Name: ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture
Uploaded: 2018-10-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים בילדט לבית של קרן Blanceflor Boncompagni לודוויזי (http://blanceflor.se/), הרופאים שבדי קרן נגד איידס (http://www.aidsfond.se/, הפניה למעורר FOa2014-0006), ו- e דל'אנג'לו אנדריאה Lorini ליבי (http : / / fondazionelorini.it/) כדי אנדראה Introini.

הפרוטוקול עבור אוסף של רקמות עשויים לדרוש אישור מוסרי על ידי הרשויות המוסמכות מקומיים. במקרה של ניתוחים המצוין כגון ניתוח שקדים, כריתת רחם, הדגימות לא שנאספו במיוחד לצורך המחקר, המחקר אינו נחשב ניסויים מחקר (המכון הלאומי לבריאות. מחקר בנושאים האנושית. https://humansubjects.nih.gov/walkthrough-investigator#tabpanel11). ?...

<ol>
	<li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+HIV-1+phenotype+switch+as+a+causal+factor+in+acquired+immunodeficiency.">Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency.</a> Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).</li><li>Dezzutti, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+and+human+mucosal+tissue+models+to+study+HIV+biomedical+interventions:+can+we+predict+success.">Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success.</a> J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).</li><li>Lederman, M. M., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+node+in+HIV+pathogenesis.">The lymph node in HIV pathogenesis.</a> Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).</li><li>Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reservoirs+as+obstacles+and+opportunities+for+an+HIV+cure.">HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure.</a> Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induced+activation+of+CD4++T+cells+creates+new+targets+for+HIV-1+infection+in+human+lymphoid+tissue+ex+vivo.">HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo.</a> Blood. 111 (2), 699-704 (2008).</li><li>Van Laar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+secretion+of+immunoglobulin+by+long-lived+human+tonsil+plasma+cells.">Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells.</a> Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).</li><li>Introini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminal+plasma+induces+inflammation+and+enhances+HIV-1+replication+in+human+cervical+tissue+explants.">Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants.</a> PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).</li><li>Grivel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+CCR5-+but+not+CXCR4-tropic+HIV-1+in+lymphoid+tissue+by+human+herpesvirus+6.">Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6.</a> Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).</li><li>Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type-2+stimulates+HIV-1+replication+in+cervical+tissues:+implications+for+HIV-1+transmission+and+efficacy+of+anti-HIV-1+microbicides.">Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).</li><li>Lisco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+is+activated+into+a+HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+in+herpesvirus-infected+human+tissues.">Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues.</a> Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).</li><li>Vanpouille, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+anti-cytomegalovirus+drug,+ganciclovir,+inhibits+HIV-1+replication+in+human+tissues+ex+vivo.">A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo.</a> AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).</li><li>Andrei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+tenofovir,+a+microbicide+effective+against+HIV,+inhibits+herpes+simplex+virus-2+replication.">Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication.</a> Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).</li><li>Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+human+immunodeficiency+virus+infection+of+human+cervical+tissue+and+inhibition+by+vaginal+virucides.">Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides.</a> J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+sexual+transmission:+early+events+of+HIV-1+infection+of+human+cervico-vaginal+tissue+in+an+optimized+ex+vivo+model.">HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model.</a> Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+facilitates+HIV-1+transmission+to+cervico-vaginal+tissue+ex+vivo.">Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo.</a> PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+and+dynamic+immunofluorescent+cytometric+bead+assay+for+the+detection+of+HIV-1+p24.">A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24.</a> J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).</li><li>Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=War+and+peace+between+microbes:+HIV-1+interactions+with+coinfecting+viruses.">War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses.</a> Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).</li><li>Keele, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection.">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).</li><li>Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+microenvironments+in+the+human+vagina+and+cervix:+mediators+of+cellular+immunity+are+concentrated+in+the+cervical+transformation+zone.">Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone.</a> Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).</li><li>Ganor, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within+1h,+HIV-1+uses+viral+synapses+to+enter+efficiently+the+inner,+but+not+outer,+foreskin+mucosa+and+engages+Langerhans-T+cell+conjugates.">Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).</li><li>Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R5+HIV-1+envelope+attracts+dendritic+cells+to+cross+the+human+intestinal+epithelium+and+sample+luminal+virions+via+engagement+of+the+CCR5.">R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+testing+of+candidate+topical+microbicides+for+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity+and+tissue+toxicity+in+a+human+cervical+explant+culture.">Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+colorectal+explant+culture+to+evaluate+topical+microbicides+for+the+prevention+of+HIV+infection.">A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection.</a> J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Productive+HIV-1+infection+of+human+cervical+tissue+ex+vivo+is+associated+with+the+secretory+phase+of+the+menstrual+cycle.">Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle.</a> Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).</li></ol>

