Name: single-cell resolution fluorescence live imaging of drosophila circadian clocks in larval brain culture
Uploaded: 2018-01-19T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture at JoVE.com

Agradecemos a Michael Rosbash por su asesoría y apoyo durante la fase inicial del desarrollo de este método. Este trabajo fue financiado por el PRESTO JST programa, la Fundación Nacional Suiza de ciencia (31003A_149893 y 31003A_169548), el Consejo Europeo de investigación (ERC-StG-311194), Fundación Novartis para la investigación biomédica médica (13A39) y la Universidad de Ginebra .

1. preparación de soluciones Stock bajo una campana de cultura
<ol><li>Preparar 400 mL de 1 x medio activo Schneider (SAM) optimizado para cultivo ex vivo de cerebros larvales (modificado de referencia24,25) (tabla 1). Alícuota de 5 mL y flash congelar en nitrógeno líquido (LN2), tienda a - 80 ° C.</li>
	<li>Preparar 1 x disecante solución salina (DSS) por dilución 10 x solución (modificado de referencia<sup class="x...

<ol>
	<li>Sheeba, V., Kaneko, M., Sharma, V. K., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+circadian+pacemaker+circuit:+Pas+De+Deux+or+Tarantella?.">The Drosophila circadian pacemaker circuit: Pas De Deux or Tarantella?.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 43 (1), 37-61 (2008).</li><li>Granados-Fuentes, D., Herzog, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clock+shop:+coupled+circadian+oscillators.">The clock shop: coupled circadian oscillators.</a> Exp Neurol. 243, 21-27 (2013).</li><li>Zhang, Y., Emery, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+15+-+Molecular+and+neural+control+of+insects+circadian+rhythms.">Chapter 15 - Molecular and neural control of insects circadian rhythms.</a> Insect molecular biology and biochemistry. , 513-551 (2012).</li><li>Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetic+analysis+of+circadian+timekeeping+in+Drosophila.">Molecular genetic analysis of circadian timekeeping in Drosophila.</a> Adv Genet. 74, 141-173 (2011).</li><li>Yoshii, T., Rieger, D., Helfrich-Forster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+clocks+in+the+brain:+an+update+of+the+morning+and+evening+oscillator+model+in+Drosophila.">Two clocks in the brain: an update of the morning and evening oscillator model in Drosophila.</a> Prog Brain Res. 199, 59-82 (2012).</li><li>Malpel, S., Klarsfeld, A., Rouyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+synchronization+and+rhythmicity+in+larval+photoperception-defective+mutants+of+Drosophila.">Circadian synchronization and rhythmicity in larval photoperception-defective mutants of Drosophila.</a> J Biol Rhythms. 19 (1), 10-21 (2004).</li><li>Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+pacemaker+neurons+transmit+and+modulate+visual+information+to+control+a+rapid+behavioral+response.">Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response.</a> Neuron. 45 (2), 293-300 (2005).</li><li>Sabado, V., Vienne, L., Nunes, J. M., Rosbash, M., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+circadian+imaging+reveals+a+PDF-dependent+transcriptional+regulation+of+the+Drosophila+molecular+clock.">Fluorescence circadian imaging reveals a PDF-dependent transcriptional regulation of the Drosophila molecular clock.</a> Sci Rep. 7, 41560 (2017).</li><li>Hyun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+GPCR+Han+is+a+receptor+for+the+circadian+clock+neuropeptide+PDF.">Drosophila GPCR Han is a receptor for the circadian clock neuropeptide PDF.</a> Neuron. 48 (2), 267-278 (2005).</li><li>Lear, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+G+protein-coupled+receptor,+groom-of-PDF,+is+required+for+PDF+neuron+action+in+circadian+behavior.">A G protein-coupled receptor, groom-of-PDF, is required for PDF neuron action in circadian behavior.</a> Neuron. 48 (2), 221-227 (2005).</li><li>Mertens, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDF+receptor+signaling+in+Drosophila+contributes+to+both+circadian+and+geotactic+behaviors.">PDF receptor signaling in Drosophila contributes to both circadian and geotactic behaviors.</a> Neuron. 48 (2), 213-219 (2005).</li><li>Ayaz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila.">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li><li>Prithviraj, R., Trunova, S., Giniger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culturing+of+whole,+developing+Drosophila+brains.">Ex vivo culturing of whole, developing Drosophila brains.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Siller, K. H., Serr, M., Steward, R., Hays, T. S., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+brain+neuroblasts+reveals+a+role+for+Lis1/dynactin+in+spindle+assembly+and+mitotic+checkpoint+control.">Live imaging of Drosophila brain neuroblasts reveals a role for Lis1/dynactin in spindle assembly and mitotic checkpoint control.</a> Mol Biol Cell. 16 (11), 5127-5140 (2005).</li><li>Zschatzsch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+branching+dynamics+by+axon-intrinsic+asymmetries+in+Tyrosine+Kinase+Receptor+signaling.">Regulation of branching dynamics by axon-intrinsic asymmetries in Tyrosine Kinase Receptor signaling.