Name: ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture
Uploaded: 2018-10-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Bu eser Vakfı Blanceflor Boncompagni Ludovisi nee Bildt (http://blanceflor.se/), Vakfı İsveçli Doktor AIDS (http://www.aidsfond.se/, ref. FOa2014-0006) ve Fondazione Andrea e Libi Lorini (http karşı gelen hibe tarafından desteklenmiştir : / / fondazionelorini.it/) Andrea Introini için.

İnsan doku topluluğu için iletişim kuralı yerel yetkili makamlar tarafından etik onay gerektirebilir. Belirtilen ameliyatları tonsillektomi ve histerektomi gibi durumunda örnekler özellikle araştırma amaç için toplanan değildir ve çalışma insan denekler araştırma (Ulusal Sağlık Enstitüleri. kabul edilmez İnsan denek üzerinde araştırma. https://humansubjects.nih.gov/Walkthrough-investigator#tabpanel11). Ancak, doku bağış kişisel ve tıbbi veri alma (Örn., cinsiyet, yaş, geçerli uy...

<ol>
	<li>Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+human+tissue+explants+to+study+human+infectious+agents.">Use of human tissue explants to study human infectious agents.</a> Nature protoc. 4 (2), 256-269 (2009).</li><li>Glushakova, S., Grivel, J. C., Fitzgerald, W., Sylwester, A., Zimmerberg, J., Margolis, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+HIV-1+phenotype+switch+as+a+causal+factor+in+acquired+immunodeficiency.">Evidence for the HIV-1 phenotype switch as a causal factor in acquired immunodeficiency.</a> Nat Med. 4 (2), 346-349 (1998).</li><li>Dezzutti, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+and+human+mucosal+tissue+models+to+study+HIV+biomedical+interventions:+can+we+predict+success.">Animal and human mucosal tissue models to study HIV biomedical interventions: can we predict success.</a> J Int AIDS Soc. 18 (1), 20301 (2015).</li><li>Lederman, M. M., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lymph+node+in+HIV+pathogenesis.">The lymph node in HIV pathogenesis.</a> Semin Immunol. 20 (3), 187-195 (2008).</li><li>Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+reservoirs+as+obstacles+and+opportunities+for+an+HIV+cure.">HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure.</a> Nat Immunol. 16 (6), 584-589 (2015).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+induced+activation+of+CD4++T+cells+creates+new+targets+for+HIV-1+infection+in+human+lymphoid+tissue+ex+vivo.">HIV-1 induced activation of CD4+ T cells creates new targets for HIV-1 infection in human lymphoid tissue ex vivo.</a> Blood. 111 (2), 699-704 (2008).</li><li>Van Laar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+secretion+of+immunoglobulin+by+long-lived+human+tonsil+plasma+cells.">Sustained secretion of immunoglobulin by long-lived human tonsil plasma cells.</a> Am J Pathol. 171 (3), 917-927 (2007).</li><li>Introini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seminal+plasma+induces+inflammation+and+enhances+HIV-1+replication+in+human+cervical+tissue+explants.">Seminal plasma induces inflammation and enhances HIV-1 replication in human cervical tissue explants.</a> PLoS Pathog. 13 (5), 1006402 (2017).</li><li>Grivel, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+CCR5-+but+not+CXCR4-tropic+HIV-1+in+lymphoid+tissue+by+human+herpesvirus+6.">Suppression of CCR5- but not CXCR4-tropic HIV-1 in lymphoid tissue by human herpesvirus 6.</a> Nat Med. 7 (11), 1232-1235 (2001).</li><li>Rollenhagen, C., Lathrop, M. J., Macura, S. L., Doncel, G. F., Asin, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+type-2+stimulates+HIV-1+replication+in+cervical+tissues:+implications+for+HIV-1+transmission+and+efficacy+of+anti-HIV-1+microbicides.">Herpes simplex virus type-2 stimulates HIV-1 replication in cervical tissues: implications for HIV-1 transmission and efficacy of anti-HIV-1 microbicides.</a> Mucosal Immunol. 7 (5), 1165-1174 (2014).</li><li>Lisco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acyclovir+is+activated+into+a+HIV-1+reverse+transcriptase+inhibitor+in+herpesvirus-infected+human+tissues.">Acyclovir is activated into a HIV-1 reverse transcriptase inhibitor in herpesvirus-infected human tissues.</a> Cell Host Microbe. 4 (3), 260-270 (2008).</li><li>Vanpouille, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+common+anti-cytomegalovirus+drug,+ganciclovir,+inhibits+HIV-1+replication+in+human+tissues+ex+vivo.">A common anti-cytomegalovirus drug, ganciclovir, inhibits HIV-1 replication in human tissues ex vivo.</a> AIDS. 31 (11), 1519-1528 (2017).