Name: ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture
Uploaded: 2018-10-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Эта работа была поддержана гранты от Фонда Blanceflor Бонкомпаньи Ludovisi урожденная Бильдт (http://blanceflor.se/), Фонд шведских врачей против СПИДа (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) и Андреа Fondazione e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) к Андреа Introini.

Протокол для коллекции ткани человека может потребовать этические утверждения местными компетентными органами. В случае указанной операции как удаление миндалин и гистерэктомия образцы не являются собранные специально для цели исследования и исследования не считается человеческих...

<ol>
	<li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+HIV-1+phenotype+switch+as+a+causal+factor+in+acquired+immunodeficiency.">Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency.</a> Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).</li><li>Dezzutti, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+and+human+mucosal+tissue+models+to+study+HIV+biomedical+interventions:+can+we+predict+success.">Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success.</a> J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).</li><li>Lederman, M. M., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+node+in+HIV+pathogenesis.">The lymph node in HIV pathogenesis.</a> Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).</li><li>Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reservoirs+as+obstacles+and+opportunities+for+an+HIV+cure.">HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure.</a> Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induced+activation+of+CD4++T+cells+creates+new+targets+for+HIV-1+infection+in+human+lymphoid+tissue+ex+vivo.">HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo.</a> Blood. 111 (2), 699-704 (2008).</li><li>Van Laar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+secretion+of+immunoglobulin+by+long-lived+human+tonsil+plasma+cells.">Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells.</a> Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).</li><li>Introini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminal+plasma+induces+inflammation+and+enhances+HIV-1+replication+in+human+cervical+tissue+explants.">Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants.</a> PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).</li><li>Grivel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+CCR5-+but+not+CXCR4-tropic+HIV-1+in+lymphoid+tissue+by+human+herpesvirus+6.">Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6.</a> Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).</li><li>Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type-2+stimulates+HIV-1+replication+in+cervical+tissues:+implications+for+HIV-1+transmission+and+efficacy+of+anti-HIV-1+microbicides.">Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).</li><li>Lisco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+is+activated+into+a+HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+in+herpesvirus-infected+human+tissues.">Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues.</a> Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).</li><li>Vanpouille, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+anti-cytomegalovirus+drug,+ganciclovir,+inhibits+HIV-1+replication+in+human+tissues+ex+vivo.">A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo.</a> AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).</li><li>Andrei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+tenofovir,+a+microbicide+effective+against+HIV,+inhibits+herpes+simplex+virus-2+replication.">Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication.</a> Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).</li><li>Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+human+immunodeficiency+virus+infection+of+human+cervical+tissue+and+inhibition+by+vaginal+virucides.">Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides.</a> J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+sexual+transmission:+early+events+of+HIV-1+infection+of+human+cervico-vaginal+tissue+in+an+optimized+ex+vivo+model.">HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model.</a> Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+facilitates+HIV-1+transmission+to+cervico-vaginal+tissue+ex+vivo.">Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo.</a> PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+and+dynamic+immunofluorescent+cytometric+bead+assay+for+the+detection+of+HIV-1+p24.">A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24.</a> J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).</li><li>Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=War+and+peace+between+microbes:+HIV-1+interactions+with+coinfecting+viruses.">War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses.</a> Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).</li><li>Keele, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection.">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).</li><li>Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+microenvironments+in+the+human+vagina+and+cervix:+mediators+of+cellular+immunity+are+concentrated+in+the+cervical+transformation+zone.">Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone.</a> Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).</li><li>Ganor, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within+1h,+HIV-1+uses+viral+synapses+to+enter+efficiently+the+inner,+but+not+outer,+foreskin+mucosa+and+engages+Langerhans-T+cell+conjugates.">Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).</li><li>Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R5+HIV-1+envelope+attracts+dendritic+cells+to+cross+the+human+intestinal+epithelium+and+sample+luminal+virions+via+engagement+of+the+CCR5.">R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+testing+of+candidate+topical+microbicides+for+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity+and+tissue+toxicity+in+a+human+cervical+explant+culture.">Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+colorectal+explant+culture+to+evaluate+topical+microbicides+for+the+prevention+of+HIV+infection.">A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection.</a> J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Productive+HIV-1+infection+of+human+cervical+tissue+ex+vivo+is+associated+with+the+secretory+phase+of+the+menstrual+cycle.">Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle.</a> Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).</li></ol>

Использование тканей человека эксплантах для изучения инфекции ВИЧ-1 обеспечивает преимущества над традиционными Би мерной и съедобные экспериментальных систем, таких как главные ячейки или клеточных линий, из-за их высокая способность воспроизводить межклеточных взаимодействий и С...

Монотипические Би мерного клеточных культур, здесь упоминаемые как обычных, не учитывают пространственная и функциональная связь между большим разнообразием типов клеток, которые составляют ткани и органы. Этот аспект имеет первостепенное значение для экспериментальных моделях болезней, как вмешательство в гомеостатических межклеточных взаимодействий является движущим фактором всех патологий. Ткани эксплантов предлагают преимущества для моделирования здоровья и болезни среди людей, поскольку они сохраняют cytoarchitecture и многие важные аспекты функциональных органов, как они находятся в естественных условиях, хотя за ограниченное количество времени1. Например после ex vivo вызов с антигенами напомнить, например, дифтерии анатоксином или столбняка, миндалин ткани реагирует с энергичной производства антиген специфические антитела2. Как и любой другой ex vivo модели, histoculture имеет свои собственные ограничения: изменчивость между донорами, ткань поляризации, выживание ограничены ткани и сложности в мониторинге клетки за пределы глубины confocal микроскопии1. Тем не менее эксплантов тканей человека остаются модель выбора для изучения гомеостаза и патогенных иммунологические процессы в организме человека, в том числе хост возбудитель взаимодействий и потенциальных терапевтических вмешательств3.
Критические события патогенеза ВИЧ-1, имели место в тканях. Инфицирования слизистой оболочки половых органов приходится большинство всех ВИЧ-1 передачи события во всем мире4. Лимфоидной ткани является основной сайт репликации вируса во время острой инфекции и гаваней значительный пул латентно инфицированных клеток5, и их сохранение представляет собой основное препятствие для достижения лечения6. Культура и ex vivo вызов человека лимфоидных и слизистых тканей обеспечивают ряд преимуществ перед обычными системами на основе изолированных клеток для изучения ВИЧ-1. Например клетки ткани резидент может поддерживать инфекции ВИЧ-1 в отсутствие внешних активации, в отличие от мононуклеаров периферической крови1. Использование эксплантов лимфоидной ткани позволило лучше понять некоторые ключевые механизмы, лежащие в основе CD4 T клеток истощениет.е., прохожий эффект7, который является отличительной чертой острой инфекции. Сохранение структуры как B клеток фолликулов в лимфоидной ткани8 и эпителия в женских половых слизистой эксплантов9 предлагает уникальную возможность интегрировать пространственные и функциональные особенности ВИЧ-1 инфекции на этих сайтах. Наконец histocultures были успешно использованы модели и исследования герпеса и ВИЧ-1 инфекции10,11, а также для Доклинические испытания антиретровирусных препаратов и multitarget бактерицидные12, 13 , 14 , 15.
Здесь мы описываем подробный протокол для культуры тканей человека эксплантов, полученные из миндалин и слизистых тканей от нижней женских половых органов (матки), охватывающих рассечение тканей в explant вызов с ВИЧ-1-поляризованных способом. Культура ткани эксплантов в жидкость воздуха интерфейс, с помощью губки желатин в качестве поддержки, максимизирует воздействие воздуха кислорода, обеспечивая доступ к питательной среды питательные вещества через Губка капилляров, затягивая тем самым их естественного распада. Наиболее непосредственным способом оценки репликации ВИЧ-1 в нашей системе заключается в том, чтобы измерить количество вируса, выпущенное в среде культуры экспланта со временем иммуноанализа или ПЦР. Инфекции ВИЧ-1 и патогенез (например., CD4 T клеток истощения) могут также быть оценены в ткани эксплантов путем массового извлечения РНК/ДНК и ПЦР, в situ пятнать или единого анализа клеток после переваривания ткани проточной цитометрии.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:941px;" width="940">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Pfizer</td>
			<td style="width:141px;">NDC:&#160; 0009-0315-08</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">SPONGOSTAN Standard 70 &#215; 50 &#215; 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge</td>
			<td>Ferrosan Medical Devices</td>
			<td>MS0002</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">RPMI 1640 with phenol red and glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Modified Eagle&#39;s medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sodium pyruvate, 100 mM (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Gentamicin 50 mg/mL (1000x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15750037</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Amphotericin B 250 &#956;g/mL (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:49px;width:280px;">Ticarcillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5639-1G</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:280px;">Potassium clavulanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33454-100MG</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:280px;">Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;">To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile cell culture grade water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile transportation container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Disinfectant solution for biological waste disposal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal forceps or tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile flat weighing metal spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile scalpels and blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">6-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">12-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Petri dish, 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>510</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>2522</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Lamivudine (3TC)</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>8146</td>
			<td style="width:345px;">Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:280px;">Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 &#176;C, 5% CO2, &#8805; 90% humidity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Water bath set at 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 &#176;C, 300 rpm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture

Histocultures позволяют изучать межклеточных взаимодействий в тканях человека, и они могут быть использованы для модели взаимодействия хост возбудитель контролируемых лабораторных условиях. Ex vivo инфекции человека тканей с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), среди других вирусов, успешно используется для расследования ранних патогенеза заболеваний, а также платформу для тестирования эффективности и токсичности противовирусных препаратов. В настоящем протоколе мы объясним, как обрабатывать и заразить эксплантов ткани ВИЧ-1 от человека миндалин и шейки матки mucosae и поддерживать их в культуре на вершине желатин губки на интерфейсе жидкости воздуха около двух недель. Этот параметр-поляризованных культуры увеличивает доступ к питательных веществ в питательной среды и кислорода, хотя прогрессирующая потеря целостности тканей и функциональной архитектуры остается основным ограничением. Этот метод позволяет мониторинга репликации ВИЧ-1 и патогенез, используя несколько методов, в том числе immunoassays, ПЦР и проточной цитометрии. Значение физиологическое изменчивость между донорами ткани, а также между эксплантов из разных областей же образца, может существенно повлиять на результаты экспериментов. Для обеспечения воспроизводимости результатов, важно использовать достаточное количество эксплантов, технические реплицирует и доноров соответствием контроля условий для нормализации результаты экспериментального лечения при компиляции данных из нескольких экспериментов (т.е. ., проведенные с помощью ткани от различных доноров) для статистического анализа.

Некоторые методы могут использоваться для оценки репликации ВИЧ-1 в эксплантов ткани. Наши стандартные считывания необходимо измерить количество ВИЧ-1 p24gag выпущен в см с течением времени с иммуноанализа18.
Эксплантов...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Инфекция тканях человека с вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ) ex vivo обеспечивает ценный 3D модель патогенеза вирусов. Здесь мы описываем протокол для обработки и заразить пробах тканей человека миндалин и женских половых mucosae с ВИЧ-1 и поддерживать их в культуре в интерфейсе жидкости воздух.