</a> Elife. 3, e01699 (2014).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+developing+and+adult+Drosophila+brains+and+retinae+for+live+imaging.">Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging.</a> J Vis Exp. (37), (2010).</li><li>Roberts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+evokes+rapid+circadian+network+oscillator+desynchrony+followed+by+gradual+phase+retuning+of+synchrony.">Light evokes rapid circadian network oscillator desynchrony followed by gradual phase retuning of synchrony.</a> Curr Biol. 25 (7), 858-867 (2015).</li><li>Sehadova, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+entrainment+of+Drosophila's+circadian+clock+involves+the+gene+nocte+and+signaling+from+peripheral+sensory+tissues+to+the+brain.">Temperature entrainment of Drosophila's circadian clock involves the gene nocte and signaling from peripheral sensory tissues to the brain.</a> Neuron. 64 (2), 251-266 (2009).</li><li>Sellix, M. T., Currie, J., Menaker, M., Wijnen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence/luminescence+circadian+imaging+of+complex+tissues+at+single-cell+resolution.">Fluorescence/luminescence circadian imaging of complex tissues at single-cell resolution.</a> J Biol Rhythms. 25 (3), 228-232 (2010).</li><li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronous+Drosophila+circadian+pacemakers+display+nonsynchronous+Ca(2)(+)+rhythms+in+vivo.">Synchronous Drosophila circadian pacemakers display nonsynchronous Ca(2)(+) rhythms in vivo.</a> Science. 351 (6276), 976-981 (2016).</li><li>Liang, X., Holy, T. E., Taghert, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Series+of+Suppressive+Signals+within+the+Drosophila+Circadian+Neural+Circuit+Generates+Sequential+Daily+Outputs.">A Series of Suppressive Signals within the Drosophila Circadian Neural Circuit Generates Sequential Daily Outputs.</a> Neuron. , (2017).</li><li>Kuppers-Munther, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+culturing+strategy+optimises+Drosophila+primary+cell+cultures+for+structural+and+functional+analyses.">A new culturing strategy optimises Drosophila primary cell cultures for structural and functional analyses.</a> Dev Biol. 269 (2), 459-478 (2004).</li><li>Schneider, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+Larval+Drosophila+Eye-Antennal+Discs+in+Vitro.">Differentiation of Larval Drosophila Eye-Antennal Discs in Vitro.</a> J Exp Zool. 156, 91-103 (1964).</li><li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels.">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J Neurophysiol. 94 (1), 491-500 (2005).</li><li>Hafer, N., Schedl, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+larval+CNS+in+Drosophila+melanogaster.">Dissection of larval CNS in Drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (1), e85 (2006).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rabinovich, D., Mayseless, O., Schuldiner, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culturing+of+Drosophila+brain+as+a+method+to+live+image+pupal+brains:+insights+into+the+cellular+mechanisms+of+neuronal+remodeling.">Long term ex vivo culturing of Drosophila brain as a method to live image pupal brains: insights into the cellular mechanisms of neuronal remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 327 (2015).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+keep+non-adhering+living+cells+in+place+on+glass+for+perfusion+or+fixation.">Fibrin clots keep non-adhering living cells in place on glass for perfusion or fixation.</a> Cell Biol Int. 29 (9), 721-730 (2005).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Res. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Lukinavi&#269;ius, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SiR-Hoechst+is+a+far-red+DNA+stain+for+live-cell+nanoscopy.">SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy.</a> Nature Communications. 6, 8497 (2015).</li><li>Medioni, C., Ephrussi, A., Besse, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+axonal+transport+in+Drosophila+pupal+brain+explants.">Live imaging of axonal transport in Drosophila pupal brain explants.</a> Nat Protoc. 10 (4), 574-584 (2015).</li><li>Enoki, R., Ono, D., Hasan, M. T., Honma, S., Honma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+imaging+of+circadian+rhythms+detected+with+a+Nipkow+spinning+disk+confocal+system.">Single-cell resolution fluorescence imaging of circadian rhythms detected with a Nipkow spinning disk confocal system.</a> J Neurosci Methods. 207 (1), 72-79 (2012).</li><li>Ozel, M. N., Langen, M., Hassan, B. A., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Filopodial+dynamics+and+growth+cone+stabilization+in+Drosophila+visual+circuit+development.">Filopodial dynamics and growth cone stabilization in Drosophila visual circuit development.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Yao, Z., Macara, A. M., Lelito, K. R., Minosyan, T. Y., Shafer, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+functional+neuronal+connectivity+in+the+Drosophila+brain.">Analysis of functional neuronal connectivity in the Drosophila brain.</a> J Neurophysiol. 108 (2), 684-696 (2012).</li></ol>