</li><li>Andrei, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topical+tenofovir,+a+microbicide+effective+against+HIV,+inhibits+herpes+simplex+virus-2+replication.">Topical tenofovir, a microbicide effective against HIV, inhibits herpes simplex virus-2 replication.</a> Cell Host Microbe. 10 (4), 379-389 (2011).</li><li>Greenhead, P., Hayes, P., Watts, P. S., Laing, K. G., Griffin, G. E., Shattock, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parameters+of+human+immunodeficiency+virus+infection+of+human+cervical+tissue+and+inhibition+by+vaginal+virucides.">Parameters of human immunodeficiency virus infection of human cervical tissue and inhibition by vaginal virucides.</a> J Virol. 74 (12), 5577-5586 (2012).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+sexual+transmission:+early+events+of+HIV-1+infection+of+human+cervico-vaginal+tissue+in+an+optimized+ex+vivo+model.">HIV-1 sexual transmission: early events of HIV-1 infection of human cervico-vaginal tissue in an optimized ex vivo model.</a> Mucosal Immunol. 3 (3), 280-290 (2010).</li><li>Introini, A., Vanpouille, C., Lisco, A., Grivel, J. C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-7+facilitates+HIV-1+transmission+to+cervico-vaginal+tissue+ex+vivo.">Interleukin-7 facilitates HIV-1 transmission to cervico-vaginal tissue ex vivo.</a> PLoS Pathog. 9 (2), 1003148 (2013).</li><li>Biancotto, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+highly+sensitive+and+dynamic+immunofluorescent+cytometric+bead+assay+for+the+detection+of+HIV-1+p24.">A highly sensitive and dynamic immunofluorescent cytometric bead assay for the detection of HIV-1 p24.</a> J Virol Methods. 157 (1), 98-101 (2009).</li><li>Lisco, A., Vanpouille, C., Margolis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=War+and+peace+between+microbes:+HIV-1+interactions+with+coinfecting+viruses.">War and peace between microbes: HIV-1 interactions with coinfecting viruses.</a> Cell Host Microbe. 6 (5), 403-408 (2009).</li><li>Keele, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+transmitted+and+early+founder+virus+envelopes+in+primary+HIV-1+infection.">Identification and characterization of transmitted and early founder virus envelopes in primary HIV-1 infection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (21), 7552-7557 (2008).</li><li>Pudney, J., Quayle, A. J., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+microenvironments+in+the+human+vagina+and+cervix:+mediators+of+cellular+immunity+are+concentrated+in+the+cervical+transformation+zone.">Immunological microenvironments in the human vagina and cervix: mediators of cellular immunity are concentrated in the cervical transformation zone.</a> Biol Reprod. 73 (6), 1253-1263 (2005).</li><li>Ganor, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Within+1h,+HIV-1+uses+viral+synapses+to+enter+efficiently+the+inner,+but+not+outer,+foreskin+mucosa+and+engages+Langerhans-T+cell+conjugates.">Within 1h, HIV-1 uses viral synapses to enter efficiently the inner, but not outer, foreskin mucosa and engages Langerhans-T cell conjugates.</a> Mucosal Immunol. 3 (5), 506-522 (2010).</li><li>Cavarelli, M., Foglieni, C., Rescigno, M., Scarlatti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R5+HIV-1+envelope+attracts+dendritic+cells+to+cross+the+human+intestinal+epithelium+and+sample+luminal+virions+via+engagement+of+the+CCR5.">R5 HIV-1 envelope attracts dendritic cells to cross the human intestinal epithelium and sample luminal virions via engagement of the CCR5.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 776-794 (2013).</li><li>Cummins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+testing+of+candidate+topical+microbicides+for+anti-human+immunodeficiency+virus+type+1+activity+and+tissue+toxicity+in+a+human+cervical+explant+culture.">Preclinical testing of candidate topical microbicides for anti-human immunodeficiency virus type 1 activity and tissue toxicity in a human cervical explant culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (5), 1770-1779 (2007).</li><li>Abner, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+colorectal+explant+culture+to+evaluate+topical+microbicides+for+the+prevention+of+HIV+infection.">A human colorectal explant culture to evaluate topical microbicides for the prevention of HIV infection.</a> J Infect Dis. 192 (9), 1545-1556 (2005).</li><li>Saba, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Productive+HIV-1+infection+of+human+cervical+tissue+ex+vivo+is+associated+with+the+secretory+phase+of+the+menstrual+cycle.">Productive HIV-1 infection of human cervical tissue ex vivo is associated with the secretory phase of the menstrual cycle.</a> Mucosal Immunol. 6 (6), 1081-1090 (2013).</li></ol>

