Name: engineering 'golden' fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence
Uploaded: 2018-04-27T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

هذا العمل كان يدعمها "البحث المؤسسة الألمانية" (كتلة من التميز "توحيد المفاهيم في الحفز) أمورنا وملحوظة، و" الوزارة الاتحادية للتعليم "والعلوم (الفدرالية برنامج '' HSP 2020 ''، ويميبلوس تو سينتوبيو المشروع) إلى واو-ج. س.

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

لتحقيق الكفاءة إدماج نكا عالية جداً، يعتمد الأسلوب SPI المستندة إلى أوكسوتروفي على استخدام الخلايا المضيفة أيضي هندسيا، التي غير قادرة على تجميع المناظر الطبيعية المقابلة للرابطة الوطنية لرياضة. كولاي، مثل سلالات متوفرة بسهولة. حتى إدراج المتزامنة ncAAs متعددة في نفس البروتين من الممكن استخدام سلالات مولتياوكسوتروفيك. يمكن اعتبار الوضع خاصة ببقايا الاستبدال ومرجع الكيميائية تقتصر على النظير كيميائية مماثلة السلبيات. ومع ذلك، يمكن أن تنتج عددا كبيرا من المتغيرات البروتين كجهاز ترجمة البكتيرية الطبيعية تتسامح مع العديد من الأحماض الأمينية النظير. على سبيل المثال، يمكن إدراج ncAAs أكثر من 50 في البروتينات باستخدام الترجمة في المختبر ، تستأثر بحوالي 73 في المائة من جميع codons للشفرة الجينية لتكون متاحة لإعادة انتداب40. وعلاوة على ذلك، يمكنك أيضا السماح SPI وسمها تنشيط كفاءة البروتين المستهدف41. من حيث المبدأ، لا يقتصر على كولايالمنهجية SPI، ولكن يمكن أن تعمل في أي مضيف آخر و لكل من الأحماض الأمينية 20 المتعارف عليه، شريطة أن تتوفر سلالات أوكسوتروفيك وزراعة محددة بوسائل الإعلام. على سبيل المثال، هما الميثيونين النظير، أزيدوهوموالانيني (Aha) وهوموبروبارجيلجليسيني (Hpg)، المتاحة تجارياً والمستخدمة لتصنيف البروتينات وبروتيوميس في الكائنات المتنوعة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إنتاج إينتراسيلولارلي اها وإدراجها في وقت لاحق في البروتين42. نكا هذا مناسبة خاصة للاقتران بيورثوجونال مثل الكيمياء انقر كما وضعتها تيريل وزملاء العمل: على سبيل المثال، في زرع الأنسجة نبات التمويل، في بومباي موري اليرقات43، المورفولوجية خلايا44،45 من الزرد اليرقات فضلا عن خلايا الثدييات بما في ذلك الخلايا العصبية46، يمكن أن يوصفوا البروتينات مع اها47،48. وبالمثل، والنظير الراديكالي أدرجت بنجاح في الببتيدات المضادة للميكروبات في الحزب أوكسوتروفيك لاكتيس لاكتوكوككوس سلالات49. SPI مفيد أيضا لميدان إكسينوبيولوجي50،51، الذي يستكشف بدائل للتركيبة الكيميائية الأساسية للحياة. على سبيل المثال، استناداً إلى الأعمال السابقة على كولاي52 و نجحت53، عبئا كولاي قد وضعته مؤخرا استراتيجية تطورية مع الضغط الانتقائي الاستفادة من ثينوبيرولي بدلاً من اندول، أدى إلى استبدال البروتين على نطاق المنظومة من التربتوفان من ثينوبيرولي--ألانين في الشفرة الجينية54. عموما، والأحماض الأمينية المتعارف عليه الحزب، التي هي مرمزة بواسطة الثلاثي مفرد (UGG)، يعرض هدفا واعدة لهندسة البروتينات بسبب جوانب غنية من الكيمياء اندول، الذي يقدم العديد من الاختلافات الكيميائية. مؤخرا، وكبديل للتأسيس على أساس SPI، أفادت رواية المنبوذة منصة قادرة على دمج النظير الحزب سيتيسبيسيفيكالي في المضيفين سواء البكتيرية أو التوكسينات وكان55. وهذا يوسع كذلك صندوق الأدوات في فيفو الهندسة المستندة إلى نكا البروتين، بما في ذلك تغيير الخصائص الطيفية.
وإلى جانب استخدام المضيفين التعبير أوكسوتروفيك، يتطلب البروتوكول SPI شروط التخمير صارمة، سواء من حيث توقيت التعبير الهدف وتكوين المتوسط بغية التوصل إلى كفاءة عالية في إدماج نكا والغلة البروتين المستهدف 56-تتم زراعة استخدام الوسائط الحد الأدنى محددة كيميائيا، التي تتضمن أساسا إلى جانب الأملاح الرئيسية مصادر النيتروجين (ملح الأمونيوم) والكربون (د-الجلوكوز) والفيتامينات والعناصر النزرة. على الرغم من عدم دقة المطلوبة في غياب مزيد من أوكسوتروفيس، الأحماض الأمينية المتبقية (20-n، إذا الأحماض الأمينية n لتحل محلها) تتم عادة إضافة إلى تعزيز النمو البكتيري57. خلال مرحلة نمو أولى قبل تنظيم دورات تعريفية للتعبير البروتين الهدف، تتم إضافة الأحماض الأمينية ن الكنسي