Aquí describimos el método de largo plazo de microscopía de fluorescencia Time-lapse de cerebros larvas cultivados. El éxito de este tipo de experimentos depende de múltiples factores, tales como la salud de la cultura, método para la inmovilización del explante de cerebro, la intensidad de fluorescencia y relación señal a ruido de la reportera, temporal y resolución espacial, y accesibilidad para el explante. Estos factores pueden ser mutuamente excluyentes. Por ejemplo, aumento de frecuencia de lapso de tiemp...

Relojes circadianos ayudan a los organismos para adaptarse a los cambios ambientales periódicos generados por la rotación de 24 h de la tierra. Los circuitos de retroalimentación transcripcional y traduccional enclavijado comúnmente subyacen la maquinaria molecular de los relojes circadianos a través de especies1. El circuito del marcapasos circadiano compuesto de reloj que contiene neuronas integra información de hora del día, transmitido por las señales ambientales, como luz/oscuridad (LD) y ciclos de temperatura, a coordinar los ritmos de una plétora de diario fisiológico y procesos conductuales2,3. La coordinación de ritmos moleculares neuronales entradas y salidas es críticamente importante para el funcionamiento del circuito circadiano pero sigue siendo sólo parcialmente entendida.
En Drosophila, en el centro del reloj molecular, el heterodímero/ciclo de reloj (CLK/CYC) activa la transcripción del período (por) y timeless (tim). PER y TIM forman un complejo y entrar en el núcleo, donde inhiben la actividad transcripcional de CLK/CYC y en consecuencia su propia transcripción. Reglamentos postranscripcional y poste-de translación causan retrasos entre CLK/CYC-mediada por transcripción y represión por / TIM, asegurando la generación de alrededor de 24-h oscilaciones moleculares1,3,4 . Unos 150 neuronas que contiene estos relojes moleculares forma un circuito para control circadiano comportamiento de adulto vuela5. Un mucho más simple pero totalmente funcional circadiano circuito que consiste en 3 grupos de neuronas reloj - 5 las neuronas laterales ventrales (LNvs; 4 LNvs PDF-positivo y uno negativo PDF LNv, ver abajo), 2 Dorsal neurona 1 (DN1s) y 2 2s Dorsal de neuronas (DN2s) - está presente en las larvas cerebro de6,7.
El simple circuito circadiano larvas ofrece un excelente modelo para estudiar las interacciones entre la comunicación inter neuronal y el mecanismo molecular. Usando nuestro nuevo reportero fluorescente por TDT, que imita los niveles de proteína y su localización subcelular, se intentó caracterizar la dinámica de la mecánica molecular en subgrupos de reloj diferentes neuronas en el circuito circadiano larvas 8. conocer el papel fundamental del factor de dispersión de pigmento neuropéptido (PDF) producido por 4 LNvs en la regulación de los ritmos circadianos en el nivel neuronal9,10,11, además, queríamos examinar el directo efecto de PDF sobre los relojes moleculares. Para ello, se desarrolló un método para controlar la expresión de genes circadianos ritmos en cerebro larvas presentaron durante varios días por microscopia confocal Time-lapse. El protocolo fue adaptado también para que Ensayos farmacológicos probar el efecto de PDF u otros compuestos en el nivel de la por-TDT. Así, la adaptación consiste en hacer accesible al uso de la droga la cultura de explante de cerebro, aumentando la resolución temporal y proyección de imagen para una duración más corta.
Ex vivo la cultura del cerebro de Drosophila de diferentes etapas de desarrollo han sido previamente establecidas12,13,14,15,16,17 ,18. Considerando que estos protocolos se han utilizado para la proyección de imagen distintos fenómenos biológicos, algunos de ellos no son compatibles con la proyección de imagen en resolución unicelulares o no apoyo la cultura por más de varias horas. Métodos alternativos para realizar proyección de imagen a largo plazo de vivo de neuronas circadianas en Drosophila incluyen proyección de imagen de bioluminiscencia de ritmos molecular19,20,21 y proyección de imagen de fluorescencia de indicador de calcio con microscopia de luz hoja22,23. Aunque proyección de imagen de bioluminiscencia puede conseguir mayor resolución temporal y microscopía de luz de hoja puede ser adaptable para proyección de imagen en vivo , están limitadas en la resolución espacial y requieren sistemas especializados de microscopio.
El método descrito aquí está diseñado para visualizar señales fluorescentes en la cultura de todo el cerebro unicelular resolución durante varios días. Este método fácil y versátil puede adaptarse a cerebros de mosca adulta imagen cultivada y para experimentos farmacológicos estudiar diferentes problemas en Neurobiología de la Drosophila .