İnsan dokusu kullanımını explants için HIV-1 enfeksiyonu çalışmanın geleneksel iki boyutlu ve monotypic deneysel sistemleri, primer hücre veya hücre hatları, üstün sizdirmaz kartu hücreler arası etkileşimler çoğaltmak gibi avantajlar sağlar ve vivo içindeoldukları gibi hücresel (Örneğin, sitokin üretim) çalışır. Yine de, Bademciklere ve servikal doku sayısı ve HIV hedef hücreleri1,16fenotipik ve fonksiyonel özel...

Monotypic iki boyutlu hücre kültürleri, burada için geleneksel olarak, sevk dokuları oluşturan hücre türleri çok çeşitli ve organlar arasındaki kayma ve işlevsel iletişim için hesap yapmak. Tüm patolojiler itici faktör homeostatik hücreler arası etkileşimler ile girişim olduğu gibi bu hastalık, deneysel modeller için büyük önem yönüdür. Doku explants sınırlı bir zaman1rağmen için in vivo, oldukları gibi cytoarchitecture ve birçok önemli işlevsel açıdan organları korumak için sağlık ve hastalık insanlarda modelleme için önemli avantajlar sunuyor. Örneğin, difteri toksoidi veya tetanoz toksoidi gibi hatırlama antijenleri ile ex vivo meydan okuma üzerine Bademciklere doku antijen spesifik antikorlar2güçlü bir üretim ile birlikte yanıt verir. Başka bir ex vivo model gibi histoculture kendi sınırlamaları vardır: arası donör değişkenliği, doku polarizasyon, sınırlı doku hayatta kalma ve confocal mikroskobu1derinliği ötesinde hücreleri izleme zorluk. Yine de, insan dokusu explants bir model tercih insanlar ana bilgisayar-patojen etkileşimleri ve potansiyel terapötik müdahaleler3de dahil olmak üzere, homeostatik ve patojenik immünolojik işlemlerinde çalışmaya kalır.
HIV-1 patogenezinde önemli olaylar doku gerçekleşecek. Tüm HIV-1 iletim olaylar Dünya çapında4çoğunluğu genital mukoza hesaplarında enfeksiyonu. Lenfoid doku virüs çoğaltma sırasında akut enfeksiyon önemli sitedir ve gizlice enfekte hücreleri5önemli bir havuz limanlar ve onların kalıcı bir tedavi6elde etmek için ana engel temsil eder. İnsan lenfoid ve mukozal doku kültürü ve ex vivo meydan geleneksel sistemleri izole hücreler HIV-1 çalışma için temel bazı avantajlar sağlar. Örneğin, yerleşik doku hücreleri yokluğunda periferik kan mononükleer hücreler1aksine eksojen harekete geçirmek, HIV-1 enfeksiyonu destekleyebilir. Lenfoid doku explants kullanımı CD4 T hücre tükenmesiyani, seyirci etkisi7, akut enfeksiyon damgasını olan altta yatan bazı anahtar mekanizmaları daha iyi anlaşılmasını sağladı. B hücre köklerinin lenfoid doku8 ve epitel kadın genital mukoza explants9 gibi yapılar korunması HIV-1 enfeksiyonu bu sitelerdeki kayma ve fonksiyonel özellikleri bütünleştirmek için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Son olarak, histocultures başarıyla modeli ve çalışma HIV-1 ve herpesvirus Co enfeksiyon10,11yanı sıra preklinik antiretrovirals ve multitarget microbicides12, test etmek için kullanılmıştır 13 , 14 , 15.
Burada, biz meydan okuma ile HIV-1 sigara polarize bir şekilde explant için doku diseksiyon kapsayan bademcikler ve alt kadın genital sistem (serviks), mukozal doku elde edilen insan dokusu explants kültür için detaylı bir protokol tanımlamak. Doku explants olarak bir destek, Jelatin sünger kullanarak sıvı-hava arabirimi, kültür oksijen kılcal, böylece onların doğal çürüme geciktirerek kültür orta besin sünger aracılığıyla erişim sağlarken hava maruz en üst düzeye çıkarır. HIV-1 çoğaltma sistemimizde değerlendirme en acil virüs explant kültür ortamda zamanla immunoassay veya qPCR tarafından yayımlanan miktarını ölçmek için yoludur. HIV-1 enfeksiyonu ve Patogenez (Örn., CD4 T hücre tükenmesi) Ayrıca doku explants tarafından toplu RNA/DNA ekstraksiyon ve qPCR, in situ boyama veya tek hücre-doku sindirim üzerine analiz akış sitometresi tarafından değerlendirilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:941px;" width="940">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Gelfoam 12-7 mm Absorbable gelatin sponge&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Pfizer</td>
			<td style="width:141px;">NDC:&#160; 0009-0315-08</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">SPONGOSTAN Standard 70 &#215; 50 &#215; 10 mm Absorbable haemostatic gelatin sponge</td>
			<td>Ferrosan Medical Devices</td>
			<td>MS0002</td>