لتحل محلها في الحد من تركيزات. عائدات النمو الخلوي حتى تنضب الأحماض الأمينية الأساسية المستهدفة، كما تجريبيا المؤشرة OD ثابتة600. فيما بعد، يتم استبدال المتوسطة الثقافة المتوسطة جديدة تفتقر إلى الأحماض الأمينية المنضب ويحتوي على نكا في تركيزات وفيرة. لإدراج ريبوسومال من التربتوفان النظير كما هو مبين في هذا البروتوكول، ويتم تغذية اندول تناظرية، الذي يصبح إينتراسيلولارلي تحويله إلى مشتقات التربتوفان المقابلة التربتوفان synthase58. المقبل، هو فعل التعبير البروتين الهدف. وفي هذه المرحلة، الخلايا بالقرب من نهاية النمو لوغاريتمي، كتوازن بين عدد الخلايا الإجمالي واللياقة البدنية. كما الوجود والتأسيس للمتعارف عليه الأمينية ستؤدي إلى إنتاج البروتين البرية من نوع، أنها حاسمة لضمان أن الأحماض الأمينية الأساسية هو النضوب الكامل قبل التعريفي. وبالمثل، وملزمة لدراسة فعالية إدماج نكا البروتين المستهدف، عادة بالطيف الكتلي. في حالة تواجد كبير من الأحماض الأمينية الكنسي، زراعة ظروف الحاجة إلى تعديلها، مثلاً، بتغيير تركيز amino acid(s) الأساسية لمرحلة النمو الأولى أو في المدة الأخيرة. في حالة نشاط aaRS منخفضة نحو ncAA، overexpression إنزيم الذاتية أو التعبير المشترك عن aaRS مختلفة، وأكثر نشاطا تجاه ncAA، يمكن أن تجري59.
حمض أميني الكنسي الراديكالي تزخر بثلاث ميزات رائعة: (ط) وفرة الطبيعية في البروتينات منخفضة؛ (ثانيا) خواصه الفيزيائية والكيميائية فريدة من نوعها (مثلاً.، أنها عادة ما تكون أصل المهيمنة fluorescence الجوهرية من الببتيدات والبروتينات)، و (iii) فإنه يساهم في مجموعة متنوعة من التفاعلات الكيميائية الحيوية ووظائف بما في ذلك التراص π، والتفاعلات ح-الترابط والايونات الموجبة π. كل هذه الميزات التي تغيرت تغيرا جذريا عند استبدال 4-الأمينية الراديكالي ← الراديكالي في شك ما بعدها جدفب.، تصميم فئة "الذهب" من أفجفبس مثال رائع لهندسة البروتينات أوتوفلوريسسينت مصممة خصيصا. مع الخواص الطيفية متميزة، يمكن ضبطها في الثانية نحو بعض النوافذ الطيفية عن طريق إدماج الطفرات والرابطة الوطنية لرياضة. في حالة جدفب، يتم ذلك عن طريق بسيطة كيميائية تبادل ح ← NH2 في الإطار الدائري اندول الواردة في ثالوث chromophore اكفب. يعرض الرقم 5 آثار إدراج نكا داخل chromophore. يمكن الأخذ بمجموعة التبرع إلكترون مصدرها 4-أمينو-اندول (إينتراسيلولارلي تحويلها إلى 4-الأمينية الراديكالي) مجموعة متنوعة من الهياكل ميسوميريك التي يمكن أن تفسر حالة متحمس استقرت. سبيكتروسكوبيكالي، الموسع ستوكس التحول وتحول الأحمر الفلورية الانبعاثات نتيجة من هذه الخصائص المميزة لنظام مترافق الموسعة. كما ذكر في وقت سابق، نقل المسؤول إينتراموليكولار المعزز داخل chromophore جدفب أصلاً حساسة لدرجة الحموضة (الشكل 4 باء) ويرافقه تغيير أكبر في لحظة ثنائي القطب بين الأرض0 S و S1 متحمس الدولة بالنسبة إلى اكفب33. كمجموعات بديلة التبرع إلكترون، يمكن استخدام التربتوفان النظير إذ تضع عصابة اندول استبداله مع مجموعات هيدروكسي، حسبما ورد في دراسة مقارنة مع بارستار البروتين نموذج41.
يتم توسيع أطياف الامتصاص والأسفار من جدفب اكفب واجفب بالمقارنة مع (الشكل 3 و دال). توسيع متجانسة من عصابات الامتصاص والأسفار هو عموما الناجم عن وسائط الذبذبات في chromophore، بالإضافة إلى ذلك، اقتران chromophore موجودة في البروتين60الذبذبات وسائط أخرى. اقتران بالبيئة المحلية من البروتين معتمد بواسطة الرسوم المترجمة على chromophore. إينهوموجينيتي الهيكلية من البروتين يؤدي إلى وجود تباينات محلية من الطيف vibronic، مثل اقتران بين أطياف vibronic من chromophore والباقي من البروتين معتمدة بواسطة توطن التهمة والدول ميسوميريك كما هو مبين في الشكل 5. اقتران هذا أيضا يدعم التحول ستوكس كبيرة ويقلل بالضرورة من الغلة الكم الأسفار. بالمقارنة مع غيرها FPs تحول الأحمر، يسلك جدفب حتى البروتين تحسين الاستقرار واتجاهاً منخفضا لتجميع33،،من6162. أنه لا يختلف في اللون من المتغيرات الأخرى تنظيم الأسرة بل أيضا معارض ثبات زيادة كبيرة والتعاونية المعززة للطي33. كثافة الأسفار هي 90 في المائة على الأقل الحفاظ عليها عند التسخين إلى 60 درجة مئوية، بينما fluorescence اكفب ينخفض إلى حوالي 