Name: ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture
Uploaded: 2018-10-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse der Stiftung Blanceflor Boncompagni Ludovisi geb. Bildt (http://blanceflor.se/), die Stiftung schwedische Ärzte gegen AIDS (http://www.aidsfond.se/, Ref. FOa2014-0006) und Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/), Andrea Introini.

Das Protokoll für die Sammlung von menschlichem Gewebe kann von den zuständigen Kommunen ethische genehmigungspflichtig. Im Falle der angegebenen Operationen wie z. B. Tonsillektomie und Hysterektomie die Exemplare sind nicht speziell für Forschung Zweck gesammelt und die Studie gilt nicht menschlichen Probanden Forschung (National Institutes of Health. Forschung am Menschen. https://humansubjects.nih.gov/Walkthrough-Investigator#tabpanel11). Gewebespender persönlichen und medizinischen Daten jedoch zu erhalten (...

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	<li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+HIV-1+phenotype+switch+as+a+causal+factor+in+acquired+immunodeficiency.">Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency.</a> Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).</li><li>Dezzutti, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+and+human+mucosal+tissue+models+to+study+HIV+biomedical+interventions:+can+we+predict+success.">Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success.</a> J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).</li><li>Lederman, M. M., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+node+in+HIV+pathogenesis.">The lymph node in HIV pathogenesis.</a> Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).</li><li>Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. 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S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+human+immunodeficiency+virus+infection+of+human+cervical+tissue+and+inhibition+by+vaginal+virucides.">Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides.</a> J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+sexual+transmission:+early+events+of+HIV-1+infection+of+human+cervico-vaginal+tissue+in+an+optimized+ex+vivo+model.">HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model.</a> Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+facilitates+HIV-1+transmission+to+cervico-vaginal+tissue+ex+vivo.">Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo.</a> PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+and+dynamic+immunofluorescent+cytometric+bead+assay+for+the+detection+of+HIV-1+p24.">A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24.</a> J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).</li><li>Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=War+and+peace+between+microbes:+HIV-1+interactions+with+coinfecting+viruses.">War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses.</a> Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).</li><li>Keele, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection.">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).</li><li>Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+testing+of+candidate+topical+microbicides+for+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity+and+tissue+toxicity+in+a+human+cervical+explant+culture.">Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+colorectal+explant+culture+to+evaluate+topical+microbicides+for+the+prevention+of+HIV+infection.">A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection.</a> J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Productive+HIV-1+infection+of+human+cervical+tissue+ex+vivo+is+associated+with+the+secretory+phase+of+the+menstrual+cycle.">Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle.</a> Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).</li></ol>

Die Verwendung von menschlichem Gewebe explants für das Studium der HIV-1-Infektion Vorteile gegenüber den herkömmlichen zweidimensionalen und außerdem experimentellen Systemen wie Primärzellen oder Zell-Linien, durch ihre überlegene Fähigkeit zur Fortpflanzung interzelluläre Wechselwirkungen bietet und zelluläre Funktionen (z.B.Produktion von Zytokinen) sind in Vivo. Dennoch, Tonsillen und zervikalen Gewebe unterscheiden sich in vielerlei Hinsicht, einschließlich der Anzahl und phänotypische...

Außerdem Bi-dimensionale Zellkulturen, hier bezeichnet als herkömmliche, entfallen nicht die räumliche und funktionale Kommunikation zwischen der Vielzahl von Zelltypen, die Gewebe zu komponieren und Organe. Dieser Aspekt ist von größter Bedeutung für experimentelle Modelle der Krankheit, wie Interferenz mit den homöostatischen interzelluläre Wechselwirkungen der treibende Faktor für alle Krankheiten ist. Gewebe-Explantaten bieten entscheidende Vorteile für die Modellierung von Gesundheit und Krankheit beim Menschen, weil sie die Cytoarchitecture und viele wichtige funktionale Aspekte der Organe behalten, wie sie in Vivo, obwohl für eine begrenzte Zeit1. Beispielsweise auf ex Vivo mit Recall-Antigenen, wie Diphtherie-Toxoid oder Tetanus-Toxoid, reagiert rachenabstrichen Gewebe mit einer starken Produktion von Antigen-Antikörper-2. Wie jedes andere ex Vivo Modell, Histoculture hat seine eigenen Grenzen: Inter Spender Variabilität, Gewebe Polarisation, begrenzte Gewebe überleben und Schwierigkeiten bei der Überwachung der Zellen über die Tiefe der konfokalen Mikroskopie1. Menschliches Gewebe Explantaten dennoch ein Modell der Wahl homöostatische und pathogene immunologische Prozesse im Menschen, einschließlich der Wirt-Pathogen Interaktionen und mögliche therapeutische Interventionen3zu studieren.
