Name: ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture
Uploaded: 2018-10-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Este trabalho foi financiado por doações da Fundação Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), a Fundação sueca médicos contra a AIDS (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) e da Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) para Andrea Introini.

O protocolo para a coleção de tecidos humanos pode requerer a aprovação ética pelas autoridades locais competentes. Em caso de cirurgias indicadas como amigdalectomia e histerectomia, as amostras não são recolhidas especificamente para finalidade de pesquisa e o estudo não é considerado pesquisa seres humanos (National Institutes of Health. Pesquisa em seres humanos. https://humansubjects.nih.gov/Walkthrough-Investigator#tabpanel11). No entanto, obtenção de dados pessoais e médicos de doadores para tecido (<e...

<ol>
	<li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+HIV-1+phenotype+switch+as+a+causal+factor+in+acquired+immunodeficiency.">Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency.</a> Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).</li><li>Dezzutti, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+and+human+mucosal+tissue+models+to+study+HIV+biomedical+interventions:+can+we+predict+success.">Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success.</a> J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).</li><li>Lederman, M. M., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+node+in+HIV+pathogenesis.">The lymph node in HIV pathogenesis.</a> Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).</li><li>Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reservoirs+as+obstacles+and+opportunities+for+an+HIV+cure.">HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure.</a> Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induced+activation+of+CD4++T+cells+creates+new+targets+for+HIV-1+infection+in+human+lymphoid+tissue+ex+vivo.">HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo.</a> Blood. 111 (2), 699-704 (2008).</li><li>Van Laar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+secretion+of+immunoglobulin+by+long-lived+human+tonsil+plasma+cells.">Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells.</a> Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).</li><li>Introini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminal+plasma+induces+inflammation+and+enhances+HIV-1+replication+in+human+cervical+tissue+explants.">Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants.</a> PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).</li><li>Grivel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+CCR5-+but+not+CXCR4-tropic+HIV-1+in+lymphoid+tissue+by+human+herpesvirus+6.">Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6.</a> Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).</li><li>Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type-2+stimulates+HIV-1+replication+in+cervical+tissues:+implications+for+HIV-1+transmission+and+efficacy+of+anti-HIV-1+microbicides.">Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).</li><li>Lisco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+is+activated+into+a+HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+in+herpesvirus-infected+human+tissues.">Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues.</a> Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).</li><li>Vanpouille, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+anti-cytomegalovirus+drug,+ganciclovir,+inhibits+HIV-1+replication+in+human+tissues+ex+vivo.">A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo.</a> AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).</li><li>Andrei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+tenofovir,+a+microbicide+effective+against+HIV,+inhibits+herpes+simplex+virus-2+replication.">Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication.</a> Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).</li><li>Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+human+immunodeficiency+virus+infection+of+human+cervical+tissue+and+inhibition+by+vaginal+virucides.">Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides.</a> J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+sexual+transmission:+early+events+of+HIV-1+infection+of+human+cervico-vaginal+tissue+in+an+optimized+ex+vivo+model.">HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model.</a> Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+facilitates+HIV-1+transmission+to+cervico-vaginal+tissue+ex+vivo.">Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo.</a> PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+and+dynamic+immunofluorescent+cytometric+bead+assay+for+the+detection+of+HIV-1+p24.">A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24.</a> J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).</li><li>Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=War+and+peace+between+microbes:+HIV-1+interactions+with+coinfecting+viruses.">War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses.</a> Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).</li><li>Keele, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection.">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).</li><li>Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+microenvironments+in+the+human+vagina+and+cervix:+mediators+of+cellular+immunity+are+concentrated+in+the+cervical+transformation+zone.">Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone.</a> Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).</li><li>Ganor, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within+1h,+HIV-1+uses+viral+synapses+to+enter+efficiently+the+inner,+but+not+outer,+foreskin+mucosa+and+engages+Langerhans-T+cell+conjugates.">Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).</li><li>Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R5+HIV-1+envelope+attracts+dendritic+cells+to+cross+the+human+intestinal+epithelium+and+sample+luminal+virions+via+engagement+of+the+CCR5.">R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+testing+of+candidate+topical+microbicides+for+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity+and+tissue+toxicity+in+a+human+cervical+explant+culture.">Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+colorectal+explant+culture+to+evaluate+topical+microbicides+for+the+prevention+of+HIV+infection.">A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection.</a> J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Productive+HIV-1+infection+of+human+cervical+tissue+ex+vivo+is+associated+with+the+secretory+phase+of+the+menstrual+cycle.">Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle.</a> Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).</li></ol>

A utilização de tecido humano explants para o estudo da infecção por HIV-1 fornece vantagens sobre os tradicionais sistemas experimentais bi-dimensional e a única espécie, tais como as células primárias ou linhas de células, devido a sua superior capacidade de reproduzir interações intercelulares e celular as funções (por exemplo, produção de citocinas) como eles são na vivo. No entanto, o tecido tonsilar e cervical diferem em muitos aspectos, incluindo o número e características fenot...