30%. والبروتينات، والأحماض الأمينية العطرية غالباً ما يسهم في شبكات سلاسل الجانب متفاعلة فيما بينها، والذي عادة يكون له تأثير استقرار في هيكل التعليم العالي البروتين. أفجفب تأوي هذه جانب سلسلة شبكة، التي تتألف من chromophore نفسها، بوصفها جيدا كما الفنيل ألانين-165 وله 148 وصور-145. هذه السلاسل الجانبية ليست جامدة تماما في هيكل جدفب33فحسب، ولكن الأهم من ذلك، فإنها تشكل الاتصالات مسعور مع chromophore. أبرز سمة الرواية المحددة في جدفب أن chromophore أميناتيد الدانية أكثر إلى 165 الفنيل ألانين. هذا التفاعل سمة لا تراعي في أفجفبس المعروفة الأخرى. كما بقايا اثنين Å 3.2-4.5 أربا، التفاعلات الأمينية العطرية قد تكون أيضا موجودة. جنبا إلى جنب مع استقرار الرنين التي يسببها amination chromophore، استقرار هذه على الأرجح هذه الشبكة مسعور من الأحماض الأمينية بطريقة تعاونية. قد تكون معتمدة نقل المسؤول إينتراموليكولار أكثر فعالية من هذه التفاعلات في حالة متحمس بالمقارنة مع حالة الأرض chromophore، وأنه يمثل جزئيا على الأقل 108 نيوتن متر ستوكس التحول33،62 .
في التصميم العقلاني من خصائص fluorophore، زيادة في حجم العمل بنظام π الطابع من المتوقع أن يسفر عن موجه إثارة الأحمر تحول. هو إطاعة هذه القاعدة الأساسية من سلسلة الأحماض الأمينية في موقف 66 تفضي إلى صباغات محايدة: الفنيل ألانين (λmax = 355 نانومتر) < له (λاماه x= 386 nm) < صور (λmax = 395 شمال البحر الأبيض المتوسط) < الراديكالي (λmax = 436 نانومتر)63. في طبيعتها، وقد تحقق هذا التمديد لنظام مترافق chromophore π-سندات باستراتيجيات مختلفة. دسريد من سترياتا ديسكوسوما، هي تمدد باندماج الأحماض الأمينية إضافية، وبذلك يتحول λmax إلى 573 نانومتر64. Chromophore asFP595 (λmax = 595 nm) من Anemonia sulcata ومددت جماعة imino، توسيع نظام π في65. منذ chromophore جدفب وأخرى أففبس من نفس الحجم، هو مبدأ مختلفة يجب أن يستتبع الطول موجي انبعاثات في نطاق توسيع دسريد وصباغات asFP595. التحول العميق في ستوكس 108 نانومتر ينسب إلى بنية متميزة chromophore جدفب، الذي يكشف عن مبدأ فوتوفيسيكال جديد في تصميم البروتينات أوتوفلوريسسينت. وأظهرت الحسابات الأولية (كما ورد في 62) أن لحظة ثنائي قطب chromophore الدولة متحمس من جدفب أكبر بكثير مما في حالة الأرض، خلافا لكل قيم اكفب. حين لحظة ثنائي القطب جدفب يزيد من د ~ 3 (ديباي) في الدولة0 S إلى ~ 15 في S1، كان التغيير ل chromophore اكفب معتدلة بدلاً من ذلك (من د ~ 4 ~ 6 د). وهكذا، بسبب الأسفار ذهبية فريدة من نوعها من جدفب نقل المسؤول إينتراموليكولار كبيرة داخل chromophore، مما يزيد من مجموعة متنوعة الهياكل ميسوميريك الممكنة (انظر الشكل 5) التي تسمح لاستقرار الرنين. وهذا يقلل من مستوى الطاقة التي تحدث الانبعاثات. نتيجة لتغيير عميق في هذه اللحظة ثنائي القطب عند الإثارة، هو فصل تهمة إينتراموليكولار السبب الرئيسي للتغييرات في إمكانات البيئة chromophore الالكتروستاتيكي. يضبط مصفوفة البروتين المحيطة بها، بدوره، إلى التغييرات في توزيع الاتهام بعد الإثارة chromophore. تخفيف الهيكلية اللاحقة يخفض مستوى الطاقة chromophore متحمس، الذي يتحول الطيف الأسفار إلى اللون الأحمر بسبب طابعها نقل المسؤول. لنفس السبب، نتيجة كبيرة ستوكس التحول وزيادة معدلات رادياتيونلس العمليات، العائد الكم الأسفار من جدفب ينخفض بالمقارنة مع اكفب33.
الكم عالية الغلة وتحول ستوكس الصغيرة اكفب واجفب وعادة ما تعزى إلى بيئة بروتين جامدة من chromophore، مما يقلل من درجات الحرية، ومن ثم التحويل الداخلي لصالح تخفيف التأثير الإشعاعي للدولة متحمس 66-ونتيجة لذلك، قد التصميم الجزيئي من صباغات أكثر صرامة المضمنة مع اقتران مخفضة لمصفوفة البروتين المتبقية بمثابة دليل لإنتاج أبعد المشتقات بروتينات فلورية خضراء تحول الأحمر مع الكم الفلورية عالية الغلة. ولذلك، للهندسة النهج لإنتاج البروتينات تحول الأحمر أوتوفلوريسسينت، وكذلك توسيع نظام π-إلكترون وبنية chromophore جامدة مع ضعف اقتران للبيئة البروتين مرغوب فيه للغاية. يمكن أيضا إدخال مثل هذه التعديلات أما مباشرة إلى صباغات القائم على التجارة والنقل أو التنسيب من ncAAs المطلوب في المنطقة المجاورة chromophore.

