Name: ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture
Uploaded: 2018-10-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), los médicos suecos de la Fundación contra el SIDA (http://www.aidsfond.se/, Ref. FOa2014-0006) y Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) a Andrea Introini.

El protocolo para la recogida de los tejidos humanos puede requerir aprobación ética de las autoridades locales competentes. En el caso indicadas cirugías como histerectomía y amigdalectomía, los especímenes no se recoge específicamente para el propósito de la investigación y el estudio no se considera la investigación de sujetos humanos (institutos nacionales de salud. Investigación en seres humanos. https://humansubjects.nih.gov/Walkthrough-Investigator#tabpanel11). Sin embargo, obtener datos personales y m?...

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	<li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+HIV-1+phenotype+switch+as+a+causal+factor+in+acquired+immunodeficiency.">Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency.</a> Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).</li><li>Dezzutti, C. 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S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+human+immunodeficiency+virus+infection+of+human+cervical+tissue+and+inhibition+by+vaginal+virucides.">Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides.</a> J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+sexual+transmission:+early+events+of+HIV-1+infection+of+human+cervico-vaginal+tissue+in+an+optimized+ex+vivo+model.">HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model.</a> Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+testing+of+candidate+topical+microbicides+for+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity+and+tissue+toxicity+in+a+human+cervical+explant+culture.">Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+colorectal+explant+culture+to+evaluate+topical+microbicides+for+the+prevention+of+HIV+infection.">A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection.</a> J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Productive+HIV-1+infection+of+human+cervical+tissue+ex+vivo+is+associated+with+the+secretory+phase+of+the+menstrual+cycle.">Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle.</a> Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).</li></ol>

El uso de tejido humano explantes para el estudio de la infección VIH-1 proporciona ventajas sobre los tradicionales sistemas experimentales bidimensional y monotípicos, como células primarias o líneas celulares, debido a su capacidad superior para reproducir las interacciones intercelulares y celular (p. ej., producción de citoquinas) funciona como en vivo. Sin embargo, tejido tonsillar y cervical difieren en muchos aspectos incluyendo el número y características fenotípicas y funcionales de VI...