Culturas de células bi-dimensional monotípico, aqui referidas como convencional, não em conta a comunicação funcional e espacial entre a grande variedade de tipos de células que compõem os tecidos e órgãos. Este aspecto é de suma importância para modelos experimentais da doença, como interferência com interações intercelulares homeostáticas é o fator determinante de todas as patologias. Explantes de tecido oferecem grandes vantagens para a modelagem de saúde e doença em seres humanos porque retêm o cytoarchitecture e muitos importantes aspectos funcionais dos órgãos, como eles estão em vivo, apesar de uma quantidade limitada de tempo1. Por exemplo, sobre o desafio de ex vivo com antígenos de recordação, como toxoides da difteria ou toxoide tetânico, tecido tonsilar responde com uma vigorosa produção de anticorpos antígeno-específicos2. Como qualquer outro ex vivo modelo, histoculture tem suas próprias limitações: variabilidade inter doador, polarização de tecido, sobrevivência de tecido limitada e dificuldade no acompanhamento células além da profundidade da microscopia confocal1. Não obstante, explantes de tecido humano continuam a ser um modelo de escolha para estudar processos imunológicos homeostáticos e patogênicos em humanos, incluindo interações patógeno-hospedeiro e possíveis intervenções terapêuticas3.
Os eventos críticos de patogênese do HIV-1 realizam-se nos tecidos. Infecção da mucosa genital é responsável pela maioria de todos os HIV-1 transmissão eventos em todo o mundo4. Tecido linfoide é o maior site de replicação de vírus durante a infecção aguda e abriga uma piscina significativa de células Latentemente infectadas5, e sua persistência constitui o principal obstáculo para alcançar uma cura6. O desafio de cultura e ex vivo dos tecidos linfoides e mucosa humanos oferecem algumas vantagens sobre os sistemas convencionais baseados em células isoladas para o estudo do HIV-1. Por exemplo, células do tecido-residente podem oferecer suporte a infecção HIV-1 na ausência de ativação exógena, ao contrário de células mononucleares de sangue periférico1. A utilização de tecido linfoide explantes permitiu uma melhor compreensão de alguns mecanismos chaves subjacentes T CD4 celular depleçãoou seja, o espectador efeito7, qual é a marca da infecção aguda. A preservação de estruturas como folículos de células B no tecido linfoide8 e o epitélio na mucosa genital feminina explantes9 oferece a oportunidade única de integrar características espaciais e funcionais da infecção de HIV-1 nesses locais. Finalmente, histocultures foram usados com sucesso para o modelo e estudo de10,co-infecção HIV-1 e herpesvírus11, bem como para testes pré-clínicos de anti-retrovirais e multitarget microbicidas12, 13 , 14 , 15.
Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a cultura do tecido humano explantes obtidos de amígdalas e tecido da mucosa do trato genital feminino inferior (colo do útero), cobrindo a dissecção de tecidos para explant desafio com HIV-1 em uma maneira não-polarizado. A cultura do tecido de explantes na interface líquido-ar, utilizando esponjas de gelatina como suporte, maximiza a exposição para o oxigênio do ar, proporcionando acesso aos nutrientes do meio de cultura através da esponja capilares, atrasando assim sua deterioração natural. A maneira mais imediata de avaliar a replicação do HIV-1 em nosso sistema é medir a quantidade de vírus lançado em meio de cultura de explant ao longo do tempo por imunoensaio ou qPCR. Infecção de HIV-1 e patogênese (EG., depleção de células T CD4) também pode ser avaliada em explantes de tecido pelo volume de extração de RNA/DNA e qPCR, em situ coloração ou célula única-análise mediante digestão do tecido por citometria de fluxo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:941px;" width="940">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Pfizer</td>
			<td style="width:141px;">NDC:&#160; 0009-0315-08</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">SPONGOSTAN Standard 70 &#215; 50 &#215; 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge</td>
			<td>Ferrosan Medical Devices</td>
			<td>MS0002</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">RPMI 1640 with phenol red and glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Modified Eagle&#39;s medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sodium pyruvate, 100 mM (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Gentamicin 50 mg/mL (1000x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15750037</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Amphotericin B 250 &#956;g/mL (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:49px;width:280px;">Ticarcillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5639-1G</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:280px;">Potassium clavulanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33454-100MG</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:280px;">Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;">To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile cell culture grade water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile transportation container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Disinfectant solution for biological waste disposal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal forceps or tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile flat weighing metal spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile scalpels and blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">6-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">12-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Petri dish, 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>510</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>2522</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Lamivudine (3TC)</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>8146</td>
			<td style="width:345px;">Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:280px;">Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 &#176;C, 5% CO2, &#8805; 90% humidity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Water bath set at 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 &#176;C, 300 rpm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture

Histocultures permitem estudar interações intercelulares nos tecidos humanos, e eles podem ser empregados para interações patógeno-hospedeiro de modelo sob condições controladas de laboratório. Infecção ex vivo de tecidos humanos com vírus da imunodeficiência humana (HIV), entre outros vírus, tem sido utilizada com sucesso para investigar a patogênese precoce de doença, bem como uma plataforma para testar a eficácia e a toxicidade de medicamentos antivirais. No presente protocolo, vamos explicar como processar e infectar com o HIV-1 explantes de tecido humanas amígdalas e mucosa cervical e mantê-las em cultura em cima de esponjas de gelatina em uma interface líquido-ar por duas semanas. Esta definição de cultura não-polarizado maximiza o acesso aos nutrientes em meio de cultura e de oxigénio, embora progressiva perda da integridade do tecido e arquiteturas funcionais continua a ser sua principal limitação. Este método permite monitorar a replicação do HIV-1 e patogênese usando várias técnicas, incluindo os imunoensaios qPCR e citometria de fluxo. De importância, a variabilidade fisiológica entre doadores de tecidos, bem como entre explantes de áreas diferentes da mesma amostra, pode afetar significativamente os resultados experimentais. Para garantir a reprodutibilidade do resultado, é fundamental usar um número adequado de explantes, repetições de técnicas e condições de controle de doador compatível para normalizar os resultados dos tratamentos experimentais quando compilando dados de experimentos múltiplos (por exemplo ., conduzido usando tecidos de doadores diferentes) para análise estatística.

Várias técnicas podem ser usadas para avaliar a replicação do HIV-1 em explantes de tecido. Nossa leitura padrão é medir a quantidade de HIV-1 p24amordaçar lançado em CM ao longo do tempo com um imunoensaio18.
Explantes de tecidos provenientes de doadores diferentes, infectados com o mesmo inóculo do mesmo estoque de HIV-1, podem produzir quantidades diferentes de vírus (tabel...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infecção de tecidos humanos com vírus de imunodeficiência humana (HIV) ex vivo fornece um valioso modelo 3D da patogênese do vírus. Aqui, descrevemos um protocolo para processar e infectar amostras de tecido da amígdalas humanas e mucosa genital feminina com HIV-1 e mantê-las em cultura em uma interface líquido-ar.