ومنذ اكتشاف البروتين الفلورية الخضراء في قنديل البحر فيكتوريا أيكووريا (أفجفب) في عام 19621 والتعبير مغايرة الأول في عام 19942 في الخلايا حقيقية النواة الأخرى، أصبحت البروتينات الفلورية الأسرة التجارة والنقل أدوات قيمة للغاية والأهداف في علوم الحياة. الهندسة الوراثية والجزيئية واسعة النطاق شملت تعديل الاستخدام كودون إبلاغها، وتسارع قابلة للطي، نضوج المحسنة، وزيادة السطوع، والوقاية أوليجوميريزيشن والخياطة للخواص الطيفية والكيميائية الضوئية بما في ذلك القدرة على شكل قابل للعكس فوتوسويتش3،4،،من56. بروتينات فلورية خضراء مدين الأسفار من به 4-(فهيدروكسيبينزيليديني) chromophore إيميدازوليدين-5-واحد (HBDI). هذا الأخير أوتوكاتاليتيكالي يتكون من ثالوث chromophore ما يسمى الأحماض الأمينية (Ser-65/صور-66/الغليسين-67، في أفجفب) بعد تشكيل السندات تساهمية إضافية داخل العمود الفقري الببتيد تحت تأثير الأكسجين الجزيئي7. ويتفاعل نظام مترافق تنقل استقرت بشكل حيوي مع بيئتها الجزيئية، مما يسمح بالاستيعاب في النطاق المرئي والفلورية الخضراء المميزة لهذه البروتينات.
ضمن ثالوث chromophore، وجود الأحماض الأمينية العطرية إلزامية. ومع ذلك، تضم مرجع قياسي من الأحماض الأمينية سوى أربعة بقايا العطرية (له الفنيل ألانين والراديكالي وصور). ويحد هذا النهج الطفرات التقليدية لتحقيق متغيرات أفجفب تحول الأحمر أكبر بكثير بالنسبة FPs الطبيعية الأكثر تحول الأحمر مثل دسريد8 من كوراليمورفس سترياتا ديسكوسوما أو مكتي/منيبتوني9 من شقار البحر كوادريكولور انتاكمايا. ولذلك، الجزء استعملنا والقريبة من الأشعة تحت الحمراء من الطيف البصري أعلاه 600 نانومتر قليلة مغطى بمتغيرات التجارة والنقل. وهذا، بطبيعة الحال، وجود قيود شديدة للنهج مجهرية الأسفار التي تتطلب demultiplexing الطيفية للعديد من أنواع فلوروفوري في نفس الوقت. على سبيل المثال، علامات الطول الموجي الطويل ضرورية أيضا لجعل استخدام نظام امتصاص منخفضة لانسجة الجلد بين 700-1,000 شمال البحر الأبيض المتوسط في الإعدادات للأنسجة العميقة التصوير10.
الفلورسنت البروتينات المشتقة من أفجفب تنقسم إلى عدة فئات على أساس الخصائص الطيفية وطبيعة المواد الكيميائية على صباغات11. مع ثالوث Ser-65/صور-66/الغليسين-67، chromophore البرية من نوع موجود مزيج متوازن بين شكل محايد، الفينولية (λmax = 395 شمال البحر الأبيض المتوسط، واليورو = 21,000 M-1سم-1) ونموذج فينولاتي أنيونى (λmax = 475 شمال البحر الأبيض المتوسط، واليورو = 7,100 م -1سم-1)، وانبعاث الطيف المعارض ذروة واحدة في 508 nm. مجموعة الهيدروكسيل Ser-65 يكتسي أهمية حاسمة، كما أنها تتبرع في ح-سندات لغلو-222 في المنطقة المجاورة chromophore (المسافة: 3.7 Å)، الذي يعزز التأين لهذه كاربوكسيلات. فئة أنا تتميز chromophore أنيونى فينولاتي، كما هو الحال في اجفب (Phe-64-لوي/Ser-65-Thr؛ λmax = 488 نانومتر، واليورو = 35,600 M-1سم-1، λم = 509 نانومتر). سبب استبدال Ser-65-Thr(Ala,Gly)، تم منعها في ذروة الإثارة نانومتر 395 النموذج الفينول محايدة وذروة فينولاتي أنيونى نانومتر 470-475 الخمس إلى الست إضعاف المحسن وتحول إلى 490 نانومتر. وتضم الفئة الثانية البروتينات مع chromophore الفينولية محايدة، كما هو الحال في ياقوت-التجارة والنقل. هنا، يمنع استبدال Thr-203-إيل تماما تقريبا الإثارة نانومتر 475، تاركاً فقط الذروة في 399 نانومتر. Chromophore أنيونى لا يمكن أن يكون بشكل صحيح ومذاوبة، وهو يفضل شكله محايد. وتضم الفئة الثالثة المتغيرات فلوري "الأصفر" (ايفب؛ Ser-65-Gly/Val-68-Leu/Ser-72-Ala/Thr-203-Tyr؛ اليوروماكس λ = 514 شمال البحر الأبيض المتوسط، واليورو = 84، 600 متر-1سم-1، λم = 527 nm) مع تفاعل التراص π سلسلة جانبية عطرية وفينولاتي، كما أحدثت باستبدال Thr-203-His(Trp,Phe,Tyr)، مما يؤدي إلى مدة تصل إلى 20 nm تحول الأحمر الانبعاثات