			<td>Gelfoam and Spongostan perform equally well in histocuture for both tonsillar and cervical tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">RPMI 1640 with phenol red and glutamine</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21875034</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Modified Eagle&#39;s medium (MEM) non-essential aminoacids (100x)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11140035</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sodium pyruvate, 100 mM (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11360070</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Gentamicin 50 mg/mL (1000x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15750037</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Amphotericin B 250 &#956;g/mL (100x)&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15290018</td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Fetal bovine serum (FBS)&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To RPMI1640 add MEM non-essential aminoacids, sodium pyruvate, gentamicin, amphotericin B and FBS 15% (v/v) to make culture medium (CM).</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:49px;width:280px;">Ticarcillin disodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5639-1G</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="82">
			<td height="82" style="height:82px;width:280px;">Potassium clavulanate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33454-100MG</td>
			<td>Resuspend in sterile cell culture grade water tircacillin disodium (3g) and potassium clavulanate (100mg) and mix to obtain 100 mL of antibiotic solution (100x). Aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing. Supplement CM with antibiotic solution to make CMT.</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:280px;">Sterile phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 w/o calcium, magnesium and phenol red</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;">To use for storage and transportation of surgical specimens. PBS can be replaced with another isotonic solution with physiologic pH. Culture medium is best for overnight storage.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile cell culture grade water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile transportation container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">70% ethanol solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Disinfectant solution for biological waste disposal</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal forceps or tweezers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile metal scissors</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile flat weighing metal spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile scalpels and blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">6-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">12-well cell culture plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile Petri dish, 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:43px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1BaL</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>510</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:280px;">Cell-free HIV-1 viral preparation HIV-1LAI.04</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>2522</td>
			<td>The virus should be propagated to generate a stock large enough to perform several experiments. Aliquote virus suspension and store at -80 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Lamivudine (3TC)</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>8146</td>
			<td style="width:345px;">Resuspend in DMSO at 10 mg/ml, aliquote and store at -20 &#176;C. Avoid repeated freezing and thawing.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Biological safety cabinet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:280px;">Water-jacketed CO2 incubator, set at 37 &#176;C, 5% CO2, &#8805; 90% humidity</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Water bath set at 37 &#176;C</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:280px;">Sterile 1.5- and 2-mL screw cap tubes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:280px;">Dry bath shaker with heating block for 1.5-mL tubes, set at 37 &#176;C, 300 rpm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:345px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo infection of human lymphoid tissue and female genital mucosa with human immunodeficiency virus 1 and histoculture