Ex Vivo Инфекции половых слизистой лимфоидной ткани человека и женщин с вирусом иммунодефицита человека 1 и Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области ВИЧ, такие как выявление детерминантов передачи вируса и патогенеза в двух наиболее эффективных органах инфекции. В самом деле, ключевые передовые вождения прогрессирования болезни происходят в тканях. Особенности и сложность инфекции плохо отражаются клетками в циркуляции или изолированы и инфицированы в пробирке.Основным преимуществом культуры тканей ex vivo для изучения патогенеза ВИЧ является то, что он сохраняет свои оригинальные спациальные и функциональные отношения между клетками, хотя и в течение двух-трех недель. Для начала заполните 100-миллиметровую чашку Петри 20-миллиметровыми 20-30 миллилитров CMT. Перенесите желатиновые губки в чашку Петри с помощью стерильных типсов.Влажные губки с обеих сторон и позволяют губки, чтобы впитать средний в течение одной минуты. Прижимайте губки к нижней части чашки Петри около двух минут с помощью стерильного шпателя. Используйте стерильные ножницы, чтобы разрезать регидратированные губки желатина на кусочки одинакового размера около одного квадратного сантиметра.Затем используйте типсы, чтобы передать один кусок губки в каждый колодец культурной пластины. Добавьте от трех до четырех миллилитров CMT в каждый колодец 6-хорошо пластины для миндалин и один миллилитр на колодец в 12-хорошо пластины для шейки матки. Поместите пластины в инкубатор, установленный на 37 градусов по Цельсию, 5%CO2, и больше, чем или равна 90% влажности, пока ткани explants готовы быть загружены на губки.Перенесите миндали из транспортного контейнера в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую от 10 до 20 миллилитров CMT с помощью стерильных типсов. Используйте крышку чашки Петри в качестве режущей поверхности для вскрытия ткани. Держа ткань нежно с тисью, разрезать каждый миндалин на разные, большие куски с помощью стерильного скальпеля и лезвия.Используйте типсы и скальпель для удаления прижигаемой, кровавой и миомной ткани, а также любых частей, содержащих тонзилолиты или зеленовато-коричневого цвета. Разрежьте каждый кусок ткани на кусочки толщиной около двух миллиметров. Удалите любую нежелательную часть, как на предыдущем шаге.Затем разрежьте ломтики ткани на полоски толщиной в два миллиметра. Наконец, разрежьте полоски ткани на блоки толщиной в два миллиметра. Перенесите экспланты в новую 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую от 10 до 20 миллилитров CMT, чтобы избежать высыхания тканей при переходе к вскрытию.В конце вскрытия закружить пластину, чтобы рандомизировать распределение explant. Поместите девять тканей explants на верхней части каждого желатина губки в 6-хорошо пластины с использованием типсов, что позволяет пространство между ними. Верните тарелки в инкубатор.Как правило, экспланты культури на ночь. Прививка от ВИЧ проводится на следующий день. Это делается для того, чтобы убедиться, что ни одно бактериальное или грибковое загрязнение не развивается в культуре.Кроме того, клетки, как правило, регресс ткани explants сразу после вскрытия. Аспирировать среду в 6-хорошо пластины с пипеткой, и выбросить его в контейнер с дезинфицирующим раствором. Наклоните пластину и осторожно нажмите желатин губки в верхней части хорошо, чтобы среда собраться в нижней части.Аспирировать и отбрасывать среду. Затем добавьте три-четыре миллилитров CMT к каждому хорошо. Сейчас оттаивает препарат от вируса ВИЧ-1 в водяной бане при 37 градусах Цельсия.Pipette вирус inoculum непосредственно на вершине каждого из девяти explants на желатин губки. Верните тарелку в инкубатор. Используйте крышку чашки Петри в качестве режущей поверхности для вскрытия ткани.Держа ткань мягко с типсами, отделить слизистую оболочку эктоцервикса и / или эндоцервикса от нижней стромальной и субмукосы скальпелем и лезвием, чтобы получить полоски слизистой оболочки. Вырежьте слизистую оболочку на полоски шириной в два миллиметра. Удалите и отбросьте как можно больше субмукосы, оставив только двухмиллиметровый слой ткани.Затем разрежьте полоски на блоки толщиной в два миллиметра. Передача ткани explants в новый 100 миллиметров Петри блюдо, содержащее от 10 до 20 миллилитров CMT, чтобы избежать высыхания тканей при переходе с вскрытием. В конце вскрытия закружить пластину, чтобы рандомизировать распределение explant.С помощью стерильных типсов перенесите экспланты в стерильные 1,5 миллилитровые конические трубки. Удалите любую среду в трубке с помощью пипетки. Для достижения оптимальных результатов, экспланты шейки матки должны быть обработаны и инфицированы как можно скорее после операции, в идеале в день операции.Кроме того, ткани могут храниться погруженными в CMT при 4 градусах ночью и инфицированными сразу после вскрытия. Оттепель препарат ВИЧ-1 в водяной бане при 37 градусах по Цельсию. После размораживания перенесите вирус в трубки, содержащие экспланты.Перенесите трубки в термошакер и инкубировать в течение двух часов при 37 градусах по Цельсию при 300 об/мин. Аккуратно инвертировать трубки несколько раз каждые 30 до 60 минут. Между тем, заполнить 6-хорошо пластины с трех до четырех миллилитров на колодец стерильных фосфатов буферного солевого раствора.В конце инкубации с ВИЧ-1, используйте пипетку, чтобы отказаться от всех вирусных препаратов в трубках, содержащих explants в контейнер с дезинфицирующим раствором. Затем используйте типсы и пипетки для передачи explants в 6-ну пластины, содержащей PBS. После позволяя explants отдохнуть в PBS в течение одной минуты при комнатной температуре, мыть их, мягко трубопроводов PBS вверх и вниз в колодец два-три раза.