ماكسيما (Thr-203-صور). نتائج بدائل أخرى (جلن-69-Lys) في آخر 1-2 نانومتر الأحمر تحول إلى 529 شمال البحر الأبيض المتوسط، والبديل أفجفب أهم تحول الأحمر المعروف11. تبادل الفينول اندول (صور--66--الحزب) ينشئ الفئة الرابعة، كما هو الحال في اكفب سماوي-فلوري (Ser-65-Thr/صور-66-الراديكالي؛ λmax1 = 434 نانومتر، واليورو = 24,800 م-1سم-1; λmax2 = 452 شمال البحر الأبيض المتوسط، واليورو = 23,600 M-1سم-1 ; Λem1 = 477 nm, λem2 = 504 نيوتن متر). ربما يتم تمكين إيواء اندول ضخمة بالأخرى، الطفرات تعويضية. ماكسيما الإثارة والانبعاثات اكفب تقع في المنتصف تلك البروتينات مع صباغات محايدة أو أنيونى. الفئة V البروتينات المرفأ ايميدازول بدلاً من الفينول (صور--66-صاحب)، على سبيل المثال.، مثل البروتينات الفلورية الزرقاء ابفب. الفئة السادسة ينتجها تبادل الفينول إلى فينيل تحابي النموذج chromophore محايدة حصرا، وبالتالي يؤدي إلى مواقف الذروة أهم تحول الأزرق الإثارة والانبعاثات (360 نانومتر و 442 شمال البحر الأبيض المتوسط، على التوالي).
الكلاسيكية الطفرات الموجهة من الموقع مناسبة خاصة لإنتاج أفجفب رواية chromophore المتغيرات، حسب التقليب تريبيبتيدي 65-67 وبقايا المتفاعلة في الإطار من 20 الأحماض الأمينية المتعارف عليه. ويمكن توسيع هذه الإمكانيات كذلك عندما يتم إدخال المتغيرات غير المقبول من الأحماض الأمينية العطرية أثناء توليف البروتين ريبوسومال12. من حيث المبدأ، هناك طريقتان لتحقيق ذلك. أول استراتيجية تعتمد على التسامح الركازة إليه ترجمة البروتين، وبخاصة سينثيتاسيس أمينواسيل-الحمض الريبي النووي النقال (آرس) نحو النظير الأحماض الأمينية ذات الصلة. لتحقيق هذا الهدف بكفاءة عالية، أوكسوتروفيك كولاي التعبير سلالات العاملين التي غير قادر على تجميع الأحماض الأمينية الطبيعية المقابلة. يسمح هذا استبدال هذا الأخير بإضافة الأحماض الأمينية غير قانوني مناسب (ncAAs) أو السلائف منه إلى متوسط الثقافة. تمكن هذه الاستراتيجية، المعروف أيضا إدماج الضغط الانتقائي (SPI)13،14، الاستبدال الخاصة بالمخلفات، مما يسفر عن الإدماج الشامل للرابطة الوطنية لرياضة. الاستراتيجية الثانية يستخدم كودون وقف ترناس القامع الذي يتوجب مع الرابطة الوطنية لرياضة بهندسة الإنزيمات aaRS. هذا يؤدي إلى ريدثرو codons أوقفوا في إطار ويسمح الموقع نكا التأسيس. ونتيجة لذلك، وهذا الأسلوب من قمع كودون التوقف (المنبوذة) يؤدي إلى التوسع في الشفرة الجينية15. عن طريق الطفرات، يوضع كودون توقف في الجينات المستهدفة في الموقع المطلوب. من حيث المبدأ، يمكن أيضا استخدام SPI لإنشاء المؤتلف الببتيدات والبروتينات التي تحمل على تثبيت الرابطة الوطنية لرياضة فريدة من نوعها، نظراً إلى أن يتم اختيار الأحماض الأمينية الكنسي نادرة مثل Met أو الراديكالي لاستبدال. مع الحزب، أظهرت النهج SPI للعمل مع مجموعة كبيرة ومتنوعة من النظير بما في ذلك 4--و--و 5-الراديكالي و و 6 و، 7-عزة-الحزب، الحزب 4-OH و 5 أوه، فضلا عن 4-و 5-NH2-الحزب أو حتى بيتا (ثينوبيروليل) ألانين المشتقات16 ،،من1718،،من1920. وهكذا، يمكن أن يكون SPI مفيد جداً لاستبدال الأحماض الأمينية العطرية من صباغات بروتينات فلورية خضراء بالمتغيرات غير المقبول لاستكشاف إمكانية مواصلة تكييف الأطياف وتحول ستوكس هذه إطارا في الثانية. أما بالنسبة لجميع التعديلات تسلسل البروتين، يجب اختبار التوافق مع نضوج قابلة للطي و chromophore FP تجريبيا.