השימוש של רקמה אנושית explants עבור המחקר להידבקות ב- HIV-1 מספק יתרונות על פני המסורתית דו מימדית סוג ניסיוני ומערכות, כגון ראשי תאים או שורות תאים, בשל יכולתם מעולה לשחזור המערכת אינטראקציות ו סלולרי מתפקד (למשל, ייצור ציטוקינים) כפי שהם ויוו. למרות זאת, רקמת השקדים ואת צוואר הרחם שוני?...

תרביות תאים דו מימדית סוג, התייחס כאן כמו קונבנציונאלי, לא חשבון התקשורת המרחבית ופונקציונליים בין מגוון גדול של סוגי תאים שמרכיבים רקמות ואיברים. היבט זה הוא בחשיבות עליונה עבור גרסאות ניסיוניות של מחלות, כמו הפרעה homeostatic אינטראקציות המערכת היא הגורם המניע של כל פתולוגיות. רקמת explants מציעים יתרונות חשובים עבור מידול בריאות ומחלות בבני כי הם שומרים את cytoarchitecture והיבטים רבים חשוב פונקציונלי של איברים כמו הם ויוו, למרות כמות מוגבלת של זמן1. לדוגמה, בעת שמחוץ אתגר עם אנטיגנים האחזור, כגון דיפתריה טוקסואידי או טטנוס טוקסואידי, רקמת השקדים מגיב עם הפקה נמרצת של אנטיגן ספציפי נוגדנים2. כמו שמחוץ מודל אחר, histoculture יש מגבלות משלו: התורם בין השתנות, קיטוב רקמות, רקמות מוגבל הישרדות, הקושי ניטור תאי מעבר עומק מיקרוסקופיה קונפוקלית1. למרות זאת, רקמה אנושית explants נשארים מודל של הבחירה ללמוד תהליכים אימונולוגי homeostatic פתוגניים בבני אדם, כולל אינטראקציות פתוגן-פונדקאי, התערבויות טיפוליות אפשריות3.
האירועים הקריטיים של פתוגנזה HIV-1 מתקיימים ברקמות. דלקת של רירית איברי המין חשבונות עבור הרוב המכריע של כל HIV-1 שידור אירועים ברחבי העולם4. רקמות הלימפה נמצא האתר העיקרי של וירוס שכפול במהלך זיהום אקוטי בנמלים מאגר משמעותי של תאים הנגועים לחשוף5ו ההתמדה שלהם מייצג את המכשול העיקרי להשגת התרופה6. האתגר תרבות, ex-vivo של רקמות הלימפה ואת הרירית לספק כמה יתרונות לעומת מערכות קונבנציונאלי המבוסס על תאים מבודדים עבור המחקר של HIV-1. למשל, שוכנת רקמת תאים יכול לתמוך זיהום ב- HIV-1 בהיעדרו של הפעלה אקסוגני, לעומת תאי תאי דם היקפיים1. השימוש של רקמת הלימפה explants אפשרה הבנה טובה יותר של כמה מנגנונים מרכזיים שבבסיס CD4 T תא דלדולכלומר, אפקט הצופה מהצד7, וזה סימן ההיכר של דלקת חריפה. שימור מבנים כמו תא B זקיקי הלימפה ברקמות8 ו האפיתל רירית איברי המין הנשי explants9 מציע הזדמנות ייחודית לשלב תכונות המרחבי פונקציונלי של זיהום ב- HIV-1 באתרים אלה. לבסוף, histocultures שימשו בהצלחה מודל המחקר HIV-1 וההרפס ושיתוף הידבקות10,11, כמו גם לניסויים פרה של antiretrovirals ו multitarget microbicides12, 13 , 14 , 15.
כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט עבור התרבות של רקמה אנושית explants המתקבל השקדים ורקמות הרירית מ נמוך יותר בדרכי המין הנשי (צוואר הרחם), כיסוי לנתיחה רקמות כדי explant אתגר עם HIV-1 בדרך הלא מקוטב. התרבות של רקמת explants-הממשק אוויר נוזלי, בעזרת ג'לטין ספוגים כמשענת, הגדלת החשיפה מהאוויר חמצן תוך מתן גישה תרבות בינוני חומרים מזינים באמצעות הספוג נימים, ובכך לעכב את הריקבון הטבעי שלהם. הדרך המיידית ביותר להערכת שכפול HIV-1 במערכת שלנו היא למדוד את כמות וירוס שפורסם המדיום תרבות explant לאורך זמן על-ידי מתכלה או qPCR. זיהום ב- HIV-1, פתוגנזה (למשל., דלדול תאי CD4 T) גם ניתן להעריך רקמת explants על-ידי בצובר מיצוי RNA/DNA ו- qPCR, בחיי עיר מכתים או תא בודד-אנליזה על עיכול רקמת מאת cytometry זרימה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:941px;" width="940">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Pfizer</td>
			<td style="width:141px;">NDC:&#160; 0009-0315-08</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">SPONGOSTAN Standard 70 &#215; 50 &#215; 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge</td>
			<td>Ferrosan Medical Devices</td>
			<td>MS0002</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">RPMI 1640 with phenol red and glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Modified Eagle&#39;s medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sodium pyruvate, 100 mM (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Gentamicin 50 mg/mL (1000x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15750037</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Amphotericin B 250 &#956;g/mL (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:49px;width:280px;">Ticarcillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5639-1G</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:280px;">Potassium clavulanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33454-100MG</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:280px;">Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;">To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile cell culture grade water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile transportation container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Disinfectant solution for biological waste disposal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal forceps or tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile flat weighing metal spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile scalpels and blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">6-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">12-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Petri dish, 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>510</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>2522</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Lamivudine (3TC)</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>8146</td>
			<td style="width:345px;">Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:280px;">Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 &#176;C, 5% CO2, &#8805; 90% humidity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Water bath set at 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 &#176;C, 300 rpm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture

Histocultures אפשר ללמוד אינטראקציות המערכת בתוך רקמות אנושיות, הם יכול להיות מועסק כדי דגם אינטראקציות פתוגן-פונדקאי בתנאי מעבדה מבוקרת. Ex-vivo זיהום של רקמות עם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV), בין וירוסים אחרים, שימש בהצלחה לחקור מוקדם בפתוגנזה של המחלה, כמו גם פלטפורמה כדי לבדוק את יעילות ורעילות של תרופות אנטי. בפרוטוקול הנוכחי, נסביר כיצד לעבד, להדביק עם HIV-1 explants רקמת השקדים אנושי, mucosae צוואר הרחם וכן לשמור על אותם בתרבות מעל ג'לטין ספוגים-הממשק נוזלי-אייר למשך שבועיים בערך. הגדרה זו תרבות שאינם מקוטב הגדלת גישה המזינים תרבות בינונית, חמצן, למרות אובדן הדרגתי של רקמות תקינות וארכיטקטורות פונקציונלי נשאר הגבלה הראשי שלה. שיטה זו מאפשרת פיקוח על שכפול HIV-1 ו פתוגנזה בעזרת מספר טכניקות, כולל immunoassays, qPCR של cytometry זרימה. חשיבות, ההשתנות הפיזיולוגיות בין רקמות תורמים, ובין explants מאזורים שונים של הדגימה זהה, עלול להשפיע באופן משמעותי על תוצאות הניסוי. כדי להבטיח תוצאה הפארמצבטית, זה קריטי להשתמש מספר explants, משכפל טכני והתנאים מתאימים התורם שליטה לנרמל את התוצאות של טיפולים ניסיוניים בעת הידור נתונים ניסויים מרובים (כלומר ., מתנהל באמצעות רקמות מתורמים שונים) לשם ניתוח סטטיסטי.

ניתן להשתמש במספר טכניקות כדי להעריך את שכפול HIV-1 ברקמות explants. Read-out הסטנדרטי שלנו היא למדוד את כמות HIV-1 p24מחסום פה שיצא בס מ לאורך זמן עם מתכלה18.
רקמת explants מתורמים שונים, נגוע את inoculum באותה המניה HIV-1 זהה, תניב כמויות שונות ?...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

דלקת של רקמות עם וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV) ex-vivo מספק דגם תלת-ממד חשוב של וירוס פתוגנזה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול לעבד, להדביק דגימות רקמות מן האדם את השקדים mucosae באברי המין הנשי עם HIV-1 ולשמור אותם בתרבות-הממשק נוזלי-אייר.