Die kritischen Ereignisse der Pathogenese der HIV-1 statt in Geweben. Infektion der genitalen Schleimhaut Konten für die Mehrheit aller HIV-1-Übertragung Veranstaltungen weltweit4. Lymphgewebe ist der Hauptaufstellungsort der Replikation des Virus während der akuten Infektion birgt einen erheblichen Pool von latent infizierten Zellen5und ihre Beharrlichkeit ist das Haupthindernis für eine Heilung6zu erreichen. Die Kultur und ex-Vivo Herausforderung der menschlichen lymphatischen und Schleimhaut-Gewebe bieten einige Vorteile gegenüber herkömmlichen Systemen auf Basis von isolierten Zellen für die Untersuchung von HIV-1. Gewebe-Resident Zellen können beispielsweise HIV-1-Infektion ohne exogene Aktivierung, im Gegensatz zu peripheren mononukleären Zellen1unterstützen. Die Verwendung von Lymphgewebe Explantaten erlaubt ein besseres Verständnis für einige wichtigen Mechanismen, die CD4-T Zelle Entleerungd. h., die Bystander Effekt7, das ist das Markenzeichen der akuten Infektion hat. Die Erhaltung der Strukturen wie B-Zell-Follikel im Lymphgewebe8 und das Epithel in weiblichen genitalen Schleimhaut Explantaten9 bietet die einzigartige Möglichkeit, räumliche und funktionelle Eigenschaften von HIV-1-Infektion an diesen Standorten zu integrieren. Schließlich wurden Histocultures erfolgreich Modell und Studie HIV-1 und Herpes-Co-Infektion10,11, verwendet sowie für präklinische Tests von antiretroviralen Medikamenten und Multitarget Mikrobizide12, 13 , 14 , 15.
Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Kultur der menschlichen Gewebe Explantaten aus Mandeln und Schleimhaut aus den unteren weiblichen Genitaltrakt (Zervix), gewonnen mit Gewebe Dissektion um Herausforderung mit HIV-1 in einer Weise unpolarisierte explant. Die Kultur der Gewebe Explantaten an der Air liquide-Schnittstelle, mit Gelatine Schwämmen als Unterstützung, maximiert die Exposition um Sauerstoff der Luft und bietet Zugriff auf Nährmedium Nährstoffe durch den Schwamm Kapillaren, verzögert ihre natürlichen Verfall. Die unmittelbarste Weise HIV-1-Replikation in unserem System zu bewerten ist, Messen Sie die Menge des Virus in das Kulturmedium Explant im Laufe der Zeit von Immunoassay oder qPCR freigegeben. HIV-1-Infektion und Pathogenese (zB., CD4 T Zelle Entleerung) können auch im Gewebe Explantaten durch Masse RNA/DNA-Extraktion und qPCR, in Situ Beflecken oder einzelne Zellanalyse auf Gewebe Verdauung durch Durchflusszytometrie ausgewertet werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:941px;" width="940">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Pfizer</td>
			<td style="width:141px;">NDC:&#160; 0009-0315-08</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">SPONGOSTAN Standard 70 &#215; 50 &#215; 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge</td>
			<td>Ferrosan Medical Devices</td>
			<td>MS0002</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">RPMI 1640 with phenol red and glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Modified Eagle&#39;s medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sodium pyruvate, 100 mM (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Gentamicin 50 mg/mL (1000x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15750037</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Amphotericin B 250 &#956;g/mL (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:49px;width:280px;">Ticarcillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5639-1G</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:280px;">Potassium clavulanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33454-100MG</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:280px;">Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;">To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile cell culture grade water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile transportation