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td>I am not sure they are exactly the same ones we have in the lab. I chose &#34;suitable for insect cell culture&#34; whenever available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+) Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I0516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIS-TRIS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(&#8722;)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Succinic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Ketoglutaric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K1128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-heat-inactivated, Foetal Calf Serum (FCS) Mycoplasma and Virus screened</td>
			<td>BioConcept Ltd. Amimed</td>
			<td>2-01F30-I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-KOH, pH 7.4</td>
			<td>E&#38;K Scientific Products</td>
			<td>EK-654011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from bovine plasma</td>
			<td>Calbiochem (Merck)</td>
			<td>341573-1GM</td>
			<td>CAUTION: Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed. Manipulate under laminar flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9549</td>
			<td>CAUTION: Health Hazard, use gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH</td>
			<td>Chi Scientific</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vaccum grease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Dish, No. 1.5 Coverslip, 20 mm Glass Diameter, Uncoated</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dishes</td>
			<td>fisherscientific</td>
			<td>08-772A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 500 mL Steritop-GP 33 mm threaded bottle top filter, 0.22 &#956;m</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) film</td>
			<td>Dupont</td>
			<td>200A Teflon FEP Film</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLHV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22&#160;&#181;m, PVDF, 33&#160;mm, gamma sterilized</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SLGV033RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three-well glass dissection dish</td>
			<td>Any company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps, size 5, Dumont</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tandem scanner inverted TCS SP5 confocal microscope, with resonant scanner and HyD photo-multiplier detectors</td>
			<td>Leica microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature control chamber</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td>The CUBE &#38; BOX temperature control system, custom designed</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stage-top humidity controller</td>
			<td>Life Imaging Services</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Immersion Micro Dispenser: dispenser, extended micro-pump MP6 series and Autoimmersion Objective Controller software</td>
			<td>Leica microsystem CMS GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SUM-stack creation and 3D correction drift plugin</td>
			<td>ImageJ software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x iterative deconvolution</td>
			<td>AutoQuant and Imaris software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell resolution fluorescence live imaging of drosophila circadian clocks in larval brain culture