לשעבר Vivo דלקת של רירית איברי המין האנושי רקמת הלימפה ונקבה עם וירוס הכשל החיסוני האנושי 1, Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום האיידס, כגון זיהוי של הקובעים של העברת וירוסים ופתוגנזה בתוך שניים מהאיברים המשפיעים ביותר על ידי הזיהום. למעשה, התקדמות מחלות הנהיגה המתקדמת העיקרית מתרחשת ברקמות. התכונות והמורכבות של זיהום משתקפים בצורה גרועה על ידי תאים במחזור או מבודדים ונדבקים במבחנה.היתרון העיקרי של תרבות הרקמה ex vivo ללמוד פתוגנזה HIV היא שהיא שומרת על היחסים המקוריים שלה spacial ופונקציונלי בין תאים למרות במשך שבועיים עד שלושה שבועות. כדי להתחיל, למלא 100 מילמטר על ידי 20 מילימטר צלחת פטרי עם 20 עד 30 מיליליטר של CMT. להעביר ספוגי ג'לטין לתוך צלחת פטרי באמצעות ממטרים סטריליים.הרטיבו את הספוגים משני הצדדים ואפשרו לספוג לספוג בינוני למשך דקה אחת. לחץ את הספוגים על החלק התחתון של צלחת פטרי במשך כשתי דקות באמצעות מרית סטרילית. השתמש מספריים סטריליים לחתוך את ספוגי ג'לטין rehydrated לחתיכות בגודל שווה של כ סנטימטר מרובע אחד.ואז להשתמש במטסים כדי להעביר חתיכת ספוג אחת לתוך כל באר של צלחת תרבות. הוסף שלושה עד ארבעה מיליליטר של CMT לתוך כל באר של צלחת 6 באר עבור השקדים ומיליליטר אחד לתוך צלחת 12 באר עבור צוואר הרחם. מניחים את הצלחות באינקובטור, מוגדר ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, וגדול או שווה ל 90% לחות עד מתפוצץ הרקמה מוכנים להיות טעון על הספוגים.מעבירים את השקדים ממכל ההובלה לצלחת פטרי 100 מ"מ המכילה 10 עד 20 מיליליטר CMT באמצעות ממטרים סטריליים. השתמש במכסה של צלחת פטרי כמשטח חיתוך כדי לנתח את הרקמה. מחזיקים את הרקמה בעדינות עם מטלות, חותכים כל שקד לחתיכות שונות וגדולות באמצעות אזמל סטרילי ולהב.השתמש במקלפים ואזמל כדי להסיר רקמה צרובה, מדממת, שרירנית, כמו גם כל החלקים המכילים שקדים או צבע ירקרק-חום. חותכים כל חתיכת רקמה לפרוסות של כשני מילימטרים בעובי. הסר כל חלק לא רצוי כמו בשלב הקודם.ואז לחתוך את פרוסות הרקמה לרצועות בעובי שני מילימטר. לבסוף, חותכים את רצועות הרקמה לגושים בעובי שני מילימטרים. העבר את explants לתוך צלחת פטרי 100 מילימטר חדש המכיל 10 עד 20 מיליליטר של CMT, כדי למנוע ייעוד רקמות תוך כדי המשך עם הניתוח.בסוף הניתוח, מערבולת את הצלחת כדי אקראית התפלגות explant. מניחים תשעה מתפוצצים על גבי כל ספוג ג'לטין בצלחת 6 באר באמצעות מדפים, המאפשר רווח ביניהם. תחזיר את הצלחות לאנקובטור.בדרך כלל, מתפוצצים מתורבתים בן לילה. חיסון עם HIV מבוצע למחרת. זאת כדי לוודא כי אין זיהום חיידקי או פטרייתי מתפתח בתרבות.כמו כן, תאים נוטים לסגת מתפוצץ רקמות מיד לאחר הניתוח. שאפו את המדיום בצלחת 6 באר עם פיפטה, והשליכו אותו במיכל עם תוסף חיטוי. להטות את הצלחת בעדינות לדחוף את ספוגי ג'לטין לחלק העליון של באר כדי לאפשר למדיום לאסוף בתחתית.שאף והשליך את המדיום. לאחר מכן מוסיפים שלושה עד ארבעה מיליליטר של CMT לכל באר. עכשיו להפשיר את הכנת נגיף HIV-1 באמבט המים ב 37 מעלות צלזיוס.פיפטה הווירוס inoculum ישירות על גבי כל אחד מתשעה explants על ספוג ג'לטין. תחזיר את הצלחת לאנקובטור. השתמש במכסה של צלחת פטרי כמשטח חיתוך כדי לנתח את הרקמה.החזקת הרקמה בעדינות במקלות, מפרידים את רירית האקטוקרוויקס ו/או האנדוקרוויקס מתחת לסטרומה ותת-מסיסה עם אזמל ולהב כדי להשיג רצועות רירית. חותכים את רירית לרצועות ברוחב שני מ"מ. הסר והשליך תת-ממוזה רבה ככל האפשר, והשאיר רק שכבה בעובי שני מילימטרים של רקמה.ואז לחתוך את הרצועות לבלוקים בעובי שני מילימטר. להעביר explants רקמות לתוך צלחת פטרי 100 מילימטר חדש המכיל 10 עד 20 מיליליטר של CMT, כדי למנוע ייעוד רקמות תוך כדי המשך עם הניתוח. בסוף הניתוח, מערבולת את הצלחת כדי אקראית התפלגות explant.עם ממטרים סטריליים, להעביר את explants לתוך סטרילי 1.5 צינורות חרוט מיליליטר. הסר כל מדיום בצינור באמצעות פיפטה. לקבלת תוצאות אופטימליות, explants של צוואר הרחם צריך להיות מעובד נגוע בהקדם האפשרי לאחר הניתוח, באופן אידיאלי ביום הניתוח.לחלופין, רקמות ניתן לאחסן שקוע CMT ב 4 מעלות לילה נגוע מיד לאחר הניתוח. להפשיר את הכנת HIV-1 באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר הפשרה, להעביר את הנגיף לתוך הצינורות המכילים את explants.מעבירים את הצינורות לתרמושאקר, ומודרים במשך שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס מתנדנדים ב-300 סל"ד. בעדינות להפוך את הצינורות כמה פעמים כל 30 עד 60 דקות. בינתיים, למלא צלחת 6 באר עם שלושה עד ארבעה מיליליטר לגם של מלוחים סטריליים פוספט מאגר.בסוף הדגירה עם HIV-1, להשתמש פיפטה כדי להשליך את כל הכנת הנגיף בצינורות המכילים את explants לתוך מיכל עם פתרון חיטוי. לאחר מכן השתמש במטסים ובפיגט כדי להעביר את המתפוצצים לצלחת 6 באר המכילה PBS. לאחר מתן אפשרות למתפוצצים לנוח ב- PBS במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, שטפו אותם על ידי צינורות בעדינות את ה- PBS למעלה ולמטה לתוך הבאר פעמיים עד שלוש פעמים.ואז להשליך את PBS לתוך מיכל עם פתרון חיטוי באמצעות פיפטה. הוסף שלושה עד ארבעה מיליליטר של PBS חדש לכל באר. חזור פעמיים נוספות על סך של שלוש שטיפות.השלך את PBS רק לפני העברת explants לספוגים, כדי למנוע ייעוד רקמות. עכשיו להשתמש מדפים להעביר חמישה עד שמונה explants על גבי כל ספוג ג'לטין לתוך צלחת 12 היטב. תחזיר את הצלחת לאנקובטור.לאסוף מדגם של מדיום תרבות עם פיפטה, ולהעביר אותו סטרילי 1.5 או שני צינורות כובע בורג מיליליטר לאחסון במינוס 80 מעלות צלזיוס. לקצור את הרקמות explants עם ממטרים סטריליים, ולהעביר את explants לתוך סטרילי 1.5 או שני צינורות כובע בורג מיליליטר. לעבד או לאחסן את דגימות הרקמה כנדרש על ידי הניסוי.שאפו את מדיום התרבות השיורית היטב עם פיפטה, והשליכו אותו לתוך מיכל עם תוסף חיטוי. להטות את הצלחת בעדינות לדחוף את ספוגי ג'לטין לחלק העליון של באר כדי לאפשר למדיום לאסוף בתחתית, ולאחר מכן שאף והשליך אותו. עכשיו להוסיף שלושה עד ארבעה מיליליטר של תרבות בינוני לכל באר.באמצעות מדפים סטריליים, להחזיר את כל explants רקמה שנפל לתוך המדיום לספוג ג'לטין לפני החזרת הצלחת לחממה. בסוף התרבות, יש להשליך את כל הפסולת הביולוגית במיכלי אפוזיט בהתאם לתקנות המכון לטיפול בביולוגיה מסוכנת וכן להערכת סיכונים ספציפית. שונות בין תורמים יכולה להשפיע על שכפול HIV-1 כפי שנמדד על ידי הריכוז של חלבון ליבת HIV p24 איסור פרסום בתרבות רקמה explant, כפי שהוכח עבור רקמת צוואר הרחם משלושה תורמים שונים נגועים באותו וירוס inoculum.עבור התורם הראשון, הצטברות של איסור פרסום p24 בתרבות בינונית של explants נגוע HIV-1 BaL לבד מצביע בבירור על זיהום במוצר. התרופה האנטי-רטרו-ויראלית 3TC כי לחלוטין abrogates שכפול HIV שימש שליטה שלילית. כמות איסור הפרסום p24 הנמדדת במדיום התרבותי של מתפוצצים שטופלו ב- 3TC חושפת את החלק השני של אינוקולום הנגיף נספג באופן ספציפי ושוחרר על ידי מתפוצצים של רקמות במהלך התרבות.ב explants רקמות מן התורם השני, HIV-1 זיהום המעי תוצאות ירידה מתמדת בריכוז של איסור פרסום p24 לאורך זמן, המציין ביטול של זיהום או בלתי ניתן לגילוי על ידי כימות איסור פרסום p24. זה אושר על ידי 3TC מטופלים שליטה explants כי להראות קינטי שכפול HIV דומה. זיהום של מתפוצי רקמות מהתורם השלישי מניב כמות קטנה של וירוסים.במקרה זה, הכללת הטיפול 3TC כבקרה שלילית יש צורך לברר את נוכחותו של זיהום עם ייצור וירוס דה נובו. בעקבות הליך זה, שיטות אנליטיות כמו ציטומטריית זרימה או כשל חיסוני יכולות להתבצע בנקודות זמן שונות כדי לענות על שאלות לגבי פנוטיפ, פרופורציה או מיקום רקמות של אוכלוסיית התאים המעניינים. בעת תכנון הניסוי, חשוב להעריך את ההשפעה של שונות בין תורמים על הקריאה הניסיונית של בחירה.שונות בין תורמים יכולה להיות נשלטת חלקית על ידי קביעת קריטריונים קליניים מחמירים, ואולי, הכללה והדרה ניסיוניים. Ex vivo תרבות רקמה אנושית ניתן להשתמש כדי ללמוד את הפתוגנזה של חיידקים אחרים מאשר HIV, כגון וירוס vaccinia או וירוסים הרפס. הם שימשו גם כפלטפורמה פרה-קלינית ללימודי רעילות ואתיקה מיקרוביאלית.אנא שימו לב כי כל הדגימות האנושיות, אפילו מאנשים בריאים, יכולות לספק מחסה לסוכנים זיהומיות. חינוך, הכשרה והגנות מתאימים נדרשים כדי לטפל ברקמות אנושיות כדי להבטיח את שלומם שלך ועם עמיתיך לעבודה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-איג בהתבסס Antigen תאים מלאכותיים הצגת עבור יעיל לשעבר vivo הרחבת CTL האדם

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

בידוד של לימפוציטים מעכבר גניטלי חוברות רירית

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

הערכת חישה המולדת של CD4 הנגוע ב- HIV-1<sup&gt; +</sup&gt; T תאים על ידי תאים דנדריטים Plasmacytoid שימוש<em&gt; Ex vivo</em&gt; עמית תרבות מערכת.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

בידוד לימפוציטים מעור אדם עבור ניתוח פנוטיפי<em&gt; Ex Vivo</em&gt; תרבית תאים

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Pairwise צמיחת התחרות Assay לקביעת כושר השכפול של וירוסי כשל חיסוני אנושיים

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

זיהום Ex Vivo של Murine אפידרמיס עם סוג וירוס הרפס סימפלקס 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

הקרנת אופטי של הרומן חיידקים ספציפיים רגשים על לשעבר Vivo רקמת הריאה האנושית על ידי לייזר קונפוקלי Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...