Hücreler arası etkileşimler insan dokularda okuyan Histocultures izin ve onlar modeli ana bilgisayar-patojen etkileşimleri kontrollü laboratuvar koşullarında için istihdam edilebilir. Ex vivo enfeksiyon ile arasında diğer virüs, insan immün yetmezlik virüsü (HIV), insan dokuların erken hastalık patogenezinde yanı sıra etkinlik ve antiviral ilaçlar toksisite test etmek için bir platform araştırmak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Mevcut iletişim kuralında, biz nasıl işlemek ve HIV-1 doku explants insan bademcikler ve servikal mucosae bulaştırmak ve yaklaşık iki hafta süreyle kültür üzerine Jelatin sünger sıvı-AIR arabirimiyle, proje için açıklar. Her ne kadar doku bütünlüğü ve fonksiyonel mimarileri ilerici kaybı onun ana sınırlama kalır bu sigara polarize kültür ayarı kültür orta ve oksijen, besin erişimin en üst düzeye çıkarır. Bu yöntem, HIV-1 çoğaltma ve uzun, qPCR ve akış sitometresi dahil olmak üzere çeşitli yöntemlerle Patogenez izleme sağlar. Önemi, fizyolojik değişkenliğine doku bağışçılar arasında yanı sıra aynı örnek farklı alanlardan explants arasında deneysel sonuçlar önemli ölçüde etkileyebilir. Sonuç tekrarlanabilirlik emin olmak için deneysel tedavilerin sonuçları birden fazla deneyler veri derleme zaman normalize etmek explants, teknik çoğaltır ve donör eşlemeli denetim koşullar yeterli sayıda kullanmak için önemlidir (yani ., yapılan doku farklı bağışçılardan kullanarak) istatistiksel analiz için.

HIV-1 çoğaltma doku explants içinde değerlendirmek için çeşitli teknikler kullanılabilir. Bizim standart okuma zaman bir immunoassay18CM serbest HIV-1 p24gag miktarını ölçmek etmektir.
Doku explants ile aynı HIV-1 stokunun inoculum aynı enfekte farklı bağışçılardan virüsü (Tablo 1) farklı miktarlarda verim. Sayısı ve durumu HIV-1 hedef hücre ve doku<su...

Watch this Scientific Journal Video about Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture at JoVE.com

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV) ex vivo insan kurcalayarak enfeksiyon virüs Patogenez değerli bir 3D modeli sağlar. Burada, işlemek ve doku örnekleri insan bademcikler ve kadın genital mucosae HIV-1 enfekte ve kültür sıvı-AIR arabirimiyle, proje için bir protokol açıklayın.

Ex Vivo İnsan lenfoid doku ve erkek Genital mukoza insan immün yetmezlik virüsü 1 ve Histoculture ile enfeksiyonun

Histocultures allow studying intercellular interactions within human tissues, and they can be employed to model host-pathogen interactions under ...