Ex Vivo Infecção da Mucosa Genital humano tecido linfoide e fêmea com vírus de imunodeficiência humana 1 e Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do HIV, como a identificação dos determinantes da transmissão do vírus e da patogênese dentro de dois dos órgãos mais efetuados pela infecção. Na verdade, a principal progressão avançada da doença de condução ocorre nos tecidos. As características e a complexidade da infecção são mal refletidas pelas células em circulação ou isoladas e infectadas in vitro.A principal vantagem da cultura do tecido ex vivo para estudar a patogênese do HIV é que ela mantém suas relações espaçais e funcionais originais entre as células, embora por duas a três semanas. Para começar, encha uma placa de Petri de 100 milímetros com 20 a 30 mililitros de CMT. Transfira esponjas de gelatina para a placa de Petri usando fórceps estéreis.Molhe as esponjas de ambos os lados e deixe as esponjas absorverem o meio por um minuto. Pressione as esponjas contra o fundo da placa de Petri por cerca de dois minutos usando uma espátula estéril. Use uma tesoura estéril para cortar as esponjas de gelatina rehidratadas em pedaços de tamanho igual de cerca de um centímetro quadrado.Em seguida, use fórceps para transferir uma peça de esponja em cada poço de uma placa de cultura. Adicione três a quatro mililitros de CMT em cada poço de uma placa de 6 poços para as amígdalas e um mililitro por poço em uma placa de 12 poços para o colo uterino. Coloque as placas na incubadora, fixadas a 37 graus Celsius, 5% de CO2 e maiores ou iguais a 90% de umidade até que as explanações teciduais estejam prontas para serem carregadas nas esponjas.Transfira as amígdalas do recipiente de transporte para uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 10 a 20 mililitros de CMT usando fórceps estéreis. Use a tampa da placa de Petri como uma superfície de corte para dissecar o tecido. Segurando o tecido suavemente com fórceps, corte cada amígdala em pedaços grandes e diferentes usando um bisturi estéril e uma lâmina.Use fórceps e um bisturi para remover tecido cauterizado, ensanguentado e miomado, bem como quaisquer partes contendo tonsillolitos ou cor marrom-esverdeada. Corte cada peça de tecido em fatias de cerca de dois milímetros de espessura. Remova qualquer peça indesejada como na etapa anterior.Em seguida, corte as fatias de tecido em tiras de dois milímetros de espessura. Finalmente, corte as tiras de tecido em blocos de dois milímetros de espessura. Transfira as explanações para uma nova placa de Petri de 100 milímetros contendo 10 a 20 mililitros de CMT para evitar a dessecação tecidual enquanto prossegue com a dissecação.No final da dissecção, gire a placa para randomizar a distribuição da explantação. Coloque nove explantes de tecido em cima de cada esponja de gelatina em uma placa de 6 poços usando fórceps, permitindo espaço entre eles. Devolva as placas para a incubadora.Normalmente, explantas são cultivadas da noite para o dia. A inoculação com HIV é realizada no dia seguinte. Isto é para garantir que nenhuma contaminação bacteriana ou fúngica se desenvolva na cultura.Além disso, as células tendem a regredir explanações teciduais imediatamente após a dissecção. Aspire o meio na placa de 6 poços com uma pipeta, e descarte-o em um recipiente com solução desinfetante. Incline a placa e empurre suavemente as esponjas de gelatina para a parte superior do poço para permitir que o meio se reúna na parte inferior.Aspire e descarte o meio. Em seguida, adicione três a quatro mililitros de CMT a cada poço. Agora descongele a preparação do vírus HIV-1 no banho de água a 37 graus Celsius.Pipeta o vírus inóculo diretamente em cima de cada uma das nove explantas em uma esponja de gelatina. Devolva a placa para a incubadora. Use a tampa da placa de Petri como uma superfície de corte para dissecar o tecido.Segurando o tecido suavemente com fórceps, separe a mucosa do ectocervix e/ou endocervix da parte inferior e submucosa com um bisturi e lâmina para obter tiras de mucosa. Corte a mucosa em tiras de dois milímetros de largura. Remova e descarte o máximo possível de submucosa, deixando apenas uma camada de tecido de dois milímetros de espessura.Em seguida, corte as tiras em blocos de dois milímetros de espessura. Transfira as explanações teciduais para uma nova placa de Petri de 100 milímetros contendo 10 a 20 mililitros de CMT para evitar a dessecação tecidual enquanto prossegue com a dissecação. No final da dissecção, gire a placa para randomizar a distribuição da explantação.Com fórceps estéreis, transfira as explanações em tubos cônicos estéreis de 1,5 mililitro. Remova qualquer meio no tubo usando uma pipeta. Para obter resultados ideais, as explantas do colo do útero devem ser processadas e infectadas o mais rápido possível após a cirurgia, idealmente no dia da cirurgia.Alternativamente, os tecidos podem ser armazenados submersos em TMC a 4 graus durante a noite e infectados imediatamente após a dissecção. Descongele a preparação do HIV-1 em um banho de água a 37 graus Celsius. Uma vez descongelado, transfira o vírus para os tubos contendo as explantas.Transfira os tubos para um termoshaker, e incubar por duas horas a 37 graus Celsius balançando a 300 rpm. Inverta suavemente os tubos algumas vezes a cada 30 a 60 minutos. Enquanto isso, encha uma placa de 6 poços com três a quatro mililitros por poço de salina tamponada de fosfato estéril.Ao final da incubação com HIV-1, use uma pipeta para descartar toda a preparação do vírus nos tubos que contenham as explantas em um recipiente com solução desinfetante. Em seguida, use fórceps e uma pipeta para transferir as explantas para a placa de 6 poços contendo PBS. Depois de permitir que as explantas descansem em PBS por um minuto à temperatura ambiente, lave-as gentilmente sobre a PBS para cima e para baixo no poço duas a três vezes.Em seguida, descarte o PBS em um recipiente com solução desinfetante usando uma pipeta. Adicione três a quatro mililitros de novo PBS a cada poço. Repita mais duas vezes para um total de três lavagens.Descarte o PBS pouco antes de transferir as explantas para as esponjas para evitar a profilação tecidual. Agora use fórceps para transferir cinco a oito explantas em cima de cada esponja de gelatina em uma placa de 12 poços. Devolva a placa para a incubadora.Colete uma amostra de meio de cultura com uma pipeta e transfira-a para tubos de tampa de parafuso de 1,5 ou dois mililitros para armazenamento a menos 80 graus Celsius. Colher as explantas teciduais com fórceps estéreis e transferir as explantas para tubos de tampa de parafuso estéril de 1,5 ou dois mililitros. Processe ou armazene as amostras de tecido conforme exigido pelo experimento.Aspire o meio de cultura residual no poço com uma pipeta, e descarte-o em um recipiente com solução desinfetante. Incline a placa e empurre suavemente as esponjas de gelatina para a parte superior do poço para permitir que o meio se reúna na parte inferior e, em seguida, aspire e descarte-a. Agora adicione três a quatro mililitros de cultura média para cada poço.Usando fórceps estéreis, devolva todas as explantas teciduais que caíram no meio para a esponja de gelatina antes de devolver a placa à incubadora. Ao final da cultura, descarte todos os resíduos biológicos em recipientes de apposite de acordo com as normas do instituto sobre o manuseio de biológicos perigosos, bem como a avaliação específica de riscos. A variabilidade entre doadores pode afetar a replicação do HIV-1 medida pela concentração da mordaça p24 da proteína do núcleo HIV na cultura de plantas de tecido, como demonstrado para tecido cervical de três doadores diferentes infectados com o mesmo vírus inóculo.Para o primeiro doador, o acúmulo de mordaça p24 em meio de cultura de explants infectados com HIV-1 BaL por si só indica claramente uma infecção do produto. A droga antirretroviral 3TC que revoga completamente a replicação do HIV foi usada como controle negativo. A quantidade de mordaça p24 medida em meio de cultura de explants tratadas com 3TC revela a fração do vírus inóculo absorvido e liberado por explants teciduais durante a cultura.Em explantas teciduais do segundo doador, a infecção intestinal pelo HIV-1 resulta em uma diminuição constante na concentração de mordaça p24 ao longo do tempo, indicando um abortamento de infecção ou indetectável pela quantificação da mordaça p24. Isso é confirmado por explants de controle tratados com 3TC que mostram uma replicação semelhante do HIV cinética. A infecção de explantas teciduais do terceiro doador produz pouca quantidade de vírus.Neste caso, a inclusão do tratamento 3TC como controle negativo é necessária para verificar a presença de infecção com a produção do vírus de novo. Após esse procedimento, métodos analíticos como citometria de fluxo ou imunossagem podem ser realizados em diferentes pontos de tempo para responder a perguntas sobre fenótipo, proporção ou localização tecidual da população celular de interesse. Ao projetar o experimento, é importante estimar o impacto da variabilidade entre doadores na leitura experimental da escolha.A variabilidade entre doadores pode ser parcialmente controlada estabelecendo critérios clínicos rigorosos e, possivelmente, experimentais de inclusão e exclusão. Culturas de tecidos humanos ex vivo podem ser usadas para estudar a patogênese de micróbios que não sejam o HIV, como o vírus da vaccinia ou vírus do herpes. Eles também têm sido usados como uma plataforma pré-clínica para estudos de toxicidade antimicrobiana e ética.Por favor, esteja ciente de que todos os espécimes humanos, mesmo de indivíduos saudáveis, podem abrigar agentes infecciosos. Educação, treinamento e proteções adequadas são necessárias para lidar com tecidos humanos para garantir a segurança de você e de seus colegas de trabalho.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Baseado Artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente Ex vivo Ampliação da CTL Humanos

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

O isolamento de linfócitos de rato Genital Tract Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Isolamento de linfócitos da pele humana para análise fenotípica e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura de Células

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Crescimento Pairwise competição ensaio para determinar a replicação de Fitness de Imunodeficiência vírus humanos

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infecção de Murino Epiderme com vírus herpes simplex tipo 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Análise de Linfócitos extravasamento Usando um<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo do Sangue-Cérebro humano Barreira

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Sondas de rastreio óptico do romance bactérias específicas no tecido de pulmão humano Ex Vivo por Endomicroscopy Laser Confocal

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...