Затем выбросьте PBS в контейнер с дезинфицирующим раствором с помощью пипетки. Добавьте три-четыре миллилитров нового PBS к каждому хорошо. Повторите еще два раза в общей сложности три моет.Отбросьте PBS как раз перед передачей explants к губкам для того чтобы во избежание высыхание ткани. Теперь используйте типсы для передачи от пяти до восьми эксплантов поверх каждой желатиновой губки в пластину из 12 колодец. Верните тарелку в инкубатор.Соберите образец культуры среды с пипеткой, и передать его в стерильные 1,5 или два миллилитров винт крышка трубки для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Урожай ткани explants с стерильными типсами, и передать explants в стерильные 1,5 или два миллилитров винт крышка труб. Обработать или хранить образцы тканей, как того требует эксперимент.Аспирировать остаточную культурную среду в колодец пипеткой и выбросить в контейнер с дезинфицирующим раствором. Наклоните пластину и осторожно нажмите желатин губки в верхней части хорошо, чтобы среда собраться в нижней части, а затем аспирировать и отказаться от него. Теперь добавьте от трех до четырех миллилитров культуры среднего к каждому хорошо.Используя стерильные типсы, верните любые ткани explants, которые упали в среду желатин губки, прежде чем вернуть пластину в инкубатор. По окончании культуры утилизировать все биологические отходы в уместных контейнерах в соответствии с правилами института по обработке опасных биологических веществ, а также конкретной оценкой риска. Вариабельность межкора доноров может повлиять на репликацию ВИЧ-1, измеряемую концентрацией белка p24- вируса ВИЧ в супернатанте культуры эксплантирования тканей ткани матки, как это было продемонстрировано для тканей шейки матки от трех различных доноров, инфицированных одним и тем же вирусом инокулума.Для первого донора, накопление р24 кляп в культуре среды explants инфицированных ВИЧ-1 BaL только четко указывает на продукт инфекции. Антиретровирусный препарат 3TC, который полностью отмахився от репликации ВИЧ, был использован в качестве отрицательного контроля. Количество р24 кляп измеряется в культуре среды 3TC-обработанных эксплантов показывает, доля вируса inoculum асспецифически поглощается и высвобождается ткани explants во время культуры.В ткани explants от второго донора, ВИЧ-1 кишечная инфекция приводит к устойчивому снижению концентрации р24 кляп с течением времени, что свидетельствует о прерывание инфекции или обнаружить p24 кляп количественно. Это подтверждается 3TC-обработанными контрольными эксплантами, которые показывают аналогичную кинетическую репликацию ВИЧ. Инфекция тканевых эксплантов от третьего донора дает малое количество вируса.В этом случае включение лечения 3TC в качестве отрицательного контроля необходимо для установления наличия инфекции с производством вируса de novo. Следуя этой процедуре, аналитические методы, такие как цитометрия потока или иммуностепенирование, могут быть выполнены в разные моменты времени, чтобы ответить на вопросы о фенотипе, пропорции или расположении тканей группы клеток, представляющих интерес. При разработке эксперимента важно оценить влияние вариативности между донорами на экспериментальное считывание выбора.Вариабельность между донорами может быть частично контролируемо путем установления строгих клинических и, возможно, экспериментальных критериев включения и исключения. Культуры ex vivo тканей человека могут быть использованы для изучения патогенеза микробов, помимо ВИЧ, таких как вирус вакцины или вирусы герпеса. Они также используются в качестве доклинтической платформы для исследований токсичности и этики противомикробных препаратов.Пожалуйста, имейте в виду, что все человеческие образцы, даже от здоровых людей, может гавани инфекционных агентов. Соответствующее образование, обучение и защита необходимы для обработки человеческих тканей для обеспечения безопасности вас и ваших коллег.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig основе искусственного антиген представляющих клеток для эффективного Исключая виво Расширение прав CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Выделение лимфоцитов из половых путей мышь Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Оценка Врожденная зондирование инфицированных ВИЧ-1 CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток плазмоцитов дендритных клеток с помощью<em&gt; Экс естественных</em&gt; Совместное культивирование системы.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Лимфоцит Изоляция из человеческой кожи для фенотипического анализа и<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Культура клеток

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Парные Рост конкуренции Анализ для определения репликации Фитнес человека вируса иммунодефицита

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Экс Vivo Заражение мышиных эпидермиса с вирусом простого герпеса типа 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Анализ лимфоцитов экстравазации спользование<em&gt; In Vitro</em&gt; Модель человеческого гематоэнцефалический барьер

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Оптическая скрининг Роман бактерий-конкретных зонды на Ex Vivo человека легочной ткани, Конфокальная лазерная Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...