container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Disinfectant solution for biological waste disposal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal forceps or tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile flat weighing metal spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile scalpels and blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">6-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">12-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Petri dish, 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>510</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>2522</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Lamivudine (3TC)</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>8146</td>
			<td style="width:345px;">Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:280px;">Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 &#176;C, 5% CO2, &#8805; 90% humidity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Water bath set at 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
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			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 &#176;C, 300 rpm</td>
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ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture

Histocultures erlauben Untersuchung interzelluläre Wechselwirkungen im menschlichen Gewebe, und sie können Modell Wirt-Pathogen Interaktionen unter kontrollierten Laborbedingungen eingesetzt werden. Ex-Vivo -Infektion des menschlichen Gewebes mit Human Immunodeficiency Virus (HIV), unter anderen Viren hat erfolgreich zur frühen Pathogenese der Krankheit, sondern als Plattform zum Testen der Wirksamkeit und Toxizität von antiviralen Medikamenten untersuchen. In diesem Protokoll erklären wir, wie zu verarbeiten und mit HIV-1 Gewebe Explantaten aus menschlichen Tonsillen und Gebärmutterhalskrebs Schleimhäute infizieren und pflegen sie in Kultur auf Gelatine Schwämmen an der Air liquide-Schnittstelle für etwa zwei Wochen. Dieser unpolarisierte Kultureinstellung maximiert Zugang zu Nährstoffen in Kulturmedium und Sauerstoff, obwohl fortschreitenden Verlust von Gewebe Integrität und funktionale Architekturen die wichtigste Einschränkung bleibt. Diese Methode ermöglicht die Überwachung von HIV-1-Replikation und Pathogenese mit mehreren Techniken, einschließlich Immunoassays, qPCR und Durchflusszytometrie. Von Bedeutung kann die physiologische Variabilität zwischen Gewebespender sowie Explantaten aus verschiedenen Bereichen der gleichen Probe, experimentelle Ergebnisse erheblich beeinträchtigen. Um Ergebnis Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, ist es wichtig, eine ausreichende Anzahl von Explantaten, technische repliziert und Spender abgestimmt Kontrolle Bedingungen verwenden, um die Ergebnisse der experimentellen Behandlungen zu normalisieren, wenn Sie Daten aus mehreren Experimenten zu kompilieren (dh ., durchgeführt mit Gewebe von verschiedenen Spendern) zur statistischen Auswertung.

Verschiedene Techniken lässt sich HIV-1-Replikation in Gewebe Explantaten zu beurteilen. Unsere standard Auslesen ist um die Menge des HIV-1-p24gag veröffentlicht im Laufe der Zeit mit einem Immunoassay18CM messen.
Gewebe-Explantaten von verschiedenen Spendern, infiziert mit der gleichen Inokulum der gleichen HIV-1 Aktie, können unterschiedliche Mengen des Virus (Tabelle 1) ...

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Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infektion des menschlichen Gewebes mit Human Immunodeficiency Virus (HIV) ex Vivo bietet eine wertvolle 3D-Modell des Virus Pathogenese. Hier beschreiben wir ein Protokoll zu verarbeiten und infizieren Gewebeproben aus menschlichen Tonsillen und weiblichen genitalen Schleimhäute mit HIV-1 und in der Kultur an der Air liquide-Schnittstelle zu erhalten.