Cultivos de células bidimensionales monotypic, mencionados aquí como convencionales, no tienen en cuenta la comunicación espacial y funcional entre la gran variedad de tipos celulares que componen los tejidos y órganos. Este aspecto es de suma importancia para los modelos experimentales de enfermedad, como interferir en las interacciones intercelulares homeostáticas es el factor de manejo de patologías de todos. Explantes de tejido ofrecen grandes ventajas para el modelado de salud y enfermedad en los seres humanos porque conservan la Citoarquitectura y muchos importantes aspectos funcionales de los órganos como lo son en vivo, aunque para una cantidad limitada de tiempo1. Por ejemplo, en ex vivo reto con antígenos de recuerdo, como toxoide diftérico o toxoide tetánico, tejido amigdalino responde con una vigorosa producción de anticuerpos antígeno específicos2. Como cualquier otro ex vivo modelo, histoculture tiene sus propias limitaciones: variabilidad entre donante, polarización de tejido, tejido limitada supervivencia y dificultad en el seguimiento de células más allá de la profundidad de la microscopia confocal1. No obstante, los explantes de tejidos humanos siguen un modelo de elección para el estudio de procesos inmunológicos homeostáticos y patógenos en los seres humanos, incluyendo las interacciones huésped-patógeno y posibles intervenciones terapéuticas3.
Los eventos críticos de la patogénesis del VIH-1 tienen lugar en los tejidos. Infección de la mucosa genital representa para la mayoría de los VIH-1 transmisión eventos en todo el mundo4. Tejido linfoide es el principal sitio de replicación del virus durante la infección aguda y alberga una piscina significativa de células infectadas latente5, y su persistencia representa el principal obstáculo para lograr una curación6. El reto de cultura y ex vivo de tejidos linfoides y de la mucosas humanos ofrecen algunas ventajas sobre sistemas convencionales basados en células aisladas para el estudio del VIH-1. Por ejemplo, las células residentes del tejido pueden apoyar la infección HIV-1 en ausencia de activación exógena, a diferencia de las células mononucleares de sangre periférica1. El uso de explantes de tejido linfoide ha permitido una mejor comprensión de algunos mecanismos claves subyacentes T CD4 célula agotamientoes decir, el efecto espectador7, que es el sello de la infección aguda. La preservación de estructuras como folículos de células B en tejidos linfoides8 y el epitelio en explantes de mucosa genital femenina9 ofrece la oportunidad única de integrar características espaciales y funcionales de la infección VIH-1 en estos sitios. Finalmente, histocultures fueron utilizados con éxito al modelo y estudio de10,de coinfección VIH-1 y herpesvirus11, así como para ensayos preclínicos de antirretrovirales y multitarget microbicidas12, 13 , 14 , 15.
Aquí, describimos un protocolo detallado para el cultivo de explantes de tejido humano Obtenido de las amígdalas y mucosas del tracto genital femenino inferior (cuello uterino), cubriendo la disección del tejido para explante desafío con HIV-1 en una forma no polarizada. El cultivo de explantes de tejido en la interfase líquido-aire, utilizando esponjas de gelatina como soporte, maximiza la exposición al oxígeno de aire mientras que proporciona acceso a los nutrientes del medio de cultivo a través de la esponja capilares, retrasando así su descomposición natural. La más inmediata forma de evaluar la replicación del VIH-1 en nuestro sistema es medir la cantidad de virus liberado en el medio de cultivo de explantes con el tiempo por inmunoensayo o qPCR. Infección por VIH-1 y la patogenesia (e.g., depleción de células T CD4) también puede evaluarse en explantes de tejido por la masiva extracción de ARN/ADN y qPCR en situ tinción y análisis de célula única a digestión de tejido mediante citometría de flujo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:941px;" width="940">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Pfizer</td>
			<td style="width:141px;">NDC:&#160; 0009-0315-08</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">SPONGOSTAN Standard 70 &#215; 50 &#215; 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge</td>
			<td>Ferrosan Medical Devices</td>
			<td>MS0002</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">RPMI 1640 with phenol red and glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Modified Eagle&#39;s medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sodium pyruvate, 100 mM (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Gentamicin 50 mg/mL (1000x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15750037</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Amphotericin B 250 &#956;g/mL (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:49px;width:280px;">Ticarcillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5639-1G</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:280px;">Potassium clavulanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33454-100MG</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:280px;">Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;">To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile cell culture grade water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile transportation container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Disinfectant solution for biological waste disposal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal forceps or tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile flat weighing metal spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile scalpels and blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">6-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">12-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Petri dish, 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>510</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>2522</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Lamivudine (3TC)</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>8146</td>
			<td style="width:345px;">Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:280px;">Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 &#176;C, 5% CO2, &#8805; 90% humidity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Water bath set at 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 &#176;C, 300 rpm</td>
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			<td style="width:345px;"></td>
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	</tbody>
</table>

ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture

Histocultures permite estudiar interacciones intercelulares en tejidos humanos, y emplearon a huésped-patógeno modelo bajo condiciones controladas de laboratorio. Infección ex vivo de tejidos humanos con virus de inmunodeficiencia humana (VIH), entre otros virus, se ha utilizado con éxito para investigar la patogénesis de la enfermedad temprana, así como una plataforma para probar la eficacia y la toxicidad de los fármacos antivirales. En el presente Protocolo, se explica cómo procesar e infectar con VIH-1 explantes de tejido de las amígdalas humanas y de la mucosa cervical y mantenerlas en cultivo sobre esponjas de gelatina en la interfase aire-líquido durante unas dos semanas. Esta configuración no polarizado cultura maximiza acceso a nutrientes en el medio de cultivo y oxígeno, aunque la pérdida progresiva de la integridad del tejido y arquitecturas funcionales sigue siendo su principal limitación. Este método permite el control de la replicación del VIH-1 y la patogenesia usando varias técnicas, incluyendo las immunoassays, qPCR y citometría de flujo. De importancia, la variabilidad fisiológica entre los donadores de tejidos, así como explantes de diferentes áreas de la misma muestra, puede afectar significativamente los resultados experimentales. Para asegurar la reproducibilidad del resultado, es fundamental utilizar un número adecuado de explantes, repeticiones técnicas y condiciones de control donantes emparejados para normalizar los resultados de los tratamientos experimentales al compilar datos de múltiples experimentos (es decir, ., realizado con tejido de donantes diferentes) para el análisis estadístico.

