Name: ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture
Uploaded: 2018-10-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Detta arbete stöds av bidrag från den stiftelsen Blanceflor Boncompagni-Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), Stiftelsen Svenska läkare mot AIDS (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006), och Fondazione Andrea e Libi Lorini (http : / / fondazionelorini.it/) till Andrea Introini.

Protokoll för insamling av mänskliga vävnader kan kräva etisk godkännande av de lokala behöriga myndigheterna. Vid angivna operationer såsom tonsillektomi och hysterektomi, exemplaren samlas inte speciellt för forskning ändamål och studien anses inte vara försökspersoner forskning (National Institutes of Health. Forskning på människor. https://humansubjects.NIH.gov/Walkthrough-Investigator#tabpanel11). Dock erhålla vävnad givarnas personliga och medicinska data (t.ex., kön, ålder, nuvarande nar...

<ol>
	<li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+HIV-1+phenotype+switch+as+a+causal+factor+in+acquired+immunodeficiency.">Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency.</a> Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).</li><li>Dezzutti, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+and+human+mucosal+tissue+models+to+study+HIV+biomedical+interventions:+can+we+predict+success.">Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success.</a> J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).</li><li>Lederman, M. M., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+node+in+HIV+pathogenesis.">The lymph node in HIV pathogenesis.</a> Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).</li><li>Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reservoirs+as+obstacles+and+opportunities+for+an+HIV+cure.">HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure.</a> Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induced+activation+of+CD4++T+cells+creates+new+targets+for+HIV-1+infection+in+human+lymphoid+tissue+ex+vivo.">HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo.</a> Blood. 111 (2), 699-704 (2008).</li><li>Van Laar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+secretion+of+immunoglobulin+by+long-lived+human+tonsil+plasma+cells.">Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells.</a> Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).</li><li>Introini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminal+plasma+induces+inflammation+and+enhances+HIV-1+replication+in+human+cervical+tissue+explants.">Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants.</a> PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).</li><li>Grivel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+CCR5-+but+not+CXCR4-tropic+HIV-1+in+lymphoid+tissue+by+human+herpesvirus+6.">Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6.</a> Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).</li><li>Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type-2+stimulates+HIV-1+replication+in+cervical+tissues:+implications+for+HIV-1+transmission+and+efficacy+of+anti-HIV-1+microbicides.">Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).</li><li>Lisco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+is+activated+into+a+HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+in+herpesvirus-infected+human+tissues.">Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues.</a> Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).</li><li>Vanpouille, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+anti-cytomegalovirus+drug,+ganciclovir,+inhibits+HIV-1+replication+in+human+tissues+ex+vivo.">A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo.</a> AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).</li><li>Andrei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+tenofovir,+a+microbicide+effective+against+HIV,+inhibits+herpes+simplex+virus-2+replication.">Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication.</a> Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).</li><li>Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+human+immunodeficiency+virus+infection+of+human+cervical+tissue+and+inhibition+by+vaginal+virucides.">Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides.</a> J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+sexual+transmission:+early+events+of+HIV-1+infection+of+human+cervico-vaginal+tissue+in+an+optimized+ex+vivo+model.">HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model.</a> Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+facilitates+HIV-1+transmission+to+cervico-vaginal+tissue+ex+vivo.">Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo.</a> PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+and+dynamic+immunofluorescent+cytometric+bead+assay+for+the+detection+of+HIV-1+p24.">A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24.</a> J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).</li><li>Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=War+and+peace+between+microbes:+HIV-1+interactions+with+coinfecting+viruses.">War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses.</a> Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).</li><li>Keele, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection.">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).</li><li>Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+microenvironments+in+the+human+vagina+and+cervix:+mediators+of+cellular+immunity+are+concentrated+in+the+cervical+transformation+zone.">Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone.</a> Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).</li><li>Ganor, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within+1h,+HIV-1+uses+viral+synapses+to+enter+efficiently+the+inner,+but+not+outer,+foreskin+mucosa+and+engages+Langerhans-T+cell+conjugates.">Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).</li><li>Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R5+HIV-1+envelope+attracts+dendritic+cells+to+cross+the+human+intestinal+epithelium+and+sample+luminal+virions+via+engagement+of+the+CCR5.">R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+testing+of+candidate+topical+microbicides+for+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity+and+tissue+toxicity+in+a+human+cervical+explant+culture.">Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+colorectal+explant+culture+to+evaluate+topical+microbicides+for+the+prevention+of+HIV+infection.">A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection.</a> J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Productive+HIV-1+infection+of+human+cervical+tissue+ex+vivo+is+associated+with+the+secretory+phase+of+the+menstrual+cycle.">Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle.</a> Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).</li></ol>

Användning av mänsklig vävnad explants för studier av HIV-1 infektion ger fördelar jämfört med traditionella bi-dimensionell och monotypiskt experimentella system, såsom primära celler eller cellinjer, på grund av sin överlägsna förmåga att återge intercellulära interaktioner och cellulära funktioner (t.ex., cytokin produktion) som de är i vivo. Dock tonsillar och cervikal vävnad skiljer sig i många aspekter, inklusive numret och fenotypiska och funktionella egenskaper HIV mål celle...

