Name: engineering 'golden' fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence
Uploaded: 2018-04-27T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

यह काम जर्मन रिसर्च फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था (उत्कृष्टता के क्लस्टर "Catalysis में अवधारणाओं को एकीकृत) T.F. और N.B. के लिए और संघीय शिक्षा और विज्ञान मंत्रालय के द्वारा (BMBF कार्यक्रम" HSP २०२० ", टू-WIMIplus परियोजना SynTUBio) को एफ.-J.S.

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

के बाद से जेलिफ़िश Aequorea विक्टोरिया (avGFP) में १९६२1 में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन की खोज और अंय eukaryotic कोशिकाओं में १९९४2 में पहली heterologous अभिव्यक्ति, GFP परिवार के फ्लोरोसेंट प्रोटीन बन गए है जीवन विज्ञान में अत्यधिक मूल्यवान उपकरण और लक्ष्य । व्यापक आनुवंशिक और आणविक इंजीनियरिंग प्रजातियों के समायोजन-विशिष्ट codon उपयोग, तह का त्वरण, बेहतर परिपक्वता, वृद्धि की चमक, oligomerization की रोकथाम और वर्णक्रमीय और photochemical गुणों की सिलाई शामिल जिसमें reversibly photoswitch3,4,5,6की क्षमता शामिल है । GFP अपने 4-(p-hydroxybenzylidene) imidazolidin-5-एक (HBDI) chromophore से अपनी प्रतिदीप्ति बकाया है । बाद के तथाकथित chromophore एमिनो एसिड के त्रय (Ser-65/Tyr-66/Gly-67 से avGFP में) के गठन के बाद पेप्टाइड रीढ़ की एक अतिरिक्त आबंध बॉण्ड के निर्माण के तहत आणविक ऑक्सीजन के प्रभाव के तहत7। resonantly स्थिर संयुग्मित प्रणाली अपने आणविक वातावरण के साथ गतिशील रूप से सूचना का आदान प्रदान, दिखाई रेंज और इन प्रोटीन की विशेषता हरी प्रतिदीप्ति में अवशोषण के लिए अनुमति देता है ।
chromophore त्रय के भीतर, एक खुशबूदार एमिनो एसिड की उपस्थिति अनिवार्य है । हालांकि, मानक अमीनो एसिड की प्रदर्शनियां केवल चार खुशबूदार अवशेषों (उसकी, Phe, टीआरपी और Tyr) शामिल हैं । यह पारंपरिक mutagenesis के दृष्टिकोण को काफी अधिक लाल-avGFP वेरिएंट को प्राप्त करने की सीमा सबसे लाल के सापेक्ष स्थानांतरित प्राकृतिक एफपीएस जैसे DsRed8 से Discosoma striata coralimorphs या mKate/mNeptune से9 समुद्र एनेमोन Entacmaea quadricolor. इसलिए, ६०० एनएम के ऊपर ऑप्टिकल स्पेक्ट्रम का सुदूर लाल और निकट-अवरक्त भाग विरल GFP वेरिएंट द्वारा कवर किया जाता है । यह, ज़ाहिर है, प्रतिदीप्ति सूक्ष्म दृष्टिकोण है कि एक ही समय में कई fluorophore प्रजातियों के वर्णक्रमीय मल्टीप्लेक्स की आवश्यकता के लिए एक गंभीर सीमा है । उदाहरण के लिए, लंबी तरंग दैर्ध्य मार्करों भी गहरी ऊतक इमेजिंग10के लिए सेटिंग्स में 700-1000 एनएम के बीच त्वचा ऊतक के कम अवशोषण शासन का उपयोग करने के लिए आवश्यक हैं ।
फ्लोरोसेंट प्रोटीन avGFP से व्युत्पंन स्पेक्ट्रोस्कोपी गुण और उनके chromophores11के रासायनिक प्रकृति के आधार पर कई वर्गों में विभाजित हैं । इसके त्रय Ser के साथ-65/Tyr-66/Gly-67, वाइल्ड-टाइप chromophore के बीच एक equilibrated मिश्रण के रूप में मौजूद है न्यूट्रल, phenolic फॉर्म (λmax = ३९५ एनएम, ε = २१,००० मीटर-1सेमी-1) और anionic phenolate फॉर्म (λmax = ४७५ एनएम, ε = ७,१०० मीटर -1cm-1), और उत्सर्जन स्पेक्ट्रम ५०८ एनएम पर एक एकल चोटी का प्रदर्शन । Ser के हाइड्रॉक्सिल समूह-६५ महत्वपूर्ण महत्व का है, क्योंकि यह chromophore आसपास के क्षेत्र में एक एच बांड Glu-२२२ (दूरी: ३.७ Å), जो इस ionization के carboxylate को बढ़ावा देता है दान । वर्ग मैं एक anionic phenolate chromophore की विशेषता है, के रूप में EGFP में (Phe-64-लियू/Ser-65-के. λमैक्स = ४८८ एनएम, ε = ३५,६०० एम-1सेमी-1, λem = ५०९ एनएम) । Ser के कारण-६५--(ाला, Gly) प्रतिस्थापन, तटस्थ phenol फार्म के ३९५ एनएम उत्तेजना चोटी दबा दिया है और anionic phenolate के 470-475 एनएम चोटी पांच से छह गुना बढ़ाया है और ४९० एनएम के लिए स्थानांतरित कर दिया । द्वितीय श्रेणी में एक तटस्थ phenolic chromophore के साथ प्रोटीन शामिल हैं, के रूप में नीलमणि-GFP में । यहां, एक-२०३-इले प्रतिस्थापन लगभग पूरी तरह से ४७५ एनएम उत्तेजना को दबा, केवल चोटी छोड़ने ३९९ एनएम । चूँकि anionic chromophore ठीक से solvated नहीं हो सकता, इसलिए उसका तटस्थ रूप इष्ट है. कक्षा III "पीला" फ्लोरोसेंट वेरिएंट EYFP (शामिल हैं; Ser-65-Gly/वैल-68-लियू/Ser-72-ाला/-203-Tyr; λmax ε = ५१४ एनएम, ε = 84600 M-1cm-1, λ = ५२७ एनएम) एक खुशबूदार पक्ष श्रृंखला और phenolate, के रूप में के बारे में π-stacking बातचीत के साथ-२०३-अपने (टीआरपी, Phe, Tyr) प्रतिस्थापन, जो अप करने के लिए नेतृत्व 20 एनएम लाल-स्थानांतरित उत्सर्जन maxima (-२०३-Tyr) । इसके अलावा प्रतिस्थापन (Gln-६९-Lys) एक और 1-2 एनएम लाल पाली में परिणाम ५२९ एनएम, सबसे लाल खिसक avGFP संस्करण जाना जाता है11। एक इण्डोल (Tyr-६६-टीआरपी) के लिए phenol के आदान-प्रदान वर्ग चतुर्थ बनाता है, के रूप में सियान-फ्लोरोसेंट ECFP (Ser-65-Tyr/λmax1 = ४३४ एनएम, ε = २४,८०० मीटर-1सेमी-1; λmax2 = ४५२ एनएम, ε = २३,६०० एम-1सेमी-1 ; λem1 = ४७७ एनएम, λem2 = ५०४ एनएम) । भारी इण्डोल के आवास शायद अंय द्वारा सक्षम है, क्षतिपूरक उत्परिवर्तनों । ECFP उत्तेजना और उत्सर्जन maxima तटस्थ या anionic chromophores के साथ प्रोटीन के उन लोगों के बीच गिर जाते हैं । कक्षा V प्रोटीन phenol के स्थान पर एक imidazole बंदरगाह (Tyr-६६-अपने), जैसे, EBFP की तरह नीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन । छठी कक्षा एक phenol-फिनाइल एक्सचेंज द्वारा तटस्थ chromophore फार्म का विशेष रूप से एहसान, जो फलस्वरूप सबसे अधिक नीला-स्थानांतरित उत्तेजना और उत्सर्जन चोटी पदों (३६० एनएम और ४४२ एनएम, क्रमशः) की ओर जाता है द्वारा उत्पादित है ।
शास्त्रीय साइट निर्देशित mutagenesis उपंयास avGFP chromophore वेरिएंट के उत्पादन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है, 65-67 tripeptide के परिवर्तन और 20 विहित अमीनो एसिड के फ्रेम में अवशेषों बातचीत से । इन संभावनाओं को और अधिक विस्तार किया जा सकता है जब गैर-विहित वेरिएंट खुशबूदार अमीनो एसिड के दौरान पेश कर रहे हैं राइबोसोमल प्रोटीन संश्लेषण12. सिद्धांत रूप में, वहां दो तरीके से यह पूरा कर रहे हैं । पहली रणनीति प्रोटीन अनुवाद मशीनरी के सब्सट्रेट सहिष्णुता पर निर्भर करता है, विशेष रूप से संबंधित एमिनो एसिड अनुरूप के प्रति aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs). उच्च दक्षता के साथ इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, auxotrophic ई. कोलाई अभिव्यक्ति उपभेदों कार्यरत है कि इसी प्राकृतिक एमिनो एसिड संश्लेषित करने में असमर्थ हैं । यह उपयुक्त गैर विहित अमीनो एसिड (ncaas) या संस्कृति माध्यम के लिए उसके पूर्ववर्ती जोड़कर बाद के प्रतिस्थापन की अनुमति देता है । इस रणनीति को भी चयनात्मक दबाव निगमन (SPI)13,14के रूप में जाना जाता है, अवशेषों विशिष्ट प्रतिस्थापन, जो ncAA के वैश्विक निगमन में परिणाम में सक्षम बनाता है । दूसरी रणनीति बंद codon शमन tRNAs जो इंजीनियर aaRS एंजाइमों द्वारा ncAA के साथ आरोप लगाया जाता है का उपयोग करता है । के readthrough में यह परिणाम में फ्रेम codons बंद करो और अनुमति देता है साइट विशेष ncAA शामिल । नतीजतन, stop codon दमन (SCS) की इस विधि आनुवंशिक कोड के विस्तार की ओर जाता है15। mutagenesis के माध्यम से, एक बंद codon वांछित साइट पर लक्ष्य जीन में रखा गया है । सिद्धांत रूप में, SPI भी रिकॉमबिनेंट पेप्टाइड्स और एक अद्वितीय ncAA अधिष्ठापन असर प्रोटीन बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, यह देखते हुए कि दुर्लभ विहित अमीनो एसिड के रूप में मिले या टीआरपी प्रतिस्थापन के लिए चुना जाता है । Trp के साथ, SPI दृष्टिकोण 4-F सहित एनालॉग की एक बड़ी विविधता के साथ काम करने के लिए दिखाया गया है, 5-एफ-और 6-एफ-टीआरपी, 7-aza-टीआरपी, 4-oh-और 5-oh-टीआरपी, साथ ही 4-, और 5-NH2-टीआरपी या सम β (thienopyrrolyl) alanine डेरिवेटिव्स16 ,17,18,19,20. इस प्रकार, SPI गैर द्वारा GFP chromophores के खुशबूदार अमीनो एसिड की जगह के लिए अत्यधिक लाभप्रद हो सकता है-विहित वेरिएंट आगे दर्जी स्पेक्ट्रा और स्टोक्स इन एफपीएस बदलाव की संभावना का पता लगाने के लिए । सभी प्रोटीन अनुक्रम संशोधनों के लिए के रूप में, FP तह और chromophore परिपक्वता के साथ संगतता प्रयोग परीक्षण किया जाना चाहिए ।