Varias técnicas se pueden utilizar para evaluar la replicación del VIH-1 en tejidos de explantes. Nuestra lectura estándar es medir la cantidad de HIV-1 p24gag publicado en CM en el tiempo con un inmunoensayo18.
Explantes de tejido de donantes diferentes, infectados con el mismo inóculo del mismo stock de VIH-1, pueden producir diferentes cantidades de virus (tabla 1). Esto...

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Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infección de tejidos humanos con virus de inmunodeficiencia humana (VIH) ex vivo proporciona un valioso modelo 3D de la patogenesia virus. Aquí, describimos un protocolo e infectar a los especímenes del tejido de las amígdalas humanas y de la mucosa genital femenina con HIV-1 y mantener en la cultura en la interfase líquido-aire.

Ex Vivo Infección de la Mucosa Genital tejido linfoide humano y mujer con Virus de inmunodeficiencia humana 1 y Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del VIH, como la identificación de los determinantes de la transmisión del virus y la patogénesis dentro de dos de los órganos más realizados por la infección. De hecho, la progresión clave avanzada de la enfermedad de conducción tiene lugar en los tejidos. Las características y complejidad de la infección son mal reflejadas por las células en circulación o aisladas e infectadas in vitro.La principal ventaja del cultivo de tejido ex vivo para estudiar la patogénesis del VIH es que conserva sus relaciones espaciales y funcionales originales entre las células, aunque durante dos a tres semanas. Para comenzar, llene un plato de 100 mimeter por 20 milímetros petri con 20 a 30 mililitros de CMT. Transfiera las esponjas de gelatina en el plato Petri usando fórceps estériles.Humedezca las esponjas por ambos lados y deje que las esponjas se empapen medio durante un minuto. Presione las esponjas contra la parte inferior del plato Petri durante unos dos minutos usando una espátula estéril. Usa tijeras estériles para cortar las esponjas de gelatina rehidracionadas en trozos del mismo tamaño de aproximadamente un centímetro cuadrado.A continuación, utilice fórceps para transferir una pieza de esponja a cada pocero de un plato de cultivo. Agregue de tres a cuatro mililitros de CMT en cada pozo de una placa de 6 pozos para las amígdalas y un mililitro por pozo en una placa de 12 pozos para el cuello uterino. Coloque las placas en la incubadora, puestas en 37 grados Celsius, 5%CO2, y mayor o igual a 90% de humedad hasta que los explantes de tejido estén listos para ser cargados en las esponjas.Transfiera las amígdalas del contenedor de transporte a un plato Petri de 100 milímetros que contenga de 10 a 20 mililitros de CMT utilizando fórceps estériles. Utilice la tapa de la placa Petri como superficie de corte para diseccionar el tejido. Sosteniendo el tejido suavemente con fórceps, corte cada amígdala en diferentes trozos grandes usando un bisturí y una cuchilla estériles.Usa fórceps y un bisturí para eliminar el tejido cauterizado, sangriento y fibroma, así como cualquier parte que contenga amigdalitos o de color marrón verdoso. Corte cada pieza de tejido en rodajas de aproximadamente dos milímetros de espesor. Elimine cualquier parte no deseada como en el paso anterior.Luego corta las rebanadas de tejido en tiras de dos milímetros de espesor. Finalmente, corta las tiras de tejido en bloques de dos milímetros de espesor. Transfiera los explantes a un nuevo plato Petri de 100 milímetros que contenga de 10 a 20 mililitros de CMT para evitar la desicación de los tejidos mientras se procede a la disección.Al final de la disección, gire la placa para aleatorizar la distribución del explant. Coloque nueve explantes de tejido encima de cada esponja de gelatina en una placa de 6 pocillos usando fórceps, permitiendo espacio entre ellos. Devuelva las placas a la incubadora.Por lo general, los explantes se cultivan durante la noche. La inoculación con el VIH se realiza al día siguiente. Esto es para asegurarse de que no se desarrolla contaminación bacteriana o fúngica en el cultivo.Además, las células tienden a retroceder los explantes de tejido inmediatamente después de la disección. Aspirar el medio en la placa de 6 pozos con una pipeta y desecharlo en un recipiente con solución desinfectante. Incline la placa y empuje suavemente las esponjas de gelatina a la parte superior del pozo para permitir que el medio se reúna en la parte inferior.Aspirar y desechar el medio. A continuación, agregue de tres a cuatro mililitros de CMT a cada pozo. Ahora descongela la preparación del virus VIH-1 en el baño de agua a 37 grados centígrados.Pipetear el inóculo del virus directamente encima de cada uno de los nueve explantes en una esponja de gelatina. Devuelva la placa a la incubadora. Utilice la tapa de la placa Petri como superficie de corte para diseccionar el tejido.Sosteniendo el tejido suavemente con fórceps, separe la mucosa del ectocervix y/o endocervix de la parte inferior estromal y submucosa con un bisturí y una cuchilla para obtener tiras de mucosa. Corta la mucosa en tiras de dos milímetros de ancho. Retire y deseche tanta submucosa como sea posible, dejando sólo una capa de tejido de dos milímetros de espesor.A continuación, corte las tiras en bloques de dos milímetros de espesor. Transfiera el tejido explanta a un nuevo plato Petri de 100 milímetros que contenga de 10 a 20 mililitros de CMT para evitar la desicación de tejidos mientras se procede a la disección. Al final de la disección, gire la placa para aleatorizar la distribución del explant.Con fórceps estériles, transfiera los explants a tubos cónicos estériles de 1,5 mililitros. Retire cualquier medio del tubo con una pipeta. Para obtener resultados óptimos, los explantes de cuello uterino deben procesarse e infectarse lo antes posible después de la cirugía, idealmente el día de la cirugía.Alternativamente, los tejidos se pueden almacenar sumergidos en CMT a 4 grados durante la noche e infectados inmediatamente después de la disección. Descongelar la preparación del VIH-1 en un baño de agua a 37 grados centígrados. Una vez descongelado, transfiera el virus a los tubos que contienen las plantas.Transfiera los tubos a un termoequipo e incubar durante dos horas a 37 grados Centígrados en balanceo a 300 rpm. Invierta suavemente los tubos unas cuantas veces cada 30 a 60 minutos. Mientras tanto, llene una placa de 6 pozos con tres a cuatro mililitros por pozo de solución salina tamponada de fosfato estéril.Al final de la incubación con VIH-1, utilice una pipeta para desechar toda la preparación del virus en los tubos que contienen los explantes en un recipiente con solución desinfectante. A continuación, utilice fórceps y una pipeta para transferir los explants a la placa de 6 pocillos que contiene PBS. Después de permitir que los explantes descansen en PBS durante un minuto a temperatura ambiente, lávelos suavemente pipeteando el PBS hacia arriba y hacia abajo en el pozo dos a tres veces.A continuación, deseche el PBS en un recipiente con solución desinfectante utilizando una pipeta. Agregue tres a cuatro mililitros de nuevo PBS a cada pozo. Repita dos veces más para un total de tres lavados.Deseche el PBS justo antes de transferir los explants a las esponjas para evitar la desicación de los tejidos. Ahora usa fórceps para transferir de cinco a ocho explantes encima de cada esponja de gelatina a un plato de 12 pocillos. Devuelva la placa a la incubadora.Recoger una muestra de medio de cultivo con una pipeta, y transferirlo a tubos estériles de tapa de tornillo de 1,5 o dos mililitros para su almacenamiento a menos 80 grados Centígrados. Cosecha el tejido explanta con fórceps estériles, y transfiera los explantes a tubos estériles de tapa de tornillo de 1,5 o dos mililitros. Procesar o almacenar las muestras de tejido según lo requiera el experimento.Aspirar el medio de cultivo residual en el pozo con una pipeta, y desecharlo en un recipiente con solución desinfectante. Incline la placa y empuje suavemente las esponjas de gelatina a la parte superior del pozo para permitir que el medio se reúna en la parte inferior, y luego aspire