Bu yöntem, hiv alanındaki virüs bulaşması ve patogenezinin determinantlarının belirlenmesi gibi, enfeksiyondan en çok etkilenen organlardan ikisinde anahtar soruların yanıtlatIlmesine yardımcı olabilir. Aslında, anahtar ileri sürüş hastalığı ilerlemesi dokularda yer alır. Enfeksiyon özellikleri ve karmaşıklığı kötü dolaşımdaki hücreler tarafından yansıtılır veya izole ve in vitro enfekte.HIV patogenezi incelemek için ex vivo doku kültürünün en büyük avantajı iki ila üç hafta süreyle hücreler arasındaki orijinal aralıklı ve fonksiyonel ilişkilerini korumaktadır. Başlamak için, 20 milimetre petri kabı ile 100 milyon metre cmt 20 ila 30 mililitre doldurun. Jelatin süngerleri steril çömetler kullanarak Petri kabına aktarın.Her iki tarafta sünger ıslatın ve süngerbir dakika orta kadar emmek için izin verin. Süngerleri petri kabının dibine iki dakika kadar steril bir spatula kullanarak bastırın. Yaklaşık bir santimetre kare eşit büyüklükte parçalar halinde rehydrated jelatin sünger kesmek için steril makas kullanın.Sonra bir kültür plaka her kuyuiçine bir sünger parçası aktarmak için forceps kullanın. Bademcikler için 6 kuyulu bir plakanın her kuyuya 3-4 mililitre CMT ve serviks için 12 kuyuluk bir plakaya her bir mililitre ekleyin. 37 santigrat derece, %5 CO2 ve daha yüksek veya % 90 nemden daha yüksek veya eşit olarak ayarlanan plakaları kuvöze yerleştirin.Bademcikleri taşıma kabından steril çiller kullanarak 10 ila 20 mililitre CMT içeren 100 milimetrelik Petri kabına aktarın. Doku incelemek için bir kesme yüzeyi olarak Petri çanak kapağını kullanın. Pişme ile hafifçe doku tutma, steril bir neşter ve bıçak kullanarak farklı, büyük parçalar halinde her bademcik kesti.Korterize, kanlı ve fibroid doku yanı sıra tonsilloliths veya yeşilimsi-kahverengi renk içeren herhangi bir parça kaldırmak için terlik ve neşter kullanın. Kalınlığı yaklaşık iki milimetre dilimler halinde her doku parçası kesin. Önceki adımda olduğu gibi istenmeyen parçayı kaldırın.Sonra iki milimetre kalınlığında şeritler halinde doku dilimleri kesti. Son olarak, iki milimetre kalınlığında bloklar halinde doku şeritler kesti. Diseksiyon ile devam ederken doku desiccation önlemek için CMT 10 ila 20 mililitre içeren yeni bir 100 milimetre Petri kabına ekspertiz aktarın.Diseksiyonun sonunda, ekstrektifi dağılımını rasgele leştirmek için plakayı döndürün. Her jelatin süngerin üzerine, forceps kullanarak 6 kuyulu bir plakaya dokuz doku eksbitkisi yerleştirin ve aralarında boşluk bırakarak. Plakaları kuvöze geri ver.Tipik olarak, ekstesiek bitkiler bir gecede kültürlenir. ERTESI gün HIV aşısı yapılır. Bu kültürde bakteriyel veya mantar kontaminasyonu gelişmediğinden emin olmak içindir.Ayrıca, hücreler diseksiyon hemen sonra doku ekstrnere gerileme eğilimindedir. Bir pipet ile 6-well plaka orta aspire ve dezenfektan çözeltisi ile bir kap içinde atın. Tabağı yatırın ve jelatin süngerleri yavaşça kuyunun üst kısmına doğru itin ve ortamın alt kısımda toplanmasını bekleyin.Aspire ve orta atın. Sonra her kuyuya 3-4 mililitre CMT ekleyin. Şimdi 37 santigrat derece su banyosunda HIV-1 virüs hazırlık eritin.Pipet bir jelatin sünger üzerinde dokuz eksbitki her üstüne doğrudan virüs inoculum. Tabağı kuvöze geri ver. Doku incelemek için bir kesme yüzeyi olarak Petri çanak kapağını kullanın.Mendolu pİşplerle hafifçe tutarak, ektoserviks in mukozasını ve/veya endoservisi, neşter ve bıçak la altından, neşter ve bıçakla ayırArak mukoza şeritlerini elde edin. Mukozayı iki milimetre genişliğinde şeritler halinde kesin. Sadece iki milimetre kalınlığında bir doku tabakası bırakarak mümkün olduğunca çok submukoza çıkarın ve atın.Sonra şeritleri iki milimetre kalınlığında parçalarhalinde kesin. Diseksiyon ile devam ederken doku desiccation önlemek için CMT 10 ila 20 mililitre içeren yeni bir 100 milimetre Petri kabına doku ekstrperleri aktarın. Diseksiyonun sonunda, ekstrektifi dağılımını rasgele leştirmek için plakayı döndürün.Steril forceps ile, steril 1,5 mililitre konik tüpler içine explants aktarın. Pipet kullanarak tüpteki herhangi bir ortamı çıkarın. Optimum sonuçlar için serviks eksektifleri ameliyat sonrası en kısa sürede işlenmeli ve enfekte edilmelidir.Alternatif olarak, dokular cmt bir gecede 4 derece batık ve diseksiyon hemen sonra enfekte saklanabilir. 