Monotypiskt bi-dimensionell cellkulturer, här avses som konventionella, ska inte redogöra för den rumsliga och funktionella kommunikationen mellan den stora mängden celltyper som komponera vävnader och organ. Denna aspekt är av avgörande betydelse för experimentella modeller av sjukdom, störningar med homeostatiska intercellulära interaktioner är den drivande faktorn av alla patologier. Vävnaden bladsticklingar erbjuder stora fördelar för modellering hälsa och sjukdom hos människor eftersom de behåller cytoarchitecture och många viktiga funktionella aspekter av organ som de är i vivo, men för en begränsad mängd tid1. Exempelvis vid ex vivo utmaning med recall antigener, såsom difteritoxoid eller tetanustoxoid, svarar tonsillar vävnad med en kraftig produktion av antigen-specifika antikroppar2. Som någon annan ex vivo modell, histoculture har sina egna begränsningar: mellan givare variabilitet, vävnad polarisering, begränsad vävnad överlevnad och svårigheter att övervaka celler utöver djupet av konfokalmikroskopi1. Mänsklig vävnad bladsticklingar är ändå en modell av val att studera homeostatiska och patogena immunologiska processer hos människor, inklusive värd-patogen interaktioner och potentiella terapeutiska interventioner3.
HIV-1 patogenes kritiska händelser äga rum i vävnader. Infektion av genitalslemhinnan räkenskaperna för majoriteten av alla HIV-1 överföring händelser i världen4. Lymfatisk vävnad är stora platsen för virusreplikation under akut infektion och hamnar en stor pool av latent infekterade celler5och persistens representerar det främsta hindret för uppnå en bota6. Kultur och ex vivo utmaningen av mänskliga lymfoida och slemhinnor vävnader ger vissa fördelar gentemot konventionella system baserat på isolerade celler för studier av HIV-1. Vävnad-bosatt celler kan stöder exempelvis HIV-1 infektion i avsaknad av exogena aktivering, i motsats till perifera mononukleära blodceller1. Användning av lymfoid vävnad bladsticklingar har möjliggjort en bättre förståelse för vissa viktiga mekanismerna bakom CD4 T cell utarmningdet vill säga, den åskådare effekt7, vilket är kännetecknande för akut infektion. Bevarandet av strukturer som B-cell folliklar i lymfoid vävnad8 och epitelet i kvinnliga genitalslemhinna bladsticklingar9 erbjuder en unik möjlighet att integrera rumsliga och funktionella funktioner för HIV-1 infektion vid dessa platser. Slutligen, histocultures användes framgångsrikt till modell och studie HIV-1 och herpesvirus samtidig infektion10,11, liksom för preklinisk testning av antiretrovirala och multitarget mikrobicider12, 13 , 14 , 15.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för kulturen i mänsklig vävnad bladsticklingar erhållits från tonsiller och slemhinnor vävnad från lägre kvinnliga könsorganen (livmoderhals), som omfattar vävnad dissektion för att explant utmaning med HIV-1 i ett icke-polariserat sätt. Kulturen av vävnad bladsticklingar på det flytande-luft-gränssnittet med Gelatinsvampar som ett stöd, maximerar exponeringen för att luften syre samtidigt som den ger tillgång till odlingsmediet näringsämnen genom svampen kapillärer, därmed fördröja deras naturliga förfall. Det mest direkta sättet att utvärdera HIV-1 replikering i vårt system är att mäta mängden virus släppt explant odlingssubstratet över tid av immunoassay eller qPCR. HIV-1-infektion och patogenes (t.ex., CD4 T cell utarmning) kan också utvärderas i vävnad bladsticklingar av bulk RNA/DNA-extraktion och qPCR, i situ färgning eller enda cell-analys vid vävnad matsmältningen av flödescytometri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:941px;" width="940">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Pfizer</td>
			<td style="width:141px;">NDC:&#160; 0009-0315-08</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">SPONGOSTAN Standard 70 &#215; 50 &#215; 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge</td>
			<td>Ferrosan Medical Devices</td>
			<td>MS0002</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">RPMI 1640 with phenol red and glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Modified Eagle&#39;s medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sodium pyruvate, 100 mM (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Gentamicin 50 mg/mL (1000x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15750037</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Amphotericin B 250 &#956;g/mL (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:49px;width:280px;">Ticarcillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5639-1G</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:280px;">Potassium clavulanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33454-100MG</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:280px;">Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;">To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile cell culture grade water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile transportation container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Disinfectant solution for biological waste disposal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal forceps or tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile flat weighing metal spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile scalpels and blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">6-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">12-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Petri dish, 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>510</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>2522</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Lamivudine (3TC)</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>8146</td>
			<td style="width:345px;">Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:280px;">Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 &#176;C, 5% CO2, &#8805; 90% humidity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Water bath set at 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 &#176;C, 300 rpm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture

Histocultures att studera intercellulära interaktioner inom mänskliga vävnader, och de kan användas till modell värd-patogen interaktioner under kontrollerade laboratorieförhållanden. Ex vivo infektion av mänskliga vävnader med humant immunbristvirus (HIV), bland andra virus, har använts framgångsrikt att undersöka tidiga sjukdomspatogenes, samt en plattform för att testa effekt och toxicitet av antivirala läkemedel. I detta protokoll förklarar vi hur du bearbetar och infektera med HIV-1 vävnad bladsticklingar från mänskliga tonsiller och cervikal slemhinnor, och upprätthålla dem i kultur ovanpå Gelatinsvampar på gränssnittet vätska-luft för ungefär två veckor. Inställningen icke-polariserat kultur maximerar tillgång till näring i odlingsmedium och syre, även om progressiv förlust av vävnad integritet och funktionella arkitekturer förblir dess huvudsakliga begränsning. Denna metod tillåter övervakning av HIV-1 replikering och patogenes med hjälp av flera tekniker, inklusive immunanalyser, qPCR och flödescytometri. Av betydelse, kan fysiologiska variabiliteten mellan vävnad givare samt mellan bladsticklingar från olika delar av samma prov, avsevärt påverka experimentella resultat. För att säkerställa resultatet reproducerbarhet, är det viktigt att använda ett tillräckligt antal bladsticklingar, tekniska replikat och givare-matchade kontroll villkor för att normalisera resultaten av de experimentella behandlingarna när sammanställa data från flera experiment (dvs ., genomförda använda vävnad från olika givare) för statistisk analys.

Flera tekniker kan användas för att bedöma HIV-1 replikering i vävnad bladsticklingar. Våra standard avläsning är att mäta mängden HIV-1 p24gag släpptes i CM över tid med en immunoassay18.
Vävnaden bladsticklingar från olika givare, infekterade med det samma inokulatet av samma bestånd, HIV-1, kan ge olika mängder virus (tabell 1). Detta beror på flera faktorer,...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

Infektion av mänskliga vävnader med humant immunbristvirus (HIV) ex vivo ger en värdefull 3D modell av virus patogenes. Här beskriver vi ett protokoll för att bearbeta och infektera vävnadsprover från mänskliga tonsiller och kvinnliga genitala slemhinnor med HIV-1 och underhålla dem kultur i gränssnittet vätska-luft.

Ex Vivo Infektion av mänskliga lymfoida vävnad och kvinnliga genitala slemhinnan med humant immunbristvirus 1 och Histoculture