Ex-Vivo Infektion der lymphatischen Gewebe und weiblichen genitalen Schleimhaut mit Human Immunodeficiency Virus 1 und Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im HIV-Bereich zu beantworten, wie die Identifizierung der Determinanten der Virusübertragung und Pathogenese innerhalb von zwei der am stärksten von der Infektion bewirkten Organe. In der Tat, die wichtigsten fortgeschrittenen Antriebskrankheit Progression finden in Geweben. Die Merkmale und die Komplexität der Infektion werden schlecht durch Zellen im Umlauf reflektiert oder isoliert und infiziert in vitro.Der Hauptvorteil der Ex-vivo-Gewebekultur zur Untersuchung der HIV-Pathogenese besteht darin, dass sie ihre ursprünglichen räumlichen und funktionellen Beziehungen zwischen den Zellen behält, wenn auch für zwei bis drei Wochen. Zu Beginn füllen Sie eine 100 Millmeter x 20 Millimeter Petrischale mit 20 bis 30 Milliliter CMT. Übertragen Sie Gelatineschwämme mit steriler Zange in die Petrischale.Befeuchten Sie die Schwämme auf beiden Seiten und lassen Sie die Schwämme für eine Minute aufsaugen. Drücken Sie die Schwämme mit einem sterilen Spachtel etwa zwei Minuten lang gegen den Boden der Petrischale. Verwenden Sie eine sterile Schere, um die rehydrierten Gelatineschwämme in Stücke gleicher Größe von etwa einem Quadratzentimeter zu schneiden.Dann verwenden Sie Zange, um ein Schwammstück in jeden Brunnen einer Kulturplatte zu übertragen. Fügen Sie drei bis vier Milliliter CMT in jeden Brunnen einer 6-Well-Platte für die Mandeln und einen Milliliter pro Brunnen in eine 12-Well-Platte für den Gebärmutterhals. Legen Sie die Platten in den Inkubator, auf 37 Grad Celsius, 5% CO2 und größer oder gleich 90% Luftfeuchtigkeit, bis die Gewebeexplants bereit sind, auf die Schwämme geladen zu werden.Übertragen Sie die Mandeln aus dem Transportbehälter in eine 100-Millimeter-Petrischale mit 10 bis 20 Milliliter CMT mit sterilen Zangen. Verwenden Sie den Deckel der Petrischale als Schnittfläche, um das Gewebe zu sezieren. Halten Sie das Gewebe vorsichtig mit Zangen, schneiden Sie jede Mandel in verschiedene, große Stücke mit einem sterilen Skalpell und Klinge.Verwenden Sie Zangen und ein Skalpell, um kauterisiertes, blutiges und fibroidfarbenes Gewebe sowie alle Teile zu entfernen, die Tonsillolithen oder grünlich-braune Farbe enthalten. Schneiden Sie jedes Gewebestück in Scheiben von etwa zwei Millimetern Dicke. Entfernen Sie alle unerwünschten Teile wie im vorherigen Schritt.Dann schneiden Sie die Gewebescheiben in zwei Millimeter dicke Streifen. Schließlich schneiden Sie die Gewebestreifen in zwei Millimeter dicke Blöcke. Übertragen Sie die Explanten in eine neue 100-Millimeter-Petrischale mit 10 bis 20 Milliliter CMT, um gewebevernichtenung zu vermeiden, während Sie mit der Zerlegung fortfahren.Am Ende der Sezierung wirbeln Sie die Platte, um die Explantationsverteilung zu randomisieren. Legen Sie neun Gewebeexplantationen auf jedem Gelatineschwamm in eine 6-Well-Platte mit Zangen, so dass Raum zwischen ihnen. Bringen Sie die Platten an den Inkubator zurück.Typischerweise werden Explants über Nacht kultiviert. Die Impfung mit HIV wird am nächsten Tag durchgeführt. Damit soll sichergestellt werden, dass sich in der Kultur keine bakterielle oder pilzliche Kontamination entwickelt.Auch, Zellen neigen dazu, Gewebe explantieren unmittelbar nach der Zerlegung zurück. Das Medium in der 6-Well-Platte mit einer Pipette ansaugen und in einem Behälter mit Desinfektionslösung entsorgen. Neigen Sie die Platte und drücken Sie die Gelatineschwämme vorsichtig auf den oberen Teil des Brunnens, damit sich das Medium am Boden sammeln kann.Aspirieren und entsorgen Sie das Medium. Dann fügen Sie drei bis vier Milliliter CMT zu jedem Brunnen. Tauen Sie nun die HIV-1-Virus-Vorbereitung im Wasserbad bei 37 Grad Celsius.Pipette das Virus inoculum direkt