37 santigrat derecede bir su banyosunda HIV-1 hazırlık çözültün. Çözüldükten sonra, eksplandan içeren tüplere virüs aktarın.Tüpleri bir termoshaker'a aktarın ve 300 rpm'de sallanan 37 santigrat derecede iki saat kuluçkaya yatın. Tüpleri her 30-60 dakikada bir hafifçe ters çevirin. Bu arada, steril fosfat tamponlu tuzlu kuyu başına üç ila dört mililitre ile 6-iyi plaka doldurun.HIV-1 ile kuluçka sonunda, dezenfektan solüsyonu ile bir kap içine eksplantlar içeren tüpler tüm virüs hazırlık atmak için bir pipet kullanın. Daha sonra eksplleri PBS içeren 6 kuyulu plakaya aktarmak için çerseps ve pipet kullanın. Ekstesitbitkilerin oda sıcaklığında bir dakika PBS'de dinlenmesine izin vererek, PBS'yi 2-3 kez yukarı ve aşağı boruyla yıkayarak yıkayın.Daha sonra PBS'yi pipet kullanarak dezenfektan solüsyonu olan bir kap içine atın. Her kuyuya üç ila dört mililitre yeni PBS ekleyin. Toplam üç yıkıntı için iki kez daha tekrarlayın.Doku desiccation önlemek için sünger ekstremite transfer hemen önce PBS atın. Şimdi her jelatin süngerin üzerine 5-8 eksbitkiyi 12 kuyulu bir tabağa aktarmak için forceps kullanın. Tabağı kuvöze geri ver.Bir pipet ile kültür ortamı bir örnek toplamak ve eksi 80 santigrat derece depolama için steril 1,5 veya iki mililitre vidalı kapak tüpleri içine aktarın. Steril forceps ile doku ekstrperler hasat ve steril 1.5 veya iki mililitre vidalı kapak tüpleri içine explants aktarın. Doku örneklerini deney gereği işleme veya saklama.Bir pipet ile kuyuda artık kültür ortamı aspire ve dezenfektan çözeltisi ile bir kap içine atın. Tabağı yatırın ve jelatin süngerleri yavaşça kuyunun üst kısmına doğru itin ve ortamın alt tabakada toplanıp aspire edip atmasını bekleyin. Şimdi her kuyuya 3-4 mililitre kültür ortamı ekleyin.Steril forceps kullanarak, kuvöz plaka dönmeden önce jelatin sünger orta düştü herhangi bir doku eksültörü döndürün. Kültürün sonunda, tüm biyolojik atıkları, enstitünün tehlikeli biyolojik lerin taşınması na ilişkin yönetmeliklerine ve özel risk değerlendirmesine göre apposite kaplarına atın. Inter-donör değişkenliği, aynı virüs inokülile enfekte üç farklı donörlerin servikal doku için gösterildiği gibi, doku ekstrüzyon kültür supernatant HIV çekirdek protein p24 gag konsantrasyonu ile ölçülen HIV-1 replikasyonu etkileyebilir.İlk donör için, sadece HIV-1 BaL ile enfekte eksplants kültür orta p24 gag birikimi açıkça bir ürün enfeksiyonu gösterir. HIV replikasyonlarını tamamen azaltan antiretroviral ilaç 3TC negatif kontrol olarak kullanıldı. 3TC ile tedavi edilen eksbitkilerin kültür ortamında ölçülen p24 gag miktarı, kültür sırasında doku ekskbitkileri tarafından özel olarak emilen ve salınan virüs inokülfraksiyonunun fraksiyonunu ortaya koymaktadır.İkinci donörden doku eksektinde, HIV-1 barsak enfeksiyonu zaman içinde p24 öğürme konsantrasyonunda sürekli bir azalmaya neden olur, bu da p24 öğürme niceliği ile enfeksiyonun azaldığını veya tespit edilemeyen bir hastalık olduğunu gösterir. Bu benzer bir HIV çoğaltma kinetik gösteren 3TC tedavi kontrol eksektif tarafından doğrulanır. Üçüncü donörden doku eksektimi enfeksiyonu çok az miktarda virüs verir.Bu durumda, de novo virüs üretimi ile enfeksiyonun varlığını tespit etmek için negatif kontrol olarak 3TC tedavisinin dahil edilmesi gereklidir. Bu prosedürü takiben, akış sitometrisi veya immünostaining gibi analitik yöntemler, ilgi hücre popülasyonunun fenotip, oranveya doku konumu ile ilgili soruları yanıtlamak için farklı zaman noktalarında gerçekleştirilebilir. Deneyi tasarlarken, inter-donör değişkenliğinin seçimin deneysel okuması üzerindeki etkisini tahmin etmek önemlidir.Inter-donör değişkenliği, sıkı klinik ve muhtemelen deneysel dahil etme ve dışlama kriterleri ayarlayarak kısmen kontrol edilebilir. Ex vivo insan doku kültürleri vaccinia virüsü veya herpes virüsleri gibi HIV dışındaki mikropların patogenezini incelemek için kullanılabilir. Ayrıca antimikrobiyal toksisite ve etilik çalışmaları için bir preklinik platform olarak kullanılmaktadır.Lütfen sağlıklı bireylerden gelen tüm insan örneklerinin bulaşıcı ajanlar barındırabileceğini unutmayın. Sizin ve iş arkadaşlarınızın güvenliğini sağlamak için insan dokularını işlemek için uygun eğitim, öğretim ve korumalar gereklidir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Ex Vivo Infection of Human Lymphoid Tissue and Female Genital Mucosa with Human Immunodeficiency Virus 1 and Histoculture

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

Verimli HLA-Ig Tabanlı Yapay antijen sunan hücrelerin Ex vivo</emİnsan CTL> Genleşme

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

Fare Genital Sistemlerinin Mukozanin gelen Lenfosit İzolasyonu

Mucosal surfaces, including in the gastrointestinal, urogenital, and respiratory tracts, provide portals of entry for pathogens, such as viruses and ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

HIV-1 Enfekte CD4 Doğuştan Algılama Değerlendirilmesi<sup&gt; +</sup&gt; Bir kullanılması plazmositoid dendritik hücreler tarafından T Hücreleri<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-kültür sistemi.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Lymphocyte Isolation from Human Skin for Phenotypic Analysis and Ex Vivo Cell Culture

Fenotipik Analizi ve İnsan Cilt lenfosit izolasyonu<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Hücre Kültürü

Human skin has an important barrier function and contains various immune cells that contribute to tissue homeostasis and protection from pathogens. As the ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

İnsan İmmün Yetmezlik Virüs çoğaltma Fitness belirlenmesi için İkili Büyüme Rekabet Analizi

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1

Herpes Simplex virüs tip 1 ile murin Epidermis Ex ​​vivo enfeksiyon

To enter its human host, herpes simplex virus type 1 (HSV-1) must overcome the barrier of mucosal surfaces, skin, or cornea. HSV-1 targets keratinocytes ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Kan-beyin bariyeri Model

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Optical Screening of Novel Bacteria-specific Probes on Ex Vivo Human Lung Tissue by Confocal Laser Endomicroscopy

Roman bakteri özel optik tarama Ex Vivo insan Akciğer doku Confocal lazer Endomicroscopy tarafından probları

Improving the speed and accuracy of bacterial detection is important for patient stratification and to ensure the appropriate use of antimicrobials. To ...