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Denna metod kan hjälpa till att besvara viktiga frågor inom HIV-området, såsom identifiering av bestämningsfaktorer för virusöverföring och patogenes inom två av de mest verkställda organen av infektionen. I själva verket, den viktigaste avancerade körning sjukdomsprogression sker i vävnader. Funktionerna och komplexiteten i infektion är dåligt återspeglas av celler i omlopp eller isolerade och infekterade in vitro.Den största fördelen med ex vivo vävnad kultur att studera HIV patogenes är att den behåller sin ursprungliga spacial och funktionella relationer mellan celler även om det för två till tre veckor. Till att börja med fylla en 100 kvarnmeter med 20 millimeter Petri skålen med 20 till 30 milliliter CMT. Överför gelatin svampar i Petri skålen med hjälp av sterila tlyckor.Blöt svamparna på båda sidor och låt svamparna suga upp medium i en minut. Tryck svamparna mot botten av petriskålen i ca två minuter med hjälp av en steril spatel. Använd steril sax för att skära de rehydrerade gelatinsvamparna i bitar av lika stora på cirka en kvadratcentimeter.Använd sedan tens för att överföra en svampbit i varje brunn av en odlingsplatta. Lägg till tre till fyra milliliter CMT i varje brunn av en 6-brunnsplatta för tonsillerna och en milliliter per brunn i en 12-brunnsplatta för livmoderhalsen. Placera plattorna i inkubatorn, inställd på 37 grader Celsius, 5%CO2, och större än eller lika med 90%luftfuktighet tills vävnaden explants är redo att lastas på svampar.Överför tonsillerna från transportbehållaren till en 100 millimeters Petriskål som innehåller 10 till 20 milliliter CMT med hjälp av sterila tlyck. Använd locket på Petriskålen som skäryta för att dissekera vävnaden. Hålla vävnaden försiktigt med teleppor, skär varje tonsill i olika, stora bitar med hjälp av en steril skalpell och blad.Använd tlys och en skalpell för att ta bort kauteriserad, blodig, och fibroid vävnad, samt eventuella delar som innehåller tonsilloliths eller grönbrun färg. Skär varje vävnad bit i skivor av cirka två millimeter i tjocklek. Ta bort eventuell oönskad del som i föregående steg.Skär sedan vävnadsskivorna i två millimeter tjocka remsor. Slutligen skär vävnadsremsorna i två millimeter tjocka block. Överför explantsna in i en ny 100 millimeters Petri- rätt som innehåller 10 till 20 milliliter av CMT för att undvika vävnadsutsöndring medan du fortsätter med dissektionen.I slutet av dissektionen, snurra plattan för att randomisera explantfördelningen. Placera nio vävnad explants ovanpå varje gelatin svamp i en 6-väl platta med hjälp av tympor, vilket ger utrymme mellan dem. Återför plattorna till inkubatorn.Typiskt, explants odlas över natten. Inokulering med HIV utförs nästa dag. Detta för att se till att ingen bakterie- eller svampkontaminering utvecklas i kulturen.Också, celler tenderar att regrediera vävnad explants omedelbart efter dissektion. Aspirera mediet i 6-brunnsplattan med en pipett, och kassera det i en behållare med desinfektionslösning. Luta plattan och tryck försiktigt gelatinsvamparna till den övre delen av brunnen för att låta mediet samlas i botten.Aspirera och kassera mediet. Lägg sedan till tre till fyra milliliter CMT till varje brunn. Nu tina HIV-1 viruspreparat i vattenbadet vid 37 grader Celsius.Pipettera viruset inokulat direkt ovanpå var och en av nio explants på en gelatin svamp. Sätt tillbaka plattan till inkubatorn. Använd locket på Petriskålen som skäryta för att dissekera vävnaden.Hålla vävnaden försiktigt med tänja, separera slemhinnan i ectocervix och/eller endocervix från undersidan stromal och submucosa med en skalpell och blad för att få remsor av slemhinnan. Skär slemhinnan i två millimeter breda remsor. Ta bort och kasta så mycket submucosa som möjligt, vilket bara lämnar ett två millimeter tjockt lager av vävnad.Skär sedan remsorna i två millimeter tjocka block. Överför vävnad explants till en ny 100 millimeter Petri skålen som innehåller 10 till 20 milliliter av CMT för att undvika vävnadsutsöndring medan fortsätter med dissekering. I slutet av dissektionen, snurra plattan för att randomisera explantfördelningen.Med sterila tlyck överför du explanterna till sterila 1,5 milliliter koniska rör. Ta bort eventuellt medium i röret med hjälp av en pipett. För optimala resultat bör explants av livmoderhalsen bearbetas och infekteras så snart som möjligt efter operationen, helst dagen för operationen.Alternativt kan vävnader lagras nedsänkt i CMT vid 4 grader över natten och infekteras omedelbart efter dissektion. Tina HIV-1-preparatet i ett vattenbad vid 37 grader Celsius. När tinas, överföra viruset i rören som innehåller explants.Överför rören i en termoshaker, och inkubera i två timmar vid 37 grader Celsius gunga på 300 rpm. Försiktigt invertera rören några gånger var 30 till 60 minuter. Under tiden, fyll en 6-väl platta med tre till fyra milliliter per brunn av sterilfosfat buffrad saltlösning.I slutet av inkubationen med HIV-1, använd en pipett för att kassera alla virusberedningar i rören som innehåller explanterna i en behållare med desinfektionslösning. Använd sedan tent och en pipett för att överföra explanterna till 6-brunnsplattan som innehåller PBS. Efter att explants att vila i PBS i en minut i rumstemperatur, tvätta dem genom att försiktigt pipettera PBS upp och ner i brunnen två till tre gånger.Släng sedan PBS i en behållare med desinfektionslösning med hjälp av en pipett. Lägg till tre till fyra milliliter nya PBS till varje brunn. Upprepa ytterligare två gånger för totalt tre tvättar.Kassera PBS strax innan du överför explants till svampar för att undvika vävnads uttorkning. Använd nu tivnare för att överföra fem till åtta explants ovanpå varje gelatinsvamp till en 12-brunnsplatta. Sätt tillbaka plattan till inkubatorn.Samla ett prov av odlingsmedium med en pipett, och överför det till sterila 1,5 eller två milliliter skruvlockrör för lagring vid minus 80 grader Celsius. Skörda vävnadsexplanterna med sterila tlyn, och för över explanterna till sterila 1,5 eller två milliliter skruvlockrör. Bearbeta eller lagra vävnadsproverna enligt experimentets krav.Aspirera restkulturmediet i brunnen med en pipetten, och kasta det i en behållare med desinfektionslösning. Luta plattan och tryck försiktigt gelatinsvamparna till den övre delen av brunnen så att mediet kan samlas i botten, och aspirera sedan och kassera det. Nu lägga till tre till fyra milliliter av odlingsmedium till varje brunn.Med hjälp av sterila trikåer, returnera eventuella vävnadsexplantor som föll i mediet till gelatinsvampen innan plattan återsändas till inkubatorn. I slutet av kulturen, bortskaffa allt biologiskt avfall i apposite behållare enligt institutets föreskrifter om hantering av farliga biologiska samt den specifika riskbedömningen. Inter-givare variabilitet kan påverka HIV-1 replikation mätt med koncentrationen av hiv kärnproteinet p24 gag i vävnad explant kultur supernatant, som visat för livmoderhalscancer vävnad från tre olika givare infekterade med samma virus inokulat.För den första givaren, ansamling av p24 gag i odlingsmedium av explants infekterade med HIV-1 BaL ensam indikerar tydligt en produkt infektion. Det antiretrovirala läkemedlet 3TC som helt upphäver HIV-replikation användes som en negativ kontroll. Mängden p24 gag mätt i odlingsmedium av 3TC-behandlade explants avslöjar fraktionen av virus inokulat aspecifically absorberas och frigörs av vävnad explants under kultur.I vävnad explants från den andra givaren, HIV-1 tarminfektion resulterar i en stadig minskning av koncentrationen av p24 gag över tiden, vilket tyder på ett abort av infektion eller omöjlig att upptäcka genom p24 gag kvantifiering. Detta bekräftas av 3TC-behandlade kontroll explants som visar en liknande HIV-replikation kinetic. Infektion av vävnad explants från den tredje givaren ger liten mängd virus.I detta fall är införandet av 3TC-behandlingen som en negativ kontroll nödvändigt för att förta förekomsten av infektion med de novo-virusproduktion. Efter detta förfarande, analytiska metoder som flöde cytometry eller immunfärgning kan utföras vid olika tidpunkter för att svara på frågor om fenotyp, proportion, eller vävnad plats för cellen populationen av intresse. När experimentet utformas är det viktigt att uppskatta vilken inverkan variationer mellan givare har på den experimentella avläsningen av valet.Inter-givare variabilitet kan delvis kontrolleras genom att fastställa stränga kliniska och, eventuellt, experimentell inkludering och uteslutning kriterier. Ex vivo mänskliga vävnadskulturer kan användas för att studera patogenesen hos andra mikrober än HIV, såsom vacciniavirus eller herpesvirus. De har också använts som en preklinisk plattform för antimikrobiell toxicitet och ethicacy studier.Var medveten om att alla mänskliga exemplar, även från friska individer, kan hysa smittämnen. Lämplig utbildning, och skydd krävs för att hantera mänskliga vävnader för att garantera säkerheten för dig och dina medarbetare.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-IG Baserat Konstgjord antigenpresenterande celler för effektiv Ex vivo Utbyggnad av mänskliga CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Isolering av lymfocyter från mus könsorgan Mucosa

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Bedömning av Innate Sensing av HIV-1 infekterade CD4<sup&gt; +</sup&gt; T-celler från Plasmacytoid dendritiska celler med en<em&gt; Ex vivo</em&gt; Samodlingssystemet.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymfocytisolering från human hud för fenotypisk analys och<em&gt; Ex vivo</em&gt; Cell Culture

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

Parvis Tillväxt Konkurrens analys för att bestämma replikerings Fitness av humant immunbristvirus

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex vivo Infektion av Murine Epidermis med herpes simplex virus typ 1

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analys av Lymphocyte Extravasation Med användning av ett<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell av det mänskliga blod-hjärnbarriären

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optiska Screening av nya bakterier-specifika sonder på Ex Vivo mänsklig lungvävnad av Confocal Laser Endomicroscopy

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...