Name: engineering 'golden' fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence
Uploaded: 2018-04-27T13:00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Эта работа была поддержана в Германии исследовательский фонд (кластер передового опыта «унификации понятий в катализ) т.ф. и Н.Б. и федерального министерства образования и науки (BMBF программа «HSP-2020», ту-WIMIplus проекта SynTUBio) для ф-и.с.

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

С момента открытия Зеленый флуоресцирующий белок в медузы Aequorea victoria (avGFP) в 1962 году1 и первого гетерологичных выражения в 1994 году2 в других эукариотических клеток стали флуоресцентных белков семейства GFP очень ценные инструменты и цели в области биологических наук. Обширные генетические и молекулярные техники включены корректировки использования вегетационных кодон, ускорение складывания, улучшения созревания, повышенной яркости, предотвращения олигомеризации и пошив спектральными и фотохимическими свойствами включая возможность обратимого фотореле3,4,5,6. GFP обязан флуоресцентным из его 4-(p- hydroxybenzylidene) имидазолидин-5-1 (HBDI) хромофора. Последний autocatalytically формируется из триады так называемой хромофора аминокислот (Ser-65/Tyr-66/Gly-67 в avGFP) после формирования дополнительного ковалентной связи в пределах пептид позвоночника под влиянием молекулярного кислорода7. Резонансно стабилизированный конъюгированных система динамически взаимодействует с молекулярной среды, позволяя для поглощения в видимом диапазоне и характерные зеленой флуоресценцией этих белков.
В рамках триады хромофора присутствие ароматических аминокислот является обязательным. Однако стандартный аминокислоты репертуар включает в себя только четыре ароматических остатков (его, Phe, ГТО и Tyr). Это ограничивает обычных мