Name: engineering 'golden' fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence
Uploaded: 2018-04-27T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Este trabalho foi financiado pela alemão Research Foundation (Cluster de excelência "unificar conceitos em catálise) T.F. e N.B. e pelo Ministério Federal da educação e da ciência (BMBF programa"HSP 2020", TU-WIMIplus projeto SynTUBio) de F.-J.S.

1. transformação de Trp-auxotróficos Escherichia coli
<ol><li>Transformar quimicamente ou electrocompetent células (50 µ l) de uma estirpe de Trp-auxotróficos Escherichia coli , por exemplo. ATTC 49980 (WP2, mutante, derivada da cepa de Escherichia coli B/R22), com 1 µ l de uma solução aquosa a 1 ng / µ l do plasmídeo de His6-ECFP pQE - 80L usando choque térmico ou eletroporação, respectivamente. Por favor consulte o JoVE ciência educação de banco de dados23,24 para obter detalhes. Nota: O vetor de expressão pQE - 80L His6-ECFP codifica um N-terminal 6 x ECFP com sua tag21 impulsionado por um promotor T5 bacteriano com operador lac. Ele carrega mais um marcador de seleção AmpR e uma origem de replicação do colE1 (a sequência de espinha dorsal pQE - 80L vetor pode ser encontrada em: https://www.qiagen.com/mx/resources/resourcedetail?id=c3b71572-4d82-4671-a79b-96357fe926d1&lang=en & autoSuggest = true). O teórico peso molecular da proteína selvagem-tipo His6-ECFG (após a maturação de cromóforo25) é Da 28303.92. A sequência da proteína alvo traduzido é como segue (sua marca sublinhada, vetor-derivado de sequências em negrito): MRGSHHHHHHGSMVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTWGVQCFSRYPDHMK QHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYISHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGS VQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK.
</li>
	<li>Células transformadas em placas LB-ágar (tabela 1) suplementadas com glicose 10 g/L, 100 ampicilina µ g/mL a placa e incubar as placas a 37 ° C durante a noite.</li>
</ol>2. expressão da proteína recombinante
<ol><li>
Durante a noite cultura de Escherichia coli ATCC 49980 pQE - 80 L His6-ECFP
	<ol>
<li>Prepare-se 5 mL de meio LB (tabela 1; suplementado com glicose 10 g/L, 100 ampicilina µ g/mL) em uma estéril mL 14 cultura poliestireno tubo para crescimento aeróbio e inocular uma colônia isoladamente de uma placa de ágar usando um loop de ponta ou inoculação de pipeta estéril. Nota: Usar colônias de células recém transformadas é recomendado. As placas com colônias bacterianas (da etapa 1.2.) podem ser armazenadas a 4 ° C por vários dias.</li>
		<li>Incube as celulas a 37 ° C em um agitador orbital em 200-250 rpm, durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Expressão do selvagem-tipo ECFP
	<ol>
<li>Inocular 10 mL meio fresco do LB (tabela 1; suplementado com glicose 10 g/L, 100 ampicilina µ g/mL) com 100 µ l da cultura durante a noite em um Erlenmeyer de 100 mL. Incube o frasco a 37 ° C em um agitador orbital a 200 rpm. Nota: Opcionalmente, esta etapa pode ser executada em 10 mL NMM19 suplementado (tabela 1) com 100 µ g/L ampicilina e 0,5 mM L-triptofano (Alternativamente, indol pode ser usado).</li>
		<li>Medir a densidade óptica em 600 nm (OD600) medir preferencialmente a cada 20 min. densidade de células, determinando a extinção em 600 nm (OD600) em um espectrofotômetro utilizando uma cubeta com um comprimento de caminho de 1 cm. sempre realizar uma referência medição usando o meio de cultura correspondente. Dilua as amostras e a misturar as amostras bem para obter um valor de medição de 0,1-0,8 e, em seguida, calcular OD600 usando o fator de diluição. Para obter detalhes, consulte anterior publicação 26.</li>
		<li>Ao atingir um valor de600 OD de 0,5-0,8 (aproximadamente 2-3h após a inoculação), tire amostra "antes da indução" para SDS-PAGE (electroforese do gel de polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio, passo 4).</li>
		<li>Induzir a expressão de proteínas alvo ajustando a cultura líquida de 0,5 mM IPTG (isopropil β-D-1-thiogalactopyranoside, da solução 1 M) e incube-lo a 30 ° C em um agitador orbital a 200 rpm por 4-8 h. Nota: Ciana proteínas fluorescentes são comumente expressos em temperaturas abaixo de 37 ° C27.</li>
		<li>Tome a amostra "após a expressão" para SDS-PAGE (passo 4.).</li>
		<li>Recolher as células bacterianas por centrifugação por 10min a 5.000 x g e 4 ° C.</li>
		<li>Descartar o sobrenadante por decantação e congelar as pelotas de célula a-20 ° C ou -80 ° C até a purificação da proteína alvo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SPI para a produção de GdFP
	<ol>
<li>Inocular 10 mL do meio de NMM19 (tabela 1) suplementado com 100 de µ g/mL ampicilina, 15 triptofano µM e 10 µ l de cultura durante a noite em um Erlenmeyer de 100 mL e incubar o frasco de cultura durante a noite a 30 ° C em um agitador orbital a 200 rpm. Nota: Uma variedade de meios quimicamente definidos para o cultivo de e. coli e SPI está disponível. Além do NMM aqui usado, MOPS médio28, glicose e minerais sais médio29, Davis médio mínimo30, M9 médio mínimo31, ou GMML32 pode ser usado.</li>
		<li>No dia seguinte, medir OD600 cada 30 min até que o valor só muda pelo menos de 0.05 mais 30 min. O valor de platô deve ser aproximadamente 1. Nota: Os desvios de ± 0,3 unidades são aceitáveis. Dependendo da estirpe bacteriana e meio utilizado, a concentração de triptofano inicial (passo. 2.3.1) pode precisar de ajuste.</li>
		<li>Tome a amostra "antes da indução" para SDS-PAGE (passo 4.).</li>
		<li>Recolher as células bacterianas por centrifugação por 10min a 5.000 x g e 4 ° C. Desprezar o sobrenadante por decantação.</li>
		<li>Ressuspender as células em 10 mL de meio de NMM19 com ampicilina 100 de µ g/mL para um Erlenmeyer de 100 mL e adicionar 4-amino-indol para uma concentração final de 1 mM, utilizando solução de reserva de 50 mM. Continue a incubação durante 30 min a 30 ° C em um agitador orbital a 200 rpm. Nota: Esta etapa é recomendada devido a baixa estabilidade química de ampicilina e assegura a absorção celular de 4-amino-indol.</li>
		<li>Induzir a expressão de proteínas alvo pela adição de IPTG para uma concentração final de 0.5 mM com estoque de 1 M e incubar a amostra durante a noite a 30 ° C, em um agitador orbital a 200 rpm. Nota: Ciana proteínas fluorescentes são comumente expressos em temperaturas abaixo de 37 ° C27.</li>
		<li>No dia seguinte, medir OD600.</li>
		<li>Tome a amostra "após a expressão" para SDS-PAGE (passo 4.).</li>
		<li>Recolher as células bacterianas por centrifugação por 10min a 5.000 x g e 4 ° C e descartar o sobrenadante por decantação.</li>
		<li>No caso desse navio não foi usado por centrifugação, transferi o centrifugado em um tubo 50 mL de poliestireno cônico usando uma espátula. Congele o centrifugado a-20 ° C ou -80 ° C até a purificação da proteína alvo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. alvo de purificação de proteínas através de cromatografia de afinidade imobilizada do íon do Metal (IMAC)
<ol><li>
Lise celular bacteriana
	<ol>
<li>Descongele o centrifugado no gelo por 10 a 20 min.</li>
		<li>Resuspenda o pellet de células em um tubo 50 mL de poliestireno cônico usando 5 mL de tampão de ligação gelada (tabela 1) no gelo.</li>
		<li>Adicione 20 µ l de lisozima 50mg/mL, 20 µ l de 1 mg/mL DNase I e 20 µ l de 1 mg/mL RNase r. fechar o tubo, misture suavemente por inversão de 5 vezes e mantê-lo no gelo por 30 min. Nota: O rompimento da pilha parcial ocorre como catalisada pela lisozima.</li>
		<li>Lisar as células por sonorização usando uma ponta de homogeneizador ultra-som usando três ciclos de 3 min em um tubo de 15 mL de poliestireno arrefecido pelo gelo de lama com 2 s de pulso, 4 s de pausa e 45% de amplitude. Nota: Como alternativa, homogeneização de alta pressão pode ser usada, por exemplo., 20 ciclos de 14.000 libras por polegada quadrada. Se necessário, dilua usando vinculação buffer para atingir o volume mínimo do instrumento. Além disso, os reagentes de extracção de proteínas podem ser usados para rompimento da pilha. Ver tabela de materiais para exemplos.</li>
		<li>Centrifugar a amostra por 30 min a 15.000-18.000 x g, 4 ° C.</li>
		<li>Transferi o sobrenadante para um tubo fresco e anote o volume de líquido.</li>
		<li>Filtrar a solução através de um filtro de 0,45 µm seringa utilizando uma seringa de fecho Luer plástica 5ml e um fluoreto de polivinilideno (PVDF) seringa de filtro.</li>
		<li>Leve a amostra "lisada" para SDS-PAGE (passo 4.).</li>
		<li>Resuspenda o pellet de célula detritos em ddH2O (volume igual como ex lisado).</li>
		<li>Leve a amostra "da pelota" para SDS-PAGE (passo 4)..</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Purificação do IMAC
	<ol>
<li>Use um 1ml pré-embalados ou self embalado coluna IMAC FPLC (cromatografia líquida de proteína rápida) de acordo com as instruções do fabricante. Use vinculação buffer (tabela 1) para equilibração coluna, bem como para a etapa de lavagem que segue após o lisado celular foi aplicado à coluna.</li>
		<li>Frações de eluato coletar e piscina com GdFP, que pode ser identificado pela cor dourada luz visível. Nota: Opcionalmente, a proteína do alvo pode ser eluída usando um gradiente linear de imidazol (0-250 mM) usando um sistema automatizado de FPLC.</li>
		<li>Determinar a concentração de proteína usando o valor da literatura para o coeficiente de extinção em 466 nm (ɛ466 nm = 23.700 M-1 cm-1)33 com tampão de eluição como referência. Para obter detalhes sobre o procedimento, por favor consulte a anterior publicação26.</li>
		<li>Eluato"amostra" de SDS-PAGE e utilize 1-10 µ g de proteína por raia em caso de coloração por Coomassie. Nota: Quantidades de amostra SDS podem variar dependendo do método de coloração e tintura sensibilidade.</li>
		<li>Dialize uma alíquota das frações eluído contra diálise buffer ou buffer de MS usando uma membrana com um peso molecular corte (MWCO) de 5.000-10.000. Prepare a membrana de diálise, de acordo com as instruções do fabricante. Dialize uma amostra de 1 mL, três vezes contra 100 mL de tampão pelo menos 2 h. Para obter mais detalhes sobre este procedimento, consulte anterior publicação34.</li>
		<li>Para armazenamento, congelar amostra de proteína no buffer de diálise a-80 ° C. Nota: Alíquotas devem ser estáveis pelo menos 6 meses.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. preparação da amostra SDS-PAGE de extrato de células inteiras de Escherichia coli
<ol><li>Transferir uma suspensão de células, equivalente a 1 mL de OD600 = 1 suspensão (ex. 500 µ l de OD600= 2) em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.</li>
	<li>Recolher as células por centrifugação por 10min a 5000 x g, temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante por pipetagem.</li>
	<li>Adicione 80 µ l de DDQ2O e 20 µ l de SDS 5x carregando buffer de tintura (tabela 1) para o centrifugado e misture por pipetagem.</li>
	<li>Desnature as células por aquecimento a 95 ° C por 5 min em um bloco de banho ou o calor da água. Posteriormente, fixe as amostras à temperatura ambiente.</li>
	<li>Use 10 µ l para manchadas de Coomassie SDS-PAGE de acordo com a anterior publicação35. Nota: Quantidades de amostra SDS podem variar dependendo do método de coloração e tintura sensibilidade.</li>
</ol>5. análise em massa de proteína intacta por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) acoplado ao Electrospray ionização tempo-de-voo espectrometria de massas (LC-ESI-TOF-MS)
Nota: Buffers, configurações e gradiente HPLC podem variar dependendo da coluna de separação e o instrumento utilizado. Ver tabela de materiais para equipamento exemplar.
<ol><li>Determinar a concentração de proteína de uma amostra de diálise contra buffer de MS, como descrito acima (passo 3.2.3.) usando o buffer de MS (veja a tabela dos materiais) como referência.</li>
	<li>Diluir a amostra de proteína a 0,1 mg/mL, usando MS buffer para um volume final de 80 µ l, misturar pipetando cuidado, transferir a solução para um tubo de mostruário de MS com inserção de vidro e fechá-la com um boné. Remova as bolhas de ar, passando rapidamente o frasco.</li>
	<li>Encha um segundo frasco de mostruário sem inserção de vidro (tampão em branco) com 1 mL de tampão de MS.</li>
	<li>Permitir que o instrumento para se aquecer. Realize a calibração de instrumento. Certifique-se que quantidades suficientes de solventes de cromatografia líquida-grau estão disponíveis (> 100 mL).</li>
	<li>Programar um gradiente HPLC de 20min linear de 5% para 80% de reserva um (0,1% ácido fórmico em ddH2O), combinado com o tampão B (0,1% ácido fórmico em acetonitrila).</li>
	<li>Começar a HPLC com um caudal de 0,3 mL/min e esperar até que a pressão de coluna é estável.</li>
	<li>Definir um volume de injeção de mostruário de 5 µ l para o método de LC-ESI-TOF-MS, criar uma lista de trabalho para executar em branco seguido por uma corrida de amostra e atribuir o mostruário correspondente frasco posições. Execute a lista de trabalho.</li>
	<li>Após a conclusão da lista de trabalho, abra o arquivo de dados de exemplo gerado. Selecione um intervalo na trama para deconvolução do íon total atual (TIC) e deconvolute o espectro de MS usando o algoritmo de deconvolução de máxima entropia. Nota: Dependendo das condições experimentais, espécies adicionais podem ocorrer a partir de FP não amadurecidos ou íon tampão adutos.</li>
</ol>6. fluorescência vida medições e espectros de decadência associada (DAS) de GdFP
Nota: Para a instrumentação da espectroscopia de fluorescência tempo-resolvido, consulte a Tabela de materiais para equipamento exemplar. Absorvância, bem como fluorescência de excitação e espectros de emissão de proteínas fluorescentes também podem ser gravados usando espectrofotômetros UV/Vis e fluorescência de laboratório.
<ol><li>
Medição de vida de fluorescência de determinado comprimento de onda de GdFP
	<ol>
<li>Prepare-se 2 mL de uma solução de 1 µM de GdFP por diluição em tampão PBS (tabela 1), em pH 7. Preencha a solução em uma cubeta de quartzo de 1 cm.</li>
		<li>Instalar o ps-470 nm laser pulsado para a excitação da amostra e o filtro de passa-tempo de emissão 488 nm e ajustar o grating do tempo e comprimento de onda-correlacionados fotão único contando detector de36 (TWCSPC) para a aquisição do regime de comprimento de onda de 600 L/mm 500-700 nm.</li>
		<li>Adquira a emissão de fluorescência, a uma taxa de contagem de cerca de 200 x 103 fótons/s até cerca de 103 contagens são acumuladas no máximo de aquisição das curvas de decaimento de fluorescência com fotão contando software.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Medição da resposta instrumental função37 (IRF)
	<ol>
<li>Substitua a cubeta de amostra com uma cubeta de quartzo de 1cm repleta de sílica coloidal de 1 g/L (~ 220 m2/g) em tampão PBS pH 7. Nota: A suspensão de sílica é preparada usando uma suspensão aquosa de 400 g/L.</li>
		<li>Remova 488 nm de emissão de passe longo filtro e inserir cinza filtros para ajustar a taxa de contagem com o detector TWCSPC para abaixo de 100 x 103 contagens/s.</li>
		<li>Ajuste a grelha para a aquisição de 470 fótons nm no canal 8 do detector TWCSPC 16 canais.</li>
		<li>Adquira o IRF até cerca de 10 x 103 contagens são acumuladas na emissão máxima.</li>
		<li>38 programa de encaixe de curvas de decaimento de fluorescência Convert e IRF para arquivos de dados ASCII com global.</li>
		<li>Global de conduta próprio de acordo com um modelo de uma soma de três componentes exponenciais com vidas como parâmetros vinculados.</li>
		<li>Trama do decaimento associado espectros (DAS) como distribuições de amplitude dos componentes individuais da decadência na dependência do comprimento de onda com software de análise de dados.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Para conseguir eficiências de incorporação de ncAA muito alta, o método SPI baseado em auxotrophy baseia-se na utilização de células metabolicamente engenharia, que não são capazes de sintetizar a contraparte natural correspondente do ncAA. Para Escherichia coli, essas estirpes estão prontamente disponíveis. Mesmo a incorporação simultânea de ncAAs múltiplas a mesma proteína é viável usando cepas multiauxotrophic. O modo de resíduos específicos de substituição e o repertório químico sendo restrito à análogos de químicos semelhantes pode ser visto como inconvenientes. Não obstante, um grande número de variantes de proteínas pode ser produzido como o aparelho de tradução bacteriana natural tolera numerosos análogos de aminoácidos. Por exemplo, mais de 50 ncAAs poderia ser incorporadas proteínas usando em vitro tradução, representando cerca de 73% de todos os códons do código genético disponível para redesignação40. Além disso, SPI também pode permitir a rotulagem multissite eficiente do alvo da proteína41. Em princípio, a metodologia SPI não está restrita a Escherichia coli, mas pode trabalhar em qualquer outro host e para cada um dos canônico de 20 aminoácidos, que cepas auxotróficos e meios de cultivo definidos estejam disponíveis. Por exemplo, dois análogos de metionina, azidohomoalanine (Aha) e homopropargylglycine (Hpg), são comercialmente disponíveis e usados para a rotulagem de proteínas e proteomes em diversos organismos. Além disso, Aha pode ser produzido intracelular e posteriormente incorporada a proteína42. Este ncAA é especialmente adequado para opaco conjugações como química clique desenvolvido pelos Tirrel e colegas de trabalho: por exemplo, na planta tecido de Arabidopsis thaliana, Bombyx mori larvas43, Drosophila células44, larval zebrafish45 bem como células de mamíferos incluindo neurônios46, as proteínas podem ser rotuladas com Aha47,48. Da mesma forma, Trp análogos foram incorporados com êxito peptídeos antimicrobianos em cepas de Trp-auxotróficos Lactococcus lactis 49. SPI é também útil para o campo de Xenobiology50,51, que explora alternativas para a composição química básica da vida. Por exemplo, baseado em trabalhos anteriores sobre Escherichia coli52 e b. subtilis53, uma estirpe de e. coli foi desenvolvida recentemente por uma estratégia evolutiva com pressão seletiva para utilizar thienopyrrole em vez de indol, resultando na substituição de todo o proteoma do triptofano por thienopyrrole-alanina no código genético de54. Geralmente, o aminoácido canônico Trp, que é codificada por um único triplet (UGG), apresenta um alvo promissor para a engenharia de proteínas devido as facetas ricas da química do indol, que oferece inúmeras variações de químicas. Recentemente e como uma alternativa para incorporação baseada no SPI, um romance plataforma SCS capaz de incorporar os análogos de Trp site-specifically em hospedeiros bacterianos e eukaryotic tem sido relatado55. Isso amplia ainda mais caixa de ferramentas na vivo engenharia de proteína baseada no ncAA, incluindo a alteração de propriedades espectrais.
Além da utilização de hosts de expressão auxotróficos, o protocolo SPI requer condições estritas de fermentação, tanto em termos de tempo de expressão do alvo e a composição do meio para alcançar alta eficiência de incorporação da ncAA e rendimento de proteína alvo 56. cultivo é realizado com o uso de meios mínimos quimicamente definidos, que contêm essencialmente além sais importantes fontes de nitrogênio (sal de amónio) e carbono (D-glucose), vitaminas e oligoelementos. Embora não seja estritamente necessário na ausência de mais auxotrophies, os restantes aminoácidos (20 -n, se n aminoácidos devem ser substituídos) são comumente adicionados para promover o crescimento bacteriano,57. Durante uma fase inicial de crescimento antes da indução da expressão da proteína-alvo, os n canônico aminoácidos a ser substituído são adicionados em limitar as concentrações. Crescimento celular continua até os alvo aminoácidos essenciais estão esgotados, como experimentalmente, indicado por uma estacionária OD600. Posteriormente, o meio de cultura é substituído pelo meio fresco que falta o aminoácido empobrecido e contém o ncAA em concentrações abundantes. Para a incorporação ribosomal de análogos de triptofano como mostrado neste protocolo, um analógico de indole é alimentado, qual intracelular torna-se convertido para a correspondente derivada de triptofano pelo triptofano sintase58. Em seguida, a expressão da proteína-alvo é induzida. Nesta fase, as células estão perto do final do crescimento logarítmico, como um equilíbrio entre o número total de células e fitness. Como a presença e a incorporação da canonical amino levaria a produção da proteína do selvagem-tipo, é fundamental para garantir que o aminoácido essencial está totalmente esgotado antes da indução. Da mesma forma, é obrigatório examinar a eficiência da incorporação da ncAA a proteína alvo, comumente por espectrometria de massa. Em caso de presença substancial do aminoácido canônico, condições de cultivo precisa ser ajustado, por exemplo, alterando a concentração da amino acid(s) essencial para a fase inicial de crescimento ou a duração do último. No caso de RAA baixa atividade em direção a ncAA, a superexpressão da enzima endógena ou expressão co de um aaRS diferentes, o que é mais ativo em direção a ncAA, pode ser conduzido59.
O aminoácido canônico Trp é dotado de três características notáveis: (i) sua abundância natural nas proteínas é baixa; (ii) suas propriedades biofísicas e químicas são exclusivas (EG., costuma ser a origem dominante da fluorescência intrínseca das proteínas e peptídeos) e (iii) contribui para uma variedade de interações bioquímicas e funções incluindo Empilhamento π, interações H-colagem e cação-π. Todas estas características são mudou radicalmente após a substituição de 4-amino-Trp → Trp em dúvida GdFP... Além, o design de uma classe de "ouro" de avGFPs é um exemplo notável para engenharia Tailor-Made autofluorescent proteínas. Com distintas Propriedades espectrais, FPs pode ser ajustado para certas janelas espectrais através de incorporação de mutagénese e ncAA. Em caso de GdFP, isso é realizado por uma simples troca química H → NH2 no frame do anel indol contido na tríade ECFP cromóforo. A Figura 5 mostra os efeitos de incorporação de ncAA dentro o cromóforo. A introdução do grupo elétron-doando provenientes de 4-amino-indol (intracelular convertido em 4-amino-Trp) permite uma variedade de estruturas mesomérico que pode explicar um estado excitado estabilizado. Espectroscopicamente, seu deslocamento de Stokes alargado e emissão de fluorescência avermelhado resultam essas propriedades distintas do sistema conjugado estendido. Como noticiado anteriormente, a transferência de carga intramolecular reforçada dentro o cromóforo GdFP é inerentemente sensível ao pH (Figura 4B) e acompanhado de uma mudança maior no momento de dipolo entre o terreno de0 S e S1 animado estado em relação à ECFP33. Como alternativos grupos elétron-doar, análogos de triptofano, possuindo um anel indol substituído com grupos hidroxi poderiam ser usados, como relatado em um estudo comparativo com o modelo da proteína barstar41.
Os espectros de absorção e fluorescência de GdFP são ampliou comparado com ECFP e EGFP (Figura 3 e D). Homogênea alargamento das bandas de absorção e fluorescência é causada geralmente por modos vibracionais no cromóforo e, além disso, por atrelar o cromóforo a presente nos anos60, proteína mais vibracional modos. O acoplamento ao ambiente local proteína é suportado por cargas localizadas sobre o cromóforo. A homogeneidade estrutural da proteína leva a variações locais do espectro vibrônico, tal acoplamento entre os espectros vibrónico o cromóforo e o resto da proteína são suportadas pela deslocalização da carga e mesomérico Estados tal como indicado no Figura 5. Este acoplamento também suporta o grande deslocamento de Stokes e necessariamente reduz o rendimento quântico de fluorescência. Em comparação com outros FPs avermelhado, GdFP nem apresenta estabilidade de proteína melhorada e uma baixa tendência para agregação33,61,62. Ele não só difere na cor de outras variantes FP, mas também exibe uma substancialmente maior estabilidade térmica e maior cooperativa dobradura33. Sua intensidade de fluorescência é preservado após aquecimento a 60 ° C, enquanto que a fluorescência ECFP é reduzida para cerca de 30% em pelo menos 90%. Em proteínas, aminoácidos aromáticos, muitas vezes, contribuem para redes de interação cadeias laterais, que geralmente têm um efeito estabilizador na estrutura terciária da proteína. avGFP abriga tal uma lado rede da cadeia, que consiste no cromóforo propriamente dito, como bem como Phe-165, His-148 e Tyr-145. Estas cadeias laterais não são apenas muito rígidas na estrutura de GdFP33, mas importante, eles formam hidrofóbicos contatos com o cromóforo. A característica mais proeminente romance identificada no GdFP que é o cromóforo aminados mais proximal a Phe-165. Essa interação é uma característica não observada em outras avGFPs conhecido. Como os dois resíduos são separados de 3.2-4.5 Å, interações de aminoácidos aromáticos podem estar também presentes. Juntamente com a estabilização de ressonância induzida por aminação do cromóforo, estes provavelmente estabiliza esta rede hidrofóbico de aminoácidos de forma cooperativa. Uma transferência intramolecular de carga mais eficaz pode ser suportada por essas interações no estado excitado em comparação com o estado fundamental do cromóforo, e é pelo menos parcialmente responsável por 108 nm Stokes turno33,62 .
No projeto racional de fluoróforo Propriedades, prevê-se um aumento no tamanho do sistema π deslocalizado para resultar em um comprimento de onda de excitação avermelhado. Esta regra é obedecida pela série de aminoácidos em 66 conduziu posição neutros cromóforos: Phe (λmáx = 355 nm) < dele (λma x= 386 nm) < Tyr (λmáx = 395 nm) < Trp (λmáx = 436 nm)63. Na natureza, esta extensão de sistema conjugado do cromóforo de ligações π foi alcançado por diferentes estratégias. Para DsRed de Discosoma striata, ele é estendido pela integração de um aminoácido adicional, assim mudando o λmáximo para 573 nm64. O cromóforo do asFP595 (λmáx = 595 nm) de Anemonia sulcata estendeu-se por um grupo imino, ampliando seu sistema π65. Desde que o cromóforo de GdFP e outros avFPs é do mesmo tamanho, um princípio diferente deve implicar um comprimento de onda de emissão na faixa do DsRed expandido e asFP595 cromóforos. A profunda mudança de Stokes de 108 nm é atribuída à estrutura distinta do cromóforo do GdFP, o que revela um novo princípio de photophysical no projeto de autofluorescent proteínas. Cálculos preliminares (conforme relatado em 62) têm mostrado que o momento dipolar de cromóforo de GdFP do estado excitado é substancialmente maior do que no estado de terra, em contraste com os respectivos valores da ECFP. Considerando que o momento dipolar de GdFP aumenta a partir D ~ 3 (Debye) no estado de0 S a ~ 15 no. S1, a mudança para o cromóforo ECFP foi bastante moderada (de 4 ~ D a ~ 6 D). Assim, a fluorescência dourada original de GdFP é causada pela transferência de carga intramolecular substancial dentro o cromóforo, que aumenta a variedade de possíveis estruturas mesomérico (ver Figura 5) que permitem a estabilização de ressonância. Isso reduz o nível de energia da qual ocorre emissão. Como consequência da mudança profunda no momento dipolar em cima da excitação, a separação de carga intramolecular é o principal motivo para as mudanças no potencial eletrostático do ambiente cromóforo. A proteína matriz circundante, por sua vez, ajusta-se às mudanças na distribuição carga após a excitação do cromóforo. O subsequente relaxamento estrutural reduz o nível de energia do cromóforo do animado, que desloca o espectro de fluorescência para o vermelho devido a seu caráter de transferência de carga. Pela mesma razão, em consequência da grande deslocamento de Stokes e taxas aprimoradas dos processos radiationless, o rendimento quântico de fluorescência da GdFP é reduzida em comparação a ECFP33.
O rendimento quântico de alta e um pequeno deslocamento de Stokes da ECFP e EGFP são normalmente atribuídas a um ambiente de proteína rígida do cromóforo, que reduz os graus de liberdade e, consequentemente, conversão interna para favorecer o relaxamento radiativo do estado excitado 66. por conseguinte, o design molecular de cromóforos mais rigidamente incorporados com acoplamento reduzido para a matriz de proteínas restantes pode servir como um guia para produzir mais avermelhado derivados GFP com rendimento quântico de fluorescência de alta. Portanto, para novas abordagens para produzir proteínas autofluorescent avermelhado de engenharia, o alargamento do sistema de elétrons π e uma estrutura rígida cromóforo com fraco acoplamento para o ambiente de proteína é altamente desejável. Tais modificações também poderiam ser introduzidas diretamente no GFP-baseado cromóforos ou pela colocação de ncAAs desejado nas proximidades de cromóforo.

Desde a descoberta da proteína verde fluorescente na Medusa Aequorea victoria (avGFP) em 19621 e a primeira expressão heteróloga em 19942 em outras células eucarióticas, tornaram-se proteínas fluorescentes da família GFP ferramentas altamente valiosas e alvos nas ciências da vida. Engenharia genética e molecular extensa incluído o ajuste de uso códon espécie-específicos, aceleração de dobramento maturação melhorada, aumento de brilho, prevenção da oligomerização e alfaiataria de propriedades espectrais e fotoquímicas incluindo a capacidade de forma reversível photoswitch3,4,5,6. GFP deve sua fluorescência do seu 4-(p- hydroxybenzylidene) imidazolidin-5-1 (HBDI) cromóforo. O último autocatalytically formado a partir da Tríade de cromóforo chamados de aminoácidos (Ser-65/Tyr-66/Gly-67 em avGFP) após a formação de uma ligação covalente adicional dentro a espinha dorsal do peptide sob a influência do oxigênio molecular7. O sistema conjugado ressonantemente estabilizado dinamicamente interage com seu ambiente molecular, permitindo a absorção na faixa do visível e fluorescência verde característica destas proteínas.
Dentro da Tríade cromóforo, a presença de um aminoácido aromático é obrigatória. No entanto, o repertório padrão de aminoácido é composto por apenas quatro resíduos aromáticos (dele, Phe, Trp e Tyr). Isso limita a mutagênese convencional abordagens para alcançar substancialmente mais avermelhado avGFP variantes em relação à FPs mais avermelhado natural como DsRed8 de Discosoma striata coralimorphs ou mKate/mNeptune9 de a anêmona Entacmaea quadricolor. Portanto, a porção far-red e infravermelha do espectro óptico acima de 600 nm é escassamente coberto por variantes GFP. Isto é, naturalmente, uma severa limitação para abordagens microscópicas de fluorescência que exigem demultiplexação espectral de várias espécies de fluoróforo ao mesmo tempo. Por exemplo, marcadores de longo comprimento de onda também são necessários para fazer uso do regime de baixa absorção dos tecidos da pele entre 700-1.000 nm em configurações para tecidos mais profundos de imagem10.
Proteínas fluorescentes, derivadas de avGFP são divididas em várias classes com base nas propriedades espectroscópicas e natureza química dos seus cromóforos11. Com sua Tríade 65-EMISSAO SERIE/Tyr/Gly-66-67, o cromóforo do selvagem-tipo existe como uma equilibrada mistura entre a forma neutra, fenólica (λmáx = 395 nm, ε = 21.000 M-1cm-1) e a forma aniônica fenolato (λmáx = 475 nm, ε = 7.100 M -1cm-1), e o espectro de emissão apresenta um único pico no 508 nm. O grupo hidroxila de EMISSAO SERIE-65 é de importância crítica, como que doa uma ligação H-a Glu-222, nas proximidades de cromóforo (distância: 3.7 Å), que promove a ionização deste carboxilato. Classe, que é caracterizada por um cromóforo fenolato aniônicos, como em EGFP (64-Phe-Leu-65/EMISSAO SERIE-Thr; λmáx = 488 nm, ε = 35.600 M-1cm-1, λem = 509 nm). Devido a substituição de Ser-65-Thr(Ala,Gly), o pico de excitação 395 nm do formulário neutro fenol é suprimida e o 470-475 nm pico do fenolato aniônico é cinco a seis vezes reforçada e deslocou a 490 nm. Classe II é composto por proteínas com um cromóforo fenólico neutra, como em safira-GFP. Aqui, a substituição de Thr-203-Ile quase completamente suprime a excitação nm 475, deixando apenas o pico em 399 nm. Desde que o cromóforo aniônico não pode ser adequadamente solvated, sua forma neutra é favorecida. Classe III compreende as variantes fluorescentes "amarelas" (EYFP; Ser-65-Gly/Val-68-leu/ser-72-ala/thr-203-Tyr; Máx ε λ = 514 nm, ε = 84, 600 M-1cm-1, λem = 527 nm) com interação π-empilhamento de uma cadeia aromática de lado e o fenolato, como trazido pelas substituições de Thr-203-His(Trp,Phe,Tyr), que levam a até 20 nm máximos de emissão avermelhado (Thr-203-Tyr). Mais substituição (Gln-69-Lys) resulta em outro 1-2 nm red shift para 529 nm, a variante mais avermelhado do avGFP conhecido11. A troca do fenol por um indol (Tyr-66-Trp) cria a classe IV, como a ECFP ciano-fluorescente (Ser-65-Thr/Tyr-66-Trp; λmax1 = 434 nm, ε = 24.800 M-1cm-1; λmax2 = 452 nm, ε = 23.600 M-1cm-1 ; Λem1 = 477 nm, λem2 = 504 nm). O alojamento de indole o volumoso provavelmente está habilitado por outras, mutações compensatórias. O maxima de excitação e emissão de ECFP cair inbetween aqueles de proteínas com cromóforos aniônicos ou neutros. Proteínas de classe V abrigam um imidazol no lugar do fenol (Tyr-66-His), por exemplo., proteínas fluorescentes azul como EBFP. Classe VI é produzido por uma troca de fenol-para-fenil favorecendo a forma neutra cromóforo exclusivamente, que consequentemente leva aos mais azulado da excitação e emissão de posições de pico (360 nm e 442 nm, respectivamente).
Mutagenesis local-dirigido clássico é especialmente adequado para a produção de variantes de cromóforo romance avGFP, pela permutação do tripeptídeo e interação resíduos no quadro dos 20 aminoácidos canônicos de 65-67. Essas possibilidades podem ser expandidas ainda mais quando as variantes não-canônicos de aminoácidos aromáticos são introduzidas durante a síntese de proteínas ribossomais12. Em princípio, há duas maneiras de conseguir isso. A primeira estratégia depende da tolerância de substrato do mecanismo de tradução do proteína, especialmente de sintetases aminoacil-tRNA (aaRSs) no sentido de análogos de aminoácidos relacionados. Para alcançar este objectivo com alta eficiência, auxotróficos estirpes de Escherichia coli expressão são empregadas que são incapazes de sintetizar o aminoácido correspondente natural. Isto permite a substituição do último adicionando apropriados aminoácidos não-canônicos (ncAAs) ou precursores respectivos para o meio de cultura. Esta estratégia, também conhecido como incorporação de pressão seletiva (SPI)13,14, permite substituições de resíduos específicos, que resultam em incorporação global do ncAA. A segunda estratégia utiliza stop códon supressor tRNAs, que são cobrados com a ncAA por engenharia aaRS enzimas. Isso resulta na ler de códons de parada em-frame e permite a incorporação de ncAA site-specific. Consequentemente, esse método de supressão de códon de parada (SCS) leva à expansão do código genético15. Através de mutagénese, um códon de parada é colocado no gene do alvo no local desejado. Em princípio, a SPI também pode ser usado para criar recombinantes peptídeos e proteínas, tendo uma única instalação do ncAA, dado que raro aminoácidos canônicos como Met ou Trp são escolhidos para substituição. Com Trp, SPI abordagens têm sido mostradas para trabalhar com uma grande variedade de análogos, incluindo 4 - F - e 5 - F - e 6-F-Trp, 7-aza-Trp, 4-OH - e 5-OH-Trp, bem como 4 - 5-NH2- Trp ou mesmo β (thienopyrrolyl) alanina derivados16 ,17,18,19,20. Assim, a SPI pode ser altamente vantajoso para a substituição de aminoácidos aromáticos de cromóforos GFP por variantes não-canônicos para explorar a possibilidade de adaptar mais espectros e deslocamento de Stokes desses FPs. Quanto a todas as modificações de sequência de proteínas, a compatibilidade com maturação de dobramento e cromóforo FP deve ser testada experimentalmente.
Neste trabalho, utilizamos a classe IV ECFP21, que carrega em vez do selvagem-tipo avGFP Tyr, um resíduo de Trp dentro sua Tríade de cromóforo. Usando SPI, este Trp-66 (e Trp-57, apenas outro Trp resíduo na ECFP) é substituído pelo 4-amino-TRP. A presença do grupo amino elétron-doação de 4-amino-Trp dentro o cromóforo favorece a estabilização de ressonância de uma transferência de prótons do estado excitado muito avermelhado (ESPT) dotada de um deslocamento de Stokes 108 nm. Esta proteína fluorescente "ouro" (GdFP) constitui a variante com o maior desvio para o vermelho da fluorescência máxima (574 nm) entre todas as proteínas derivadas de avGFP. Descrevemos o método de produção de proteína GdFP pela SPI e fornecer os protocolos para a análise obrigatória das proteínas modificadas resultantes por espectroscopia de massa. Além disso, mostramos como GdFP pode ser utilizada e analisada em abordagens de espectroscopia de fluorescência tempo-resolvido.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminoindole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>525022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colloidal silica</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Ludox HS-40, 420816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amino acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter with PVDF membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>Protino series, 745410.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID:&#160;32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein extraction reagent BugBuster</td>
			<td>EMB Millipore</td>
			<td>70921-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trp-auxotrophic E. coli strain</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC 49980</td>
			<td>Bridges BA et al., Chem Biol Interact., 1972, 5(2):77-84; see main text for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometry equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td>coupled with Infinity LC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump for LC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectroscopy equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ps-pulsed laser 470 nm</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>PDL-470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>time- and wavelength-correlated single photon counting (TWSPC) acquisition software</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>SymPhoTime 64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>time- and wavelength-correlated single photon counting (TWSPC) detector</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>PML-16C</td>
			<td>16 spectral channels, to be selected by grating settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single photon counting software</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>SPCM 9.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>global fitting software</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>SPC2Glo(R)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence decay data analysis software</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>FluoFit program</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>OriginLab Inc.</td>
			<td>Origin 9.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral density filter set</td>
			<td>Schott</td>
			<td>NG1 to NG11</td>
			<td>(400 - 650 nm, transmission 50 %, 20%, 10 %, 5 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm long-pass emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>AHF-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quartz cuvette</td>
			<td>Thorlabs GmbH</td>
			<td>CV10Q1400</td>
			<td>1 cm pathlength</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering 'golden' fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence

Proteínas fluorescentes são instrumentos fundamentais para as Ciências da vida, em particular para microscopia de fluorescência das células vivas. Enquanto o selvagem-tipo e projetou variantes da proteína verde fluorescente de Aequorea victoria (avGFP), bem como homologs de outras espécies já cobrem grandes partes do espectro óptico, uma lacuna espectral permanece na região do infravermelho próximo, para quais fluorophores baseada em avGFP não estão disponíveis. Variantes da proteína fluorescente avermelhado (FP) expandiria substancialmente o toolkit para desagregação espectral de múltiplas espécies moleculares, mas o FPs avermelhado natural derivado de corais ou anêmonas têm menor rendimento quântico de fluorescência e foto-estabilidade inferior em comparação com as variantes de avGFP. Mais manipulação e possível expansão de sistema conjugado do cromóforo para a região espectral far-red também é limitada pelo repertório de 20 aminoácidos canônicos previstos no código genético. Para superar essas limitações, biologia sintética pode alcançar ainda mais espectral vermelho de mudança através da inserção de aminoácidos não-canônicas para a Tríade de cromóforo. Descrevemos a aplicação da SPI para variantes de engenheiro avGFP com propriedades espectrais de romance. Expressão da proteína é executada em um triptofano-auxotróficos Escherichia coli cepa e completando a mídia de crescimento com precursores de indole apropriado. No interior das células, estes precursores são convertidos para os análogos de triptofano correspondente e incorporados em proteínas pela máquina ribosomal em resposta aos códons UGG. A substituição do Trp-66 na variante melhorada "ciano" do avGFP (ECFP) por um elétron-doando 4-aminotryptophan resulta em GdFP com um deslocamento de Stokes 108 nm e uma máximo de emissão fortemente avermelhado (574 nm), enquanto ser termodinamicamente mais estável do que seu antecessor ECFP. Incorporação de resíduos específicos do aminoácido não-canônicos é analisada por espectrometria de massa. As propriedades espectroscópicas de GdFP são caracterizadas por espectroscopia de fluorescência tempo-resolvido como uma das valiosas aplicações de FPs geneticamente codificado nas ciências da vida.

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Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Biologia sintética permite a engenharia de proteínas com propriedades sem precedentes usando a inserção co-translational de aminoácidos não-canônicas. Aqui, apresentamos como uma variante espectralmente avermelhado de um fluoróforo GFP-tipo com propriedades espectroscópicas de fluorescência romance, denominado proteína fluorescente "ouro" (GdFP), é produzida em Escherichia coli através de incorporação de pressão seletiva (SPI).

Engenharia 'Dourada' fluorescência por pressão seletiva de incorporação de aminoácidos não-canônicos e análise de proteínas por espectrometria de massa e fluorescência

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Termodinâmica de enovelamento de proteínas de membrana Medido por espectroscopia de fluorescência

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Bioengenharia

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Métodos de detecção de fluorescência para as plataformas de gotículas microfluídicos

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Imagem de tecidos biológicos por dessorção ionização electrospray Espectrometria de Massa

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

De alta resolução espacial e temporal Análise de Receptor Dynamics por uma única molécula de microscopia de fluorescência

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

De fast imagens de fluorescência com a Lei difusão molecular em membranas de células vivas em um microscópio comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Produção de geneticamente modificados Hamsters sírios dourados por injeção pró-nuclear do complexo CRISPR/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Avaliação de colágeno e elastina Microarchitectures dependente de pressão nas artérias de resistência humana, ao vivo por microscopia de fluorescência etiqueta livre

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Peptídeos antimicrobianos produzidos pela incorporação de pressão seletiva de aminoácidos não-canônicos

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...