في هذا العمل، فنحن نستخدم فئة اكفب الرابع21، الذي يحمل بدلاً من أفجفب البرية من نوع طير، بقايا الحزب داخل الثالوث chromophore به. استخدام SPI، هذا الحزب-66 (والحزب-57، فقط الأخرى الراديكالي بقايا في اكفب) يتم استبدال بواسطة 4-أمينو-الحزب الراديكالي عبر الوطني تفضل وجود المجموعة الأمينية التبرع إلكترون 4-أمينو-الحزب داخل chromophore استقرار الرنين نقل بروتون الدولة متحمس الآن تحول الأحمر (إيست) وهبوا تحولاً ستوكس 108 في شمال البحر الأبيض المتوسط. هذا البروتين فلوري "الذهب" (جدفب) ويشكل البديل مع التحول الأحمر أكبر من الأسفار كحد أقصى (574 nm) بين جميع البروتينات المشتقة من أفجفب. ونحن تصف طريقة إنتاج البروتين جدفب من SPI وتوفر البروتوكولات للتحليل الإلزامي للبروتينات المعدلة الناتجة بالتحليل الطيفي الشامل. علاوة على ذلك، نعرض كيف يمكن الاستفادة من جدفب وتحليلها في نهج التحليل الطيفي حل وقت الأسفار.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminoindole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>525022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colloidal silica</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Ludox HS-40, 420816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amino acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter with PVDF membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>Protino series, 745410.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID:&#160;32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein extraction reagent BugBuster</td>
			<td>EMB Millipore</td>
			<td>70921-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trp-auxotrophic E. coli strain</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC 49980</td>
			<td>Bridges BA et al., Chem Biol Interact., 1972, 5(2):77-84; see main text for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometry equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td>coupled with Infinity LC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump for LC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectroscopy equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ps-pulsed laser 470 nm</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>PDL-470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>time- and wavelength-correlated single photon counting (TWSPC) acquisition software</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>SymPhoTime 64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>time- and wavelength-correlated single photon counting (TWSPC) detector</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>PML-16C</td>
			<td>16 spectral channels, to be selected by grating settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single photon counting software</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>SPCM 9.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>global fitting software</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>SPC2Glo(R)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence decay data analysis software</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>FluoFit program</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>OriginLab Inc.</td>
			<td>Origin 9.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral density filter set</td>
			<td>Schott</td>
			<td>NG1 to NG11</td>
			<td>(400 - 650 nm, transmission 50 %, 20%, 10 %, 5 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm long-pass emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>AHF-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quartz cuvette</td>
			<td>Thorlabs GmbH</td>
			<td>CV10Q1400</td>
			<td>1 cm pathlength</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering 'golden' fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence

البروتينات الفلورية هي الأدوات الأساسية لعلوم الحياة، وبخاصة للأسفار الفحص المجهري للخلايا الحية. بينما المتغيرات البرية من نوع وهندسة البروتينات الفلورية الخضراء من فيكتوريا أيقووريا (أفجفب)، فضلا عن هومولوجس من الأنواع الأخرى تغطي بالفعل أجزاء كبيرة من الطيف البصري، طيفية لا تزال هناك فجوة في المنطقة القريبة من الأشعة تحت الحمراء، عن لا تتوفر فيها فلوروفوريس على أساس أفجفب. المتغيرات تحول الأحمر نيون البروتين (FP) سوف توسع إلى حد كبير مجموعة الأدوات اتقانا طيفية متعددة الأنواع الجزيئية، ولكن FPs تحول الأحمر طبيعيا المستمدة من الشعاب المرجانية أو شقائق النعمان البحرية قد انخفاض الغلة الكم الأسفار و أدنى صور-الاستقرار مقارنة بالمتغيرات أفجفب. مواصلة التلاعب وإمكانية توسيع نظام مترافق chromophore اتجاه المنطقة الطيفية استعملنا أيضا محدود بمرجع 20 الأحماض الأمينية الكنسي المنصوص عليها في الشفرة الجينية. للتغلب على هذه القيود، يمكن تحقيق البيولوجيا التركيبية كذلك الطيفية الأحمر-التحول عن طريق إدخال الأحماض الأمينية غير متعارف عليه في ثالوث chromophore. يصف لنا تطبيق SPI للمتغيرات أفجفب مهندس مع رواية الخواص الطيفية. يتم التعبير البروتين في التربتوفان أوكسوتروفيك كولاي سلالة وتكملة وسائط النمو مع السلائف اندول مناسبة. داخل الخلايا، يتم تحويلها إلى النظير التربتوفان المقابلة هذه السلائف ودمج البروتينات بالآلات ريبوسومال ردا على UGG codons. استبدال الحزب-66 في الخيار "السماوي" المعززة أفجفب (اكفب) التبرع بالكترون 4 أمينوتريبتوفان بالنتائج في جدفب يضم تحولاً ستوكس نانومتر 108 وانبعاثات بشدة تحول الأحمر الحد أقصى (574 nm)، بينما يجري [ثرمودنميكلي] أكثر استقرارا من سابقتها اكفب. ويتم تحليل التأسيس الخاصة بالمخلفات من الأحماض الأمينية غير متعارف عليه من الطيف الكتلي. الخصائص الطيفية جدفب تتسم بالتحليل الطيفي fluorescence حل الوقت كأحد التطبيقات القيمة المرمزة وراثيا إطارا في الثانية في علوم الحياة.