auf jeder der neun Explants auf einem Gelatineschwamm. Geben Sie die Platte an den Inkubator zurück. Verwenden Sie den Deckel der Petrischale als Schnittfläche, um das Gewebe zu sezieren.Halten Sie das Gewebe sanft mit Zangen, trennen Sie die Schleimhaut des Ektocervix und/oder Endocervix von der unter stromalen und Submucosa mit einem Skalpell und einer Klinge, um Schleimhautstreifen zu erhalten. Die Schleimhaut in zwei Millimeter breite Streifen schneiden. Entfernen und entsorgen Sie so viel Submucosa wie möglich, so dass nur eine zwei Millimeter dicke Gewebeschicht übrig bleibt.Dann schneiden Sie die Streifen in zwei Millimeter dicke Blöcke. Übertragen Sie Gewebeexplantationen in eine neue 100-Millimeter-Petrischale mit 10 bis 20 Milliliter CMT, um Gewebeaustrocknung zu vermeiden, während Sie mit der Zerlegung fortfahren. Am Ende der Sezierung wirbeln Sie die Platte, um die Explantationsverteilung zu randomisieren.Mit sterilen Zangen die Expflanzen in sterile 1,5 Milliliter konische Schläuche übertragen. Entfernen Sie ein beliebiges Medium im Rohr mit einer Pipette. Für optimale Ergebnisse sollten Explantationen des Gebärmutterhalses so schnell wie möglich nach der Operation, idealerweise am Tag der Operation, verarbeitet und infiziert werden.Alternativ können Gewebe über Nacht bei 4 Grad in CMT gelagert und unmittelbar nach der Zerlegung infiziert werden. Das HIV-1-Präparat in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius auftauen. Nach dem Auftauen das Virus in die Röhren mit den Explants übertragen.Die Rohre in einen Thermoshaker geben und bei 300 U/min zwei Stunden bei 37 Grad Celsius schaukeln. Die Rohre alle 30 bis 60 Minuten vorsichtig umkehren. In der Zwischenzeit füllen Sie eine 6-Well-Platte mit drei bis vier Milliliter pro Brunnen steriler Phosphat gepufferte Kochstoff.Verwenden Sie am Ende der Inkubation mit HIV-1 eine Pipette, um alle Viruspräparationen in den Rohren, die die Expflanzen enthalten, in einen Behälter mit Desinfektionslösung zu entsorgen. Dann verwenden Sie Zange und eine Pipette, um die Expflanzen in die 6-Well-Platte mit PBS zu übertragen. Nachdem die Explants eine Minute bei Raumtemperatur in PBS ruhen lassen, waschen Sie sie, indem Sie das PBS zwei- bis dreimal sanft in den Brunnen ein- und auspfeifen.Entsorgen Sie dann die PBS mit einer Pipette in einen Behälter mit Desinfektionslösung. Fügen Sie drei bis vier Milliliter neue PBS zu jedem Brunnen hinzu. Wiederholen Sie zwei weitere Male für insgesamt drei Wähbe.Entsorgen Sie das PBS kurz vor der Übertragung der Expflanzen auf die Schwämme, um Gewebeaustrocknung zu vermeiden. Verwenden Sie nun Zangen, um fünf bis acht Expflanzen auf jedem Gelatineschwamm in eine 12-Well-Platte zu übertragen. Geben Sie die Platte an den Inkubator zurück.Sammeln Sie eine Probe von Kulturmedium mit einer Pipette, und übertragen Sie es in sterile 1,5 oder zwei Milliliter Schraubverschluss Rohre für die Lagerung bei minus 80 Grad Celsius. Ernten Sie die Gewebeexplanten mit sterilen Zangen und übertragen Sie die Expflanzen in sterile 1,5 oder zwei Milliliter Schraubkappenrohre. Verarbeiten oder lagern Sie die Gewebeproben, wie es das Experiment erfordert.Mit einer Pipette das Restkulturmedium im Brunnen ansaugen und in einen Behälter mit Desinfektionslösung entsorgen. Neigen Sie die Platte und drücken Sie die Gelatineschwämme vorsichtig auf den oberen Teil des Brunnens, damit sich das Medium unten sammeln kann, und dann ansaugen und entsorgen. Fügen Sie nun drei bis vier Milliliter Kulturmedium zu jedem Brunnen hinzu.Mit sterilen Zangen alle Gewebeexplanten, die in das Medium fielen, in den Gelatineschwamm zurück, bevor sie die Platte an den Inkubator zurückgeben. Entsorgen Sie am Ende der Kultur alle biologischen Abfälle in entsprechenden Behältern nach den Vorschriften des Instituts zum Umgang mit gefährlichen