इस काम में, हम वर्ग चतुर्थ ECFP21, जो जंगली प्रकार avGFP Tyr, इसके chromophore त्रय के भीतर एक टीआरपी अवशेषों के बजाय वहन करती है का उपयोग । SPI का प्रयोग, इस टीआरपी-६६ (और टीआरपी-५७, ECFP में ही अंय टीआरपी अवशेषों) 4 द्वारा प्रतिस्थापित-अमीनो-टीआरपी है । इलेक्ट्रॉन की उपस्थिति-4-अमीनो-chromophore भीतर टीआरपी के एमिनो समूह दान एक दूर लाल स्थानांतरित उत्तेजित राज्य प्रोटॉन स्थानांतरण (ESPT) एक १०८ एनएम स्टोक्स बदलाव के साथ संपंन की प्रतिध्वनि स्थिरीकरण एहसान । इस ' गोल्ड ' फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GdFP) सभी avGFP-व्युत्पंन प्रोटीन के बीच प्रतिदीप्ति अधिकतम (५७४ एनएम) की सबसे बड़ी लाल बदलाव के साथ संस्करण का गठन किया । हम SPI द्वारा GdFP प्रोटीन उत्पादन की विधि का वर्णन है और जन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा परिणामी संशोधित प्रोटीन के अनिवार्य विश्लेषण के लिए प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । इसके अलावा, हम बताएंगे कि कैसे GdFP का उपयोग किया जा सकता है और समय में विश्लेषण-प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी दृष्टिकोण हल ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminoindole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>525022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colloidal silica</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Ludox HS-40, 420816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amino acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter with PVDF membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>Protino series, 745410.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID:&#160;32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein extraction reagent BugBuster</td>
			<td>EMB Millipore</td>
			<td>70921-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trp-auxotrophic E. coli strain</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC 49980</td>
			<td>Bridges BA et al., Chem Biol Interact., 1972, 5(2):77-84; see main text for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometry equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td>coupled with Infinity LC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump for LC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectroscopy equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ps-pulsed laser 470 nm</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>PDL-470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>time- and wavelength-correlated single photon counting (TWSPC) acquisition software</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>SymPhoTime 64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>time- and wavelength-correlated single photon counting (TWSPC) detector</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>PML-16C</td>
			<td>16 spectral channels, to be selected by grating settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single photon counting software</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>SPCM 9.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>global fitting software</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>SPC2Glo(R)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence decay data analysis software</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>FluoFit program</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>OriginLab Inc.</td>
			<td>Origin 9.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral density filter set</td>
			<td>Schott</td>
			<td>NG1 to NG11</td>
			<td>(400 - 650 nm, transmission 50 %, 20%, 10 %, 5 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm long-pass emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>AHF-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quartz cuvette</td>
			<td>Thorlabs GmbH</td>
			<td>CV10Q1400</td>
			<td>1 cm pathlength</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering 'golden' fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence

फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीवन विज्ञान के लिए मौलिक उपकरण हैं, विशेष रूप से जीवित कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए । जबकि जंगली प्रकार और Aequorea विक्टोरिया (avGFP) से हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के इंजीनियर वेरिएंट के रूप में अच्छी तरह से अंय प्रजातियों से homologs के रूप में पहले से ही ऑप्टिकल स्पेक्ट्रम के बड़े हिस्से को कवर, एक वर्णक्रमीय अंतर के पास अवरक्त क्षेत्र में रहता है, के लिए जिसमें avGFP आधारित fluorophores उपलब्ध नहीं हैं । लाल-फ्लोरोसेंट प्रोटीन (FP) वेरिएंट काफी एकाधिक आणविक प्रजातियों के वर्णक्रमीय unएनीमोन के लिए toolkit का विस्तार होता है, लेकिन स्वाभाविक रूप से होने वाली लाल-कोरल या समुद्र से व्युत्पंन एफपीएस खिसकाया कम प्रतिदीप्ति क्वांटम उपज है और अवर फोटो-avGFP वेरिएंट की तुलना में स्थिरता । आगे और हेरफेर और chromophore की संयुग्मित प्रणाली के संभव विस्तार दूर लाल वर्णक्रमीय क्षेत्र के लिए भी 20 विहित अमीनो आनुवंशिक कोड द्वारा निर्धारित एसिड की प्रदर्शनियों द्वारा सीमित है । इन सीमाओं को दूर करने के लिए, सिंथेटिक जीव विज्ञान आगे वर्णक्रमीय लाल chromophore त्रय में गैर विहित अमीनो एसिड की प्रविष्टि के माध्यम से स्थानांतरण प्राप्त कर सकते हैं । हम उपंयास वर्णक्रमीय गुणों के साथ इंजीनियर avGFP वेरिएंट के लिए SPI के आवेदन का वर्णन । प्रोटीन अभिव्यक्ति एक tryptophan-auxotrophic ई. कोलाई तनाव में और उपयुक्त इण्डोल पुरोगामी के साथ विकास के मीडिया का सप्लीमेंट द्वारा किया जाता है । कोशिकाओं के अंदर, इन अग्रदूतों इसी tryptophan अनुरूप करने के लिए परिवर्तित कर रहे है और UGG codons के जवाब में राइबोसोमल मशीनरी द्वारा प्रोटीन में शामिल किया । टीआरपी के प्रतिस्थापन-६६ में बढ़ाया "सियान" avGFP के संस्करण (ECFP) एक इलेक्ट्रॉन द्वारा 4-aminotryptophan GdFP में परिणाम एक १०८ एनएम स्टोक्स पारी और एक जोरदार लाल स्थानांतरित उत्सर्जन अधिकतम (५७४ एनएम) की विशेषता है, जबकि जा रहा है से अधिक स्थिर इसके पूर्ववर्ती ECFP. अवशेष-गैर विहित एमिनो एसिड के विशिष्ट शामिल जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा विश्लेषण किया है । GdFP के स्पेक्ट्रोस्कोपी गुण समय-हल प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी जीवन विज्ञान में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग एफपीएस के मूल्यवान अनुप्रयोगों में से एक के रूप में की विशेषता है ।

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Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

सिंथेटिक जीव विज्ञान गैर-विहित अमीनो एसिड के सह-शोधों के सम्मिलन का उपयोग कर अभूतपूर्व गुणों के साथ प्रोटीन के इंजीनियरिंग सक्षम बनाता है. यहां, हम प्रस्तुत कैसे एक वर्णक्रमीय लाल-उपंयास प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी गुणों के साथ एक GFP प्रकार fluorophore के संस्करण स्थानांतरित, "गोल्ड" फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GdFP), शब्द का उत्पादन किया है चयनात्मक दबाव निगमन (SPI) के माध्यम से ई. कोलाई में उत्पादित ।

गैर-विहित अमीनो अम्ल और प्रोटीन विश्लेषण का जन स्पेक्ट्रोमेट्री और प्रतिदीप्ति द्वारा चयनात्मक दबाव निगमन द्वारा इंजीनियरिंग ' गोल्डन ' प्रतिदीप्ति

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

झिल्ली प्रोटीन तह के ऊष्मप्रवैगिकी प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Microfluidic छोटी बूंद प्लेटफार्मों के लिए प्रतिदीप्ति तरीकों का पता लगाने

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

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Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

एकल अणु प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा रिसेप्टर गतिशीलता के उच्च संकल्प Spatiotemporal विश्लेषण

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3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

एक संशोधित दो photon माइक्रोस्कोप में 3 डी कक्षीय ट्रैकिंग: Intracellular vesicles की ट्रैकिंग के लिए एक आवेदन

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

एक वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप में लाइव कोशिका झिल्ली पर आण्विक प्रसार कानून को फास्ट प्रतिदीप्ति इमेजिंग से

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

CRISPR/Cas9 परिसर के परमाणु इंजेक्शन द्वारा आनुवंशिक रूप से इंजीनियर गोल्डन सीरियाई हंसटर का उत्पादन

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

का आकलन कोलेजन और Elastin दबाव पर निर्भर Microarchitectures रहते हैं, मानव प्रतिरोध धमनियों में लेबल से मुक्त प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

गैर-विहित अमीनो एसिड के चुनिंदा दबाव निगमन द्वारा उत्पादित रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

नैनो में Endotoxin का पता लगाने-योगों Limulus Amoebocyte Lysate (लाल) परख का उपयोग

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...