Watch this Scientific Journal Video about Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence 

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

البيولوجيا التركيبية تمكن هندسة البروتينات مع خصائص لم يسبق لها مثيل باستخدام الإدراج كوترانسلاشونال من الأحماض الأمينية غير متعارف عليه. هنا، وقد عرضنا كيف يتم إنتاج البديل طيفيا الأحمر تحول من فلوروفوري من نوع التجارة والنقل مع الخصائص الطيفية الفلورية الرواية، يطلق عليه "الذهب" الفلورسنت البروتين (جدفب)، في كولاي عن طريق إدماج الضغط الانتقائي (SPI).

هندسة Fluorescence 'الذهبي' بإدراج الضغط الانتقائي من الأحماض الأمينية غير المقبول وتحليل البروتين الكتلي والأسفار

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

الديناميكا الحرارية من البروتين للطي غشاء المقاسة بواسطة التحليل الطيفي الإسفار

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

طرق الكشف عن منصات مضان الحبرية ميكروفلويديك

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

التصوير من الأنسجة البيولوجية بواسطة الامتزاز Electrospray التأين الطيف الكتلي

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

عالية الدقة تحليل الزمانية المكانية من مستقبلات حيوية من قبل جزيء واحدة الإسفار الميكروسكوب

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

من السريع إلى التصوير الإسفار الجزيئية قانون إنتشار على أغشية الخلايا الحية في المجهر التجاري

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

إنتاج الهامستر السوري الذهبي المهندسة وراثيا عن طريق الحقن برونوكلير من مجمع كريسبر/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

تقييم الكولاجين والايلاستين ميكروارتشيتيكتوريس تعتمد على الضغط في الشرايين المقاومة البشرية، والعيش بالفحص المجهري Fluorescence تسمية خالية

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

مضادات الميكروبات الببتيدات ينتجها إدماج الضغط الانتقائي من الأحماض الأمينية غير متعارف عليه

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

كشف الذيفان في تركيبات النانو باستخدام فحوصات ليستي (ال) أموبوسيتي ليمولوس

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...