El circuito del marcapasos circadiano orquesta rítmicas salidas conductuales y fisiológicas coordinadas con señales ambientales, tales como ciclos de día/noche. El reloj molecular dentro de cada neurona de marcapasos genera ritmos circadianos en la expresión génica, que subyacen a las funciones neuronales rítmicas esenciales para el funcionamiento del circuito. Investigación de las propiedades de los osciladores moleculares individuales en diferentes subclases de las neuronas marcapasos y su interacción con la señalización neuronal produce una mejor comprensión del circuito del marcapasos circadiano. Aquí, presentamos un enfoque de Time-lapse microscopia fluorescente desarrollado para controlar el mecanismo molecular en las neuronas reloj del culto cerebro larvas de Drosophila . Este método permite la grabación de varios día de los ritmos de reporteros circadianos fluorescentes genéticamente codificados en resolución unicelular. Esta configuración puede combinarse con manipulaciones farmacológicas a analizar de cerca la respuesta en tiempo real del reloj molecular para varios compuestos. Más allá de los ritmos circadianos, este método polivalente en combinación con potentes técnicas de genética de la Drosophila ofrece la posibilidad de estudiar diversos procesos neuronales o moleculares en el tejido vivo cerebral.

Presentamos los resultados representativos de la grabación a largo plazo de un reportero fluorescente circadiano en ex vivo cerebro larvas cultura y los resultados de imagen vivo de PDF baño aplicación para la expresión del reportero.
Larvas L3 vagando por no expresar el reportero reloj molecular por TDT y la UAS-mCD8::YFP conducido por un conductor de neurona de reloj Clk 856-gal4 (fig...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture at JoVE.com

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

El objetivo del presente Protocolo es establecer ex vivo Drosophila larvas cerebro cultura optimizada para controlar ritmos circadianos moleculares con imágenes de Time-lapse de fluorescencia a largo plazo. También se discute la aplicación de este método a los ensayos farmacológicos.

Sola célula resolución fluorescencia vivo la proyección de imagen de relojes circadianos de Drosophila en cerebro larvas cultura

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

Visualization of Larval Segmental Nerves in 3rd Instar Drosophila Larval Preparations

La visualización de larvas Nervios segmentarios en 3 Rd Instar Drosophila Preparación de larvas

Drosophila melanogaster is emerging as a powerful model system for studying the development and function of the nervous system, particularly because of ...

Investigación

Neurociencias

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Células vivas imágenes de células de los órganos sensoriales Precursor en Intacto Drosophila Las pupas

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

Un enfoque rápido para imágenes de fluorescencia de alta resolución en rodajas de cerebro semi-gruesa

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Morphological Analysis of Drosophila Larval Peripheral Sensory Neuron Dendrites and Axons Using Genetic Mosaics

Análisis morfológico de Drosophila Larvas dendritas neurona sensorial periférica y axones Con mosaicos genéticos

Nervous system development requires the correct specification of neuron position and identity, followed by accurate neuron class-specific dendritic ...

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling

Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling  |

Sin láser y de captura de enfoque de Microscopía de la microdisección de regiones discretas del cerebro del ratón para el aislamiento de ARN total y Downstream secuenciación de próxima generación y de perfiles de expresión génica

As technological platforms, approaches such as next-generation sequencing, microarray, and qRT-PCR have great promise for expanding our understanding of ...

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

The embryonic spinal cord consists of cycling neural progenitor cells that give rise to a large percentage of the neuronal and glial cells of the central ...

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo Live Imaging of Single Cell Divisions in Mouse Neuroepithelium

Ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio

We developed a system that integrates live imaging of fluorescent markers and culturing slices of embryonic mouse neuroepithelium. We took advantage of ...

Live Imaging of Mitosis in the Developing Mouse Embryonic Cortex

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Although of short duration, mitosis is a complex and dynamic multi-step process fundamental for development of organs including the brain. In the ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Super-resolución de imagen de Neuronales vesículas de núcleo denso

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Live Imaging of Drosophila Larval Neuroblasts

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Stem cells divide asymmetrically to generate two progeny cells with unequal fate potential: a self-renewing stem cell and a differentiating cell. Given ...