Name: ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture
Uploaded: 2018-10-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni da parte della Fondazione Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), i medici svedesi di Fondazione contro l'AIDS (http://www.aidsfond.se/, Rif. FOa2014-0006) e Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) a Andrea Introini.

Il protocollo per la raccolta di tessuti umani può richiedere approvazione etica dalle autorità locali competenti. In caso di interventi chirurgici indicati come la tonsillectomia e l'isterectomia, i campioni non sono raccolti specificamente per scopi di ricerca e lo studio non è ricerca di soggetti umani (National Institutes of Health. Ricerca su soggetti umani. https://humansubjects.nih.gov/Walkthrough-Investigator#tabpanel11). Tuttavia, ottenere dati personali e medici donatori di tessuti (ad es., sesso, e...

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	<li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+HIV-1+phenotype+switch+as+a+causal+factor+in+acquired+immunodeficiency.">Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency.</a> Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).</li><li>Dezzutti, C. 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S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+human+immunodeficiency+virus+infection+of+human+cervical+tissue+and+inhibition+by+vaginal+virucides.">Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides.</a> J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+sexual+transmission:+early+events+of+HIV-1+infection+of+human+cervico-vaginal+tissue+in+an+optimized+ex+vivo+model.">HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model.</a> Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+facilitates+HIV-1+transmission+to+cervico-vaginal+tissue+ex+vivo.">Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo.</a> PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+and+dynamic+immunofluorescent+cytometric+bead+assay+for+the+detection+of+HIV-1+p24.">A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24.</a> J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).</li><li>Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=War+and+peace+between+microbes:+HIV-1+interactions+with+coinfecting+viruses.">War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses.</a> Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).</li><li>Keele, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection.">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).</li><li>Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+testing+of+candidate+topical+microbicides+for+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity+and+tissue+toxicity+in+a+human+cervical+explant+culture.">Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+colorectal+explant+culture+to+evaluate+topical+microbicides+for+the+prevention+of+HIV+infection.">A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection.</a> J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Productive+HIV-1+infection+of+human+cervical+tissue+ex+vivo+is+associated+with+the+secretory+phase+of+the+menstrual+cycle.">Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle.</a> Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).</li></ol>

L'uso di tessuti umani espianti per lo studio dell'infezione da HIV-1 fornisce vantaggi rispetto ai tradizionali sistemi sperimentali bi-dimensionale e l'unica specie, quali cellule primarie o linee cellulari, grazie alla loro capacità superiore di riprodurre interazioni intercellulari e cellulare (per esempio, la produzione di citochine) funzioni così come sono nel vivo. Tuttavia, tessuto tonsillar e cervicale differiscono per molti aspetti, tra cui il numero e le caratteristiche fenotipiche e funzio...