Biologischen sowie der spezifischen Risikobewertung. Die Variabilität zwischen DenSpendern kann sich auf die HIV-1-Replikation auswirken, gemessen an der Konzentration des HIV-Kernproteins p24-Gag simmieren, wie für Gebärmutterhalsgewebe von drei verschiedenen Spendern, die mit demselben Virus inoculum infiziert sind, nachgewiesen wird.Für den Erstspender deutet die Anhäufung von p24-Gag im Kulturmedium von mit HIV-1 BaL infizierten Explanten eindeutig auf eine Produktinfektion hin. Das antiretrovirale Medikament 3TC, das die HIV-Replikation vollständig abhebt, wurde als Negativkontrolle verwendet. Die Menge an p24-Gag, gemessen im Kulturmedium von 3TC-behandelten Explanten, zeigt den Anteil des Virus inoculum, das speziell absorbiert und von Gewebeexplanten während der Kultur freigesetzt wird.Bei Gewebeexplanten des zweiten Spenders führt eine HIV-1-Darminfektion zu einer stetigen Abnahme der Konzentration von p24-Gag im Laufe der Zeit, was auf einen Abtschlag der Infektion oder nicht nachweisbar durch p24-Gag-Quantifizierung hindeutet. Dies wird durch 3TC-behandelte Kontrollexate bestätigt, die eine ähnliche HIV-Replikation kinetisch zeigen. Die Infektion von Gewebeexplantationen des dritten Spenders führt zu einer geringen Virusmenge.In diesem Fall ist die Einbeziehung der 3TC-Behandlung als Negativkontrolle erforderlich, um das Vorhandensein einer Infektion mit der Produktion von De-Novo-Viren festzustellen. Nach diesem Verfahren können analytische Methoden wie Durchflusszytometrie oder Immunfärbung zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt werden, um Fragen über Phänotyp, Proportion oder Gewebeposition der zellabhängigen Zellpopulation zu beantworten. Bei der Gestaltung des Experiments ist es wichtig, die Auswirkungen der Variabilität zwischen den Spendern auf die experimentelle Auslesung der Wahl abzuschätzen.Die Variabilität zwischen den Spendern kann teilweise durch die Festlegung strenger klinischer und möglicherweise experimenteller Inklusions- und Ausschlusskriterien kontrolliert werden. Ex vivo menschliche Gewebekulturen können verwendet werden, um die Pathogenese von Mikroben außer HIV zu untersuchen, wie z. B. Impfvirus oder Herpesviren. Sie wurden auch als präklinische Plattform für antimikrobielle Toxizität und Ethicacy-Studien verwendet.Bitte beachten Sie, dass alle menschlichen Exemplare, auch von gesunden Individuen, Infektionserreger beherbergen können. Für den Umgang mit menschlichen Geweben sind angemessene Schulungen, Schulungen und Schutzmaßnahmen erforderlich, um die Sicherheit von Ihnen und Ihren Mitarbeitern zu gewährleisten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Basierend Artificial Antigen-präsentierende Zellen für eine effiziente Ex vivo Erweiterung des menschlichen CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolierung von Lymphozyten aus Maus Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Beurteilung der Innate Sensing von HIV-1-infizierten CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-Zellen durch Plasmazytoide Dendritische Zellen unter Verwendung eines<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Co-Kultursystem.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Paarweise Wachstum Wettbewerb Assay zur Bestimmung der Replication Fitness von Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infektion von murinen Epidermis mit Herpes Simplex Virus Typ 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analyse von Lymphozyten-Extravasation einer Verwendung<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell des Barrier Menschliches Blut-Hirn

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optische Überprüfung der neuartige Bakterien-spezifischen Sonden auf Ex Vivo menschlichen Lungengewebe durch konfokale Laser Endomikroskopie

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...