y deseche. Ahora agregue tres a cuatro mililitros de medio de cultivo a cada pozo.Usando fórceps estériles, devuelva cualquier tejido que disminuya en el medio a la esponja de gelatina antes de devolver la placa a la incubadora. Al final del cultivo, deseche todos los residuos biológicos en contenedores apropiados de acuerdo con la normativa del instituto sobre el manejo de productos biológicos peligrosos, así como la evaluación de riesgos específica. La variabilidad entre donantes puede afectar la replicación del VIH-1 medida por la concentración de la mordaza de la proteína del núcleo del VIH p24 en el sobrenadante del cultivo del explanteo de tejidos, como se demuestra para el tejido cervical de tres donantes diferentes infectados con el mismo inóculo virus.Para el primer donante, la acumulación de mordaza p24 en el medio de cultivo de explantes infectados con VIH-1 BaL por sí sola indica claramente una infección del producto. El medicamento antirretroviral 3TC que deroga completamente la replicación del VIH se utilizó como control negativo. La cantidad de mordaza p24 medida en un medio de cultivo de explantes tratados con 3TC revela la fracción de virus inóculo absorbido y liberado por los explantes de tejidos durante el cultivo.En los explantes de tejido del segundo donante, la infección intestinal por VIH-1 produce una disminución constante de la concentración de la mordaza p24 con el tiempo, lo que indica una aborto de infección o indetectable mediante la cuantificación de la mordaza p24. Esto es confirmado por explantes de control tratados con 3TC que muestran una replicación cinética similar del VIH. La infección de los tejidos explanta del tercer donante produce poca cantidad de virus.En este caso, la inclusión del tratamiento 3TC como control negativo es necesaria para determinar la presencia de infección con la producción de virus de novo. Después de este procedimiento, se pueden realizar métodos analíticos como la citometría de flujo o la inmunosumanía en diferentes momentos para responder preguntas sobre el fenotipo, la proporción o la ubicación del tejido de la población celular de interés. Al diseñar el experimento, es importante estimar el impacto de la variabilidad entre donantes en la lectura experimental de elección.La variabilidad entre donantes puede controlarse parcialmente estableciendo criterios clínicos y, posiblemente experimentales de inclusión y exclusión, estrictos. Los cultivos de tejido humano ex vivo se pueden utilizar para estudiar la patogénesis de microbios distintos del VIH, como el virus de la vacuna o los virus del herpes. También se han utilizado como una plataforma preclínica para estudios de toxicidad antimicrobiana y ética.Tenga en cuenta que todos los especímenes humanos, incluso de individuos sanos, pueden albergar agentes infecciosos. Se requiere educación, capacitación y protecciones apropiadas para manejar los tejidos humanos para garantizar la seguridad de usted y sus compañeros de trabajo.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig celdas en función de antígeno artificiales presentación para mejorar la eficiencia Ex vivo Ampliación de los Derechos Humanos CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Investigación

Inmunología e Infección

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Aislamiento de linfocitos de ratón del tracto genital Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

El aislamiento de linfocitos de la piel humana para el Análisis y fenotípica<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultivo Celular

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Crecimiento por parejas Ensayo de competición para determinar la aptitud de replicación de virus de inmunodeficiencia Humanos

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infección de murino Epidermis con virus herpes simplex tipo 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Sondas de detección óptica de novela bacterias específicas en el tejido de pulmón humano Ex Vivo por láser Confocal Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...