#160; 0009-0315-08</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">SPONGOSTAN Standard 70 &#215; 50 &#215; 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge</td>
			<td>Ferrosan Medical Devices</td>
			<td>MS0002</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">RPMI 1640 with phenol red and glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Modified Eagle&#39;s medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sodium pyruvate, 100 mM (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Gentamicin 50 mg/mL (1000x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15750037</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Amphotericin B 250 &#956;g/mL (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:49px;width:280px;">Ticarcillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5639-1G</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:280px;">Potassium clavulanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33454-100MG</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:280px;">Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;">To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile cell culture grade water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile transportation container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Disinfectant solution for biological waste disposal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal forceps or tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile flat weighing metal spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile scalpels and blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">6-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">12-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Petri dish, 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>510</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>2522</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Lamivudine (3TC)</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>8146</td>
			<td style="width:345px;">Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:280px;">Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 &#176;C, 5% CO2, &#8805; 90% humidity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Water bath set at 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 &#176;C, 300 rpm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture

Histocultures laten studeren intercellulaire interacties binnen de menselijke weefsels, en ze kunnen worden ingezet om model gastheer-pathogeen interacties onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden. Ex vivo infectie van menselijke weefsels met humaan immunodeficiëntie virus (HIV), onder andere virussen, is met succes gebruikt om het onderzoeken van de vroege pathogenese van de ziekte, alsook een platform voor het testen van de werkzaamheid en de toxiciteit van antivirale middelen. In het huidige protocol, wij leggen uit hoe te verwerken en te infecteren met HIV-1 weefsel explantaten van menselijke amandelen en cervicale mucosae, hen cultuur op de top van gelatine sponzen op de vloeibare-lucht-interface voor gedurende ongeveer twee weken. Deze instelling niet-gepolariseerd cultuur maximaliseert toegang tot voedingsstoffen in cultuurmedium en zuurstof, hoewel progressief verlies van weefsel integriteit en functionele platforms haar belangrijkste beperking blijft. Deze methode zorgt voor de opvolging van HIV-1 replicatie en pathogenese met behulp van diverse technieken, waaronder immunoassay, qPCR en stroom cytometry. Van belang is, kan de fysiologische variabiliteit tussen weefsel donoren, alsmede tussen explantaten uit verschillende gebieden van het hetzelfde model, grote invloed op experimentele resultaten. Om ervoor te zorgen de reproduceerbaarheid van het resultaat, is het van cruciaal belang met een voldoende aantal explantaten, technische wordt gerepliceerd en donor-matched controlevoorwaarden te normaliseren van de resultaten van de experimentele behandelingen bij het opstellen van de gegevens uit meerdere experimenten (dwz ., uitgevoerd met behulp van weefsels van verschillende donoren) voor statistische analyse.

Verschillende technieken kunnen worden gebruikt om te beoordelen van HIV-1 replicatie in weefsel explantaten. Onze standaard uitlezing is voor het meten van de hoeveelheid HIV-1 p24gag uitgebracht in CM na verloop van tijd met een immunoassay18.
Weefsel explantaten van verschillende donoren, besmet met de dezelfde entmateriaal van hetzelfde HIV-1 bestand, kunnen het opleveren van verschillende ...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infectie van menselijke weefsels met humaan immunodeficiëntie virus (HIV) ex vivo biedt een waardevolle 3D-model van virus pathogenese. Hier beschrijven we een protocol voor het verwerken en infecteren van weefsel monsters van menselijke amandelen en vrouwelijke genitale mucosae met HIV-1 en onderhouden ze in cultuur in de vloeistof-lucht-interface.

Ex Vivo Infectie van menselijke lymfoïde weefsels en vrouwelijke genitale Mucosa met Humaan Immunodeficiëntie Virus 1 en Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het HIV-gebied, zoals de identificatie van de determinanten van virusoverdracht en pathogenese binnen twee van de meest uitgevoerde organen door de infectie. In feite vindt de belangrijkste geavanceerde progressie van de ziekte plaats in weefsels. De kenmerken en complexiteit van infectie worden slecht weerspiegeld door cellen in het verkeer of geïsoleerd en geïnfecteerd in vitro.Het belangrijkste voordeel van de ex vivo weefselcultuur om HIV-pathogenese te bestuderen is dat het zijn oorspronkelijke ruimtelijke en functionele relaties tussen cellen behoudt, hoewel gedurende twee tot drie weken. Om te beginnen, vul een 100 millmeter bij 20 millimeter petrischaal met 20 tot 30 milliliter CMT. Breng gelatine sponzen in de petrischaal met behulp van steriele tangen.Maak de sponzen aan beide zijden nat en laat de sponzen een minuut lang opzuigen. Druk de sponzen ongeveer twee minuten tegen de bodem van de petrischaal met een steriele spatel. Gebruik steriele schaar om de gehydrateerde gelatine sponzen te snijden in stukken van gelijke grootte van ongeveer een vierkante centimeter.Gebruik dan tangen om een spons stuk over te dragen in elke put van een cultuurplaat. Voeg drie tot vier milliliter CMT in elke put van een 6-well plaat voor de amandelen en een milliliter per goed in een 12-well plaat voor de baarmoederhals. Plaats de platen in de couveuse, ingesteld op 37 graden Celsius, 5% CO2, en groter dan of gelijk aan 90% vochtigheid totdat de weefselexplants klaar zijn om op de sponzen te worden geladen.Breng de amandelen van de transportcontainer in een 100 millimeter petrischaal met 10 tot 20 milliliter CMT met behulp van steriele tangen. Gebruik het deksel van de petrischaal als snijoppervlak om het weefsel te ontleden. Houd het weefsel voorzichtig met tangen, snijd elke amandel in verschillende, grote stukken met behulp van een steriele scalpel en mes.Gebruik tangen en een scalpel om cauterized, bloederig en vleesboom weefsel te verwijderen, evenals alle delen met tonsillolieten of groenbruine kleur. Snijd elk weefsel stuk in plakjes van ongeveer twee millimeter in dikte. Verwijder elk ongewenst onderdeel zoals in de vorige stap.Snijd vervolgens de plakjes weefsel in twee millimeter dikke reepjes. Tot slot, snijd de weefsel strips in twee millimeter dikke blokken. Breng de explants in een nieuwe 100 millimeter petrischaal met 10 tot 20 milliliter CMT om weefselverdroging te voorkomen tijdens het doorlopen van de dissectie.Aan het einde van de dissectie, draai de plaat om de explant distributie te randomiseren. Plaats negen weefsel explants op de top van elke gelatine spons in een 6-well plaat met behulp van tangen, waardoor ruimte tussen hen. Breng de platen terug naar de couveuse.Typisch, explants zijn 's nachts gekweekt. Inenting met HIV wordt de volgende dag uitgevoerd. Dit is om ervoor te zorgen dat er geen bacteriële of schimmel besmetting ontwikkelt in de cultuur.Ook hebben cellen de neiging om weefselexplants onmiddellijk na dissectie achteruit te gaan. Aspirate het medium in de 6-put plaat met een pipet, en gooi het in een container met ontsmettingsmiddel oplossing. Kantel de plaat en duw de gelatinesponzen voorzichtig naar het bovenste deel van de put om het medium aan de onderkant te kunnen verzamelen.Aanzuigen en het medium weggooien. Voeg vervolgens drie tot vier milliliter CMT aan elke put. Ontdooi nu de hiv-1 virusvoorbereiding in het waterbad bij 37 graden Celsius.Pipette het virus entmateriaal direct op de top van elk van de negen explants op een gelatine spons. Breng de plaat terug naar de couveuse. Gebruik het deksel van de petrischaal als snijoppervlak om het weefsel te ontleden.Houd het weefsel voorzichtig met tangen, scheid het slijmvlies van de ectocervix en/of endocervix van de onderstromer en submucosa met een scalpel en mes om stroken slijmvlies te verkrijgen. Snijd het slijmvlies in twee millimeter brede stroken. Verwijder en gooi zoveel mogelijk submucosa weg, waardoor er slechts een twee millimeter dikke laag weefsel overblijft.Snijd vervolgens de strips in twee millimeter dikke blokken. Breng weefselexplants in een nieuwe 100 millimeter petrischaal met 10 tot 20 milliliter CMT om weefselverdroging te voorkomen tijdens het doorlopen van de dissectie. Aan het einde van de dissectie, draai de plaat om de explant distributie te randomiseren.Breng met steriele tangen de explants over in steriele 1,5 milliliter conische buizen. Verwijder elk medium in de buis met behulp van een pipet. Voor optimale resultaten moeten explants van baarmoederhals zo snel mogelijk na de operatie worden verwerkt en geïnfecteerd, idealiter de dag van de operatie.Als alternatief kunnen weefsels worden opgeslagen ondergedompeld in CMT op 4 graden 's nachts en onmiddellijk besmet na dissectie. Ontdooi de HIV-1 preparaat in een waterbad bij 37 graden Celsius. Eenmaal ontdooid, breng het virus in de buizen met de explants.Breng de buizen in een thermoshaker, en incubeer gedurende twee uur bij 37 graden Celsius schommelen bij 300 rpm. Draai de buizen voorzichtig een paar keer om de 30 tot 60 minuten om. Vul ondertussen een 6-put plaat met drie tot vier milliliter per put steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing.Gebruik aan het einde van de incubatie met HIV-1 een pipet om alle virusvoorbereiding in de buizen met de explants in een container met ontsmettingsmiddeloplossing te verwijderen. Gebruik dan tangen en een pipet om de explants over te brengen in de 6-put plaat met PBS. Nadat de explants een minuut op kamertemperatuur in PBS hebben laten rusten, was ze door de PBS twee tot drie keer zachtjes op en neer in de put te pipetten.Gooi vervolgens de PBS in een container met ontsmettingsmiddel oplossing met behulp van een pipet. Voeg drie tot vier milliliter nieuwe PBS aan elke put. Herhaal nog twee keer voor een totaal van drie wasbeurten.Gooi de PBS net voor het overbrengen van de explants naar de sponzen om weefsel uitdroging te voorkomen. Gebruik nu tangen om vijf tot acht explants op de top van elke gelatine spons in een 12-well plaat. Breng de plaat terug naar de couveuse.Verzamel een monster van cultuur medium met een pipet, en breng het in steriele 1,5 of twee milliliter schroefdop buizen voor opslag bij min 80 graden Celsius. Oogst de weefselexplants met steriele tangen en breng de explants over in steriele 1,5 of twee milliliter schroefdopbuizen. Verwerk of bewaar de weefselmonsters zoals vereist door het experiment.Aspirate het restcultuurmedium in de put met een pipet en gooi het weg in een container met ontsmettingsmiddeloplossing. Kantel de plaat en duw de gelatinesponzen voorzichtig naar het bovenste deel van de put om het medium aan de onderkant te laten verzamelen, en vervolgens aan tezuilen en weg te gooien. Voeg nu drie tot vier milliliter cultuurmedium toe aan elke put.Met behulp van steriele tangen, terug alle weefsel explants die gedaald in het medium aan de gelatine spons alvorens de plaat terug te keren naar de incubator. Gooi aan het einde van de cultuur al het biologisch afval in apposite containers volgens de voorschriften van het instituut voor de behandeling van gevaarlijke biologische stoffen en de specifieke risicobeoordeling. Interdonorvariabiliteit kan hiv-1 replicatie beïnvloeden, gemeten door de concentratie van het HIV-kerneiwit p24-prop in weefsel dat de kweeksupernatant is, zoals aangetoond voor baarmoederhalsweefsel van drie verschillende donoren die besmet zijn met hetzelfde virusenoculum.Voor de eerste donor duidt de accumulatie van p24-prop in kweekmedium van explants die alleen besmet zijn met HIV-1 BaL duidelijk op een productinfectie. De antiretrovirale drug 3TC dat volledig inbreven HIV replicatie werd gebruikt als een negatieve controle. De hoeveelheid p24 gag gemeten in kweekmedium van 3TC-behandelde explanten onthult de fractie van het virus en het ene inoculum dat specifiek wordt geabsorbeerd en vrijgegeven door weefselexplants tijdens de kweek.In weefselexplants van de tweede donor, HIV-1 darminfectie resulteert in een gestage daling van de concentratie van p24 gag na verloop van tijd, wat wijst op een mislukking van de infectie of niet op te sporen door p24 gag kwantificering. Dit wordt bevestigd door 3TC-behandelde controle-explants die een soortgelijke HIV-replicatie kinetische vertonen. Infectie van weefselexplants van de derde donor levert weinig virus op.In dit geval is het opnemen van de 3TC-behandeling als een negatieve controle noodzakelijk om de aanwezigheid van infectie met de novo-virusproductie vast te stellen. Na deze procedure kunnen analytische methoden zoals stroomcytometrie of immunostaining op verschillende tijdstippen worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden over fenotype, verhouding of weefsellocatie van de celpopulatie van belang. Bij het ontwerpen van het experiment is het belangrijk om de impact van interdonorvariabiliteit op de experimentele uitlezing van keuze te schatten.Interdonorvariabiliteit kan gedeeltelijk worden gecontroleerd door strenge klinische en eventueel experimentele inclusie- en uitsluitingscriteria vast te stellen. Ex vivo menselijke weefselculturen kunnen worden gebruikt om de pathogenese van andere microben dan HIV te bestuderen, zoals vacciniavirus of herpesvirussen. Ze zijn ook gebruikt als een preklinisch platform voor antimicrobiële toxiciteit en ethicacy studies.Houd er rekening mee dat alle menselijke exemplaren, zelfs van gezonde individuen, besmettelijke stoffen kunnen herbergen. Passend onderwijs, training en bescherming zijn nodig om menselijke weefsels te behandelen om de veiligheid van u en uw collega's te garanderen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial antigeen presenterende cellen voor efficiënte Ex vivo Uitbreiding van de Mens CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolatie van Lymfocyten van Mouse geslachtsorganen Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Het beoordelen van de Aangeboren Sensing van HIV-1 geïnfecteerde CD4<sup&gt; +</sup&gt; T cellen door plasmacytoïde dendritische cellen gebruiken een<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultuur systeem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocyt Isolatie van Human Skin voor Fenotypische Analyse en<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Paarsgewijze Groei Competitie Assay voor het bepalen van de Replicatie Fitness van Human Immunodeficiency Virussen

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infectie van Muizen Epidermis met Herpes simplex virus type 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse van lymfocyt extravasatie gebruik van een<em&gt; In Vitro</em&gt; Model van het menselijk bloed-hersenbarrière

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optische Screening van nieuwe bacteriën-specifieke sondes op Ex Vivo menselijke longweefsel door Confocale Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...