Colture cellulari di bi-dimensionale monotipico, cui qui come convenzionale, non tengono conto la comunicazione spaziale e funzionale tra la grande varietà di tipi di cellule che compongono i tessuti e organi. Questo aspetto è di fondamentale importanza per modelli sperimentali della malattia, come interferenze con interazioni intercellulari omeostatici sono il fattore trainante di tutte le patologie. Espianti di tessuto offrono importanti vantaggi per la modellazione di salute e malattia in esseri umani perché mantengono la citoarchitettura e molti importanti aspetti funzionali degli organi come sono in vivo, anche se per un periodo limitato di tempo1. Ad esempio, all'ex vivo sfida con antigeni di richiamo, come il tossoide difterico o tossoide tetanico, tessuto tonsillar risponde con una vigorosa produzione di anticorpi specifici per l'antigene2. Come qualsiasi altro ex vivo modello, histoculture ha le proprie limitazioni: variabilità inter-donatore, polarizzazione di tessuto, sopravvivenza limitata del tessuto e la difficoltà nel monitoraggio celle oltre la profondità di microscopia confocale1. Espianti di tessuto umano rimangono comunque, un modello di scelta per lo studio dei processi immunologici omeostatici e patogeni in esseri umani, tra cui interazioni ospite-patogeno e potenziali interventi terapeutici3.
Gli eventi critici della patogenesi di HIV-1 si svolgono nei tessuti. Infezione della mucosa genitale rappresenta la maggior parte di tutti gli eventi trasmissione HIV-1 in tutto il mondo4. Tessuto linfoide è il sito principale di replicazione del virus durante l'infezione acuta e porti un significativo pool di cellule latente infettate5, e la loro persistenza rappresenta il principale ostacolo per ottenere una cura6. La sfida di cultura ed ex vivo dei tessuti mucosi e linfoidi umani forniscono alcuni vantaggi rispetto ai sistemi convenzionali basati su cellule isolate per lo studio del virus HIV-1. Per esempio, le cellule tessuto-residente possono supportare l'infezione HIV-1 in assenza di attivazione esogena, al contrario di cellule mononucleari di anima periferica1. L'utilizzo di espianti di tessuto linfoide ha permesso una migliore comprensione di alcuni meccanismi chiave alla base CD4 T cell lo svuotamentocioè, l' effetto bystander7, che è il segno dell'infezione acuta. Il mantenimento delle strutture come follicoli di cellule B del tessuto linfoide8 e l'epitelio in espianti di mucosa genitale femminile9 offre l'opportunità unica di integrare funzionalità spaziale e funzionale dell'infezione da HIV-1 in questi siti. Infine, histocultures sono stati usati con successo per modello e studio co-infezione da HIV-1 e herpesvirus10,11, così come per i test preclinici di antiretrovirali e multitarget microbicidi12, 13 , 14 , 15.
Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la cultura degli espianti di tessuto umano ottenuto da tonsille e tessuto mucoso dal tratto genitale femminile più basso (cervice), che copre la dissezione del tessuto per explant sfida con HIV-1 in un modo non polarizzato. La cultura degli espianti di tessuto all'interfaccia liquido-aria, utilizzando spugne di gelatina come supporto, massimizza l'esposizione ad aria ossigeno garantendo accesso alle sostanze nutrienti del terreno di coltura attraverso la spugna capillari, ritardando così il loro decadimento naturale. Il modo più immediato di valutazione replica di HIV-1 nel nostro sistema è quello di misurare la quantità di virus rilasciati nel terreno di coltura explant nel tempo di dosaggio immunologico o qPCR. Infezione da HIV-1 e la patogenesi (ad es., deplezione delle cellule T CD4 +) possono anche essere valutati in espianti di tessuto dalla mole estrazione di RNA/DNA e qPCR, in situ macchiatura o singola cellula-analisi sulla digestione del tessuto tramite flusso cytometry.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:941px;" width="940">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Pfizer</td>
			<td style="width:141px;">NDC:&#160; 0009-0315-08</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">SPONGOSTAN Standard 70 &#215; 50 &#215; 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge</td>
			<td>Ferrosan Medical Devices</td>
			<td>MS0002</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">RPMI 1640 with phenol red and glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Modified Eagle&#39;s medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sodium pyruvate, 100 mM (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Gentamicin 50 mg/mL (1000x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15750037</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Amphotericin B 250 &#956;g/mL (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:49px;width:280px;">Ticarcillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5639-1G</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:280px;">Potassium clavulanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33454-100MG</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:280px;">Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;">To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile cell culture grade water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile transportation container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Disinfectant solution for biological waste disposal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal forceps or tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile flat weighing metal spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile scalpels and blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">6-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">12-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Petri dish, 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>510</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>2522</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Lamivudine (3TC)</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>8146</td>
			<td style="width:345px;">Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:280px;">Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 &#176;C, 5% CO2, &#8805; 90% humidity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Water bath set at 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 &#176;C, 300 rpm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture

Histocultures permettono di studiare le interazioni intercellulari all'interno dei tessuti umani, e possono essere impiegati per interazioni ospite-patogeno modello in condizioni di laboratorio controllate. Ex vivo l'infezione dei tessuti umani con il virus di immunodeficenza umana (HIV), tra altri virus, è stato utilizzato con successo per studiare la patogenesi della malattia precoce, così come una piattaforma per testare l'efficacia e la tossicità dei farmaci antivirali. Nel presente protocollo, spieghiamo come elaborare e infettare con HIV-1 espianti di tessuto umane tonsille e mucose cervicali e mantenute in coltura in cima spugne di gelatina all'interfaccia liquido-aria per circa due settimane. Questa impostazione non polarizzato cultura massimizza accesso alle sostanze nutrienti nel terreno di coltura e di ossigeno, anche se la perdita progressiva di architetture funzionali e l'integrità del tessuto rimane il suo limite principale. Questo metodo consente il monitoraggio replica di HIV-1 e patogenesi utilizzando diverse tecniche, tra cui test immunologici, qPCR e citometria a flusso. Di importanza, la variabilità fisiologica tra donatori di tessuti, nonché tra espianti provenienti da diverse aree del campione stesso, può incidere significativamente i risultati sperimentali. Per garantire la riproducibilità dei risultati, è fondamentale utilizzare un adeguato numero di espianti, replicati tecnici e controllo di donatore-pari condizioni per normalizzare i risultati dei trattamenti sperimentali durante la compilazione di dati provenienti da esperimenti multipli (cioè ., condotto utilizzando tessuti da donatori diversi) per l'analisi statistica.

Diverse tecniche possono essere utilizzati per valutare la replica di HIV-1 in espianti di tessuto. La nostra lettura standard è di misurare la quantità di HIV-1 p24gag rilasciati in CM nel tempo con un immunoassay18.
Espianti di tessuto da diversi donatori, infettati con l'inoculo stesso dello stesso stock, HIV-1, possono produrre diverse quantità di virus (tabella 1). Ques...

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Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infezione dei tessuti umani con il virus di immunodeficenza umana (HIV) ex vivo fornisce un prezioso modello 3D della patogenesi del virus. Qui, descriviamo un protocollo per elaborare e infettare i campioni di tessuto da tonsille umane e delle mucose genitali femminile con HIV-1 e mantenerli nella cultura presso l'interfaccia liquido-aria.

Ex Vivo Infezione della Mucosa genitale umana del tessuto linfoide e donna con il Virus dell'immunodeficienza umana 1 e Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'HIV, come l'identificazione dei determinanti della trasmissione del virus e della patogenesi all'interno di due degli organi più colpiti dall'infezione. In effetti, la progressione avanzata chiave della malattia della guida avviene nei tessuti. Le caratteristiche e la complessità dell'infezione sono scarsamente riflesse dalle cellule in circolazione o isolate e infette in vitro.Il principale vantaggio della coltura tissutale ex vivo per studiare la patogenesi dell'HIV è che mantiene le sue relazioni spaziali e funzionali originali tra le cellule anche se per due o tre settimane. Per iniziare, riempire una piastra di Petri da 100 millmeter per 20 millimetri con 20-30 millilitri di CMT. Trasferire le spugne di gelatina nella piastra di Petri utilizzando forcep sterili.Bagnare le spugne su entrambi i lati e lasciare che le spugne assorbono il mezzo per un minuto. Premere le spugne contro il fondo della piastra di Petri per circa due minuti utilizzando una spatola sterile. Utilizzare forbici sterili per tagliare le spugne di gelatina reidrata in pezzi di dimensioni uguali di circa un centimetro quadrato.Quindi utilizzare le forcep per trasferire un pezzo di spugna in ogni pozzo di un piatto di coltura. Aggiungere da tre a quattro millilitri di CMT in ogni pozzo di una piastra da 6 pozzetti per le tonsille e un millilitro per pozzo in una piastra da 12 pozzetti per la cervice. Posizionare le piastre nell'incubatrice, impostate a 37 gradi Celsius, 5%CO2 e superiori o uguali al 90% di umidità fino a quando gli espianto tissutali non sono pronti per essere caricati sulle spugne.Trasferire le tonsille dal contenitore di trasporto in una piastra di Petri da 100 millimetri contenente da 10 a 20 millilitri di CMT utilizzando forcep sterili. Utilizzare il coperchio della piastra di Petri come superficie di taglio per sezionare il tessuto. Tenendo delicatamente il tessuto con le arpe, tagliare ogni tonsille in pezzi diversi e grandi usando un bisturi e una lama sterili.Utilizzare le forcelle e un bisturi per rimuovere il tessuto cauterizzato, sanguinante e fibroso, nonché tutte le parti contenenti tonsilloliti o colore bruno-verdastro. Tagliare ogni pezzo di tessuto a fette di circa due millimetri di spessore. Rimuovere qualsiasi parte indesiderata come nel passaggio precedente.Quindi tagliare le fette di tessuto a strisce spesse due millimetri. Infine, tagliare le strisce di tessuto in blocchi spessi due millimetri. Trasferire gli espianto in una nuova piastra di Petri da 100 millimetri contenente da 10 a 20 millilitri di CMT per evitare l'essiccazione tissutale mentre si procede con la dissezione.Alla fine della dissezione, ruotare la piastra per randomizzare la distribuzione dell'espianto. Posizionare nove espianto tissutale sopra ogni spugna di gelatina in una piastra a 6 po 'usando le forcelle, lasciando spazio tra di loro. Riportare le piastre all'incubatrice.In genere, le espianto vengono coltivate durante la notte. L'inoculazione con l'HIV viene eseguita il giorno successivo. Questo per assicurarsi che non si sviluppi alcuna contaminazione batterica o fungina nella coltura.Inoltre, le cellule tendono a regredire le espianto dei tessuti immediatamente dopo la dissezione. Aspirare il mezzo nella piastra a 6 po 'con una pipetta e scartarlo in un contenitore con soluzione disinfettante. Inclinare la piastra e spingere delicatamente le spugne di gelatina nella parte superiore del pozzo per consentire al mezzo di raccogliere sul fondo.Aspirare e scartare il mezzo. Quindi aggiungere da tre a quattro millilitri di CMT a ciascun pozzo. Ora scongelare la preparazione del virus HIV-1 nel bagno d'acqua a 37 gradi Celsius.Pipettare l'inoculo virale direttamente sopra ciascuno dei nove espianto su una spugna di gelatina. Riportare la piastra all'incubatore. Utilizzare il coperchio della piastra di Petri come superficie di taglio per sezionare il tessuto.Tenendo delicatamente il tessuto con le forcelle, separare la mucosa dell'ectocervix e/o dell'endocervix dal sottostromale e sottomucosa con bisturi e lama per ottenere strisce di mucosa. Tagliare la mucosa in strisce larghe due millimetri. Rimuovere e scartare quanta più sottomucosa possibile, lasciando solo uno strato di tessuto spesso due millimetri.Quindi tagliare le strisce in blocchi spessi due millimetri. Il tessuto di trasferimento espianta in una nuova piastra di Petri da 100 millimetri contenente da 10 a 20 millilitri di CMT per evitare l'essiccazione tissutale mentre si procede con la dissezione. Alla fine della dissezione, ruotare la piastra per randomizzare la distribuzione dell'espianto.Con forcette sterili, trasferire le espianto in tubi conici sterili da 1,5 millilitri. Rimuovere qualsiasi mezzo nel tubo utilizzando una pipetta. Per risultati ottimali, gli espianto della cervice devono essere elaborati e infettati il prima possibile dopo l'intervento chirurgico, idealmente il giorno dell'intervento chirurgico.In alternativa, i tessuti possono essere conservati immersi in CMT a 4 gradi durante la notte e infetti immediatamente dopo la dissezione. Scongelare la preparazione dell'HIV-1 in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Una volta scongelato, trasferire il virus nei tubi contenenti le espianto.Trasferire i tubi in un termoshaker e incubare per due ore a 37 gradi Celsius dondolando a 300 giri/min. Invertire delicatamente i tubi alcune volte ogni 30-60 minuti. Nel frattempo, riempire una piastra da 6 po 'con tre o quattro millilitri per pozzo di soluzione salina tamponata di fosfato sterile.Al termine dell'incubazione con HIV-1, utilizzare una pipetta per scartare tutta la preparazione del virus nei tubi contenenti le espianto in un contenitore con soluzione disinfettante. Quindi utilizzare le forcep e una pipetta per trasferire gli espianto nella piastra a 6 potte contenente PBS. Dopo aver permesso agli espianto di riposare in PBS per un minuto a temperatura ambiente, lavarli tubazionando delicatamente il PBS su e giù nel pozzo due o tre volte.Quindi scartare il PBS in un contenitore con soluzione disinfettante utilizzando una pipetta. Aggiungere da tre a quattro millilitri di nuovo PBS a ciascun pozzo. Ripetere altre due volte per un totale di tre lavaggi.Scartare il PBS poco prima di trasferire le espianto alle spugne per evitare l'essiccazione tissutale. Ora usa le forcep per trasferire da cinque a otto espianto sopra ogni spugna di gelatina in un piatto da 12 po '. Riportare la piastra all'incubatore.Raccogliere un campione di mezzo di coltura con una pipetta e trasferirlo in tubi sterili a vite da 1,5 o due millilitri per lo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius. Raccogliere il tessuto espianta con forcelle sterili e trasferire le espianto in tubi sterili a vite da 1,5 o due millilitri. Elaborare o conservare i campioni di tessuto come richiesto dall'esperimento.Aspirare il mezzo di coltura residua nel pozzo con una pipetta e scartarlo in un contenitore con soluzione disinfettante. Inclinare il piatto e spingere delicatamente le spugne di gelatina nella parte superiore del pozzo per consentire al mezzo di raccogliere sul fondo, quindi aspirarlo e scartarlo. Ora aggiungi da tre a quattro millilitri di mezzo di coltura per ogni pozzo.Utilizzando forcelle sterili, restituire tutti gli espianto di tessuto che sono caduti nel mezzo alla spugna di gelatina prima di restituire il piatto all'incubatrice. Al termine della coltura, smaltire tutti i rifiuti biologici in contenitori di apposite secondo le normative dell'istituto sulla manipolazione di biologici pericolosi e la specifica valutazione del rischio. La variabilità tra donatori può influenzare la replicazione dell'HIV-1 misurata dalla concentrazione della proteina del nucleo hiv p24 gag nel supernatante della coltura di espianto tissutale, come dimostrato per il tessuto cervicale da tre diversi donatori infettati dallo stesso inoculo virale.Per il primo donatore, l'accumulo di gag p24 nel mezzo di coltura di espianto infettati da HIV-1 BaL da solo indica chiaramente un'infezione del prodotto. Il farmaco antiretrovirale 3TC che abroga completamente la replicazione dell'HIV è stato utilizzato come controllo negativo. La quantità di p24 gag misurata nel mezzo di coltura delle espianto trattate con 3TC rivela la frazione dell'inoculo virale assorbito e rilasciato specificamente dagli espianto tissutali durante la coltura.Negli espianto tissutali del secondo donatore, l'infezione intestinale da HIV-1 si traduce in una costante diminuzione della concentrazione di gag p24 nel tempo, indicando un'interruzione dell'infezione o non rilevabile dalla quantificazione del bavaglio p24. Ciò è confermato dagli espianto di controllo trattati con 3TC che mostrano un simile cinetico di replicazione dell'HIV. L'infezione degli espianto tissutali dal terzo donatore produce poca quantità di virus.In questo caso, l'inclusione del trattamento 3TC come controllo negativo è necessaria per accertare la presenza di infezione da produzione di virus de novo. Seguendo questa procedura, metodi analitici come la citometria del flusso o l'immunostaining possono essere eseguiti in diversi punti di tempo per rispondere a domande sul fenotipo, la proporzione o la posizione tissutale della popolazione cellulare di interesse. Quando si progetta l'esperimento, è importante stimare l'impatto della variabilità tra donatori sulla lettura sperimentale della scelta.La variabilità tra donatori può essere parzialmente controllata stabilendo rigorosi criteri clinici e, possibilmente, sperimentali di inclusione ed esclusione. Le colture di tessuti umani ex vivo possono essere utilizzate per studiare la patogenesi di microbi diversi dall'HIV, come il virus vaccinia o i virus dell'herpes. Sono stati anche utilizzati come piattaforma preclinica per studi di tossicità antimicrobica ed etica.Si prega di essere consapevoli del fatto che tutti gli esemplari umani, anche da individui sani, possono ospitare agenti infettivi. Sono necessarie un'istruzione, una formazione e protezioni adeguate per gestire i tessuti umani per garantire la sicurezza di te e dei tuoi colleghi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

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HLA-Ig celle in base Antigen Presenting artificiale per Efficiente Ex vivo Estensione dei diritti dell&#39;uomo e CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolamento dei linfociti da mouse mucosa del tratto genitale

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

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Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

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Valutare l&#39;innato rilevamento dell&#39;infezione da HIV-1 CD4 infetti<sup&gt; +</sup&gt; Cellule T dalle cellule dendritiche plasmacitoidi Utilizzando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sistema di co-coltura.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

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Linfociti Isolamento da Pelle umana per l&#39;analisi fenotipica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

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In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo infezione di Murine epidermide con Herpes Simplex Virus di tipo 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

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L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

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Sonde ottiche Screening di nuovi batteri specifici sul tessuto polmonare umano Ex Vivo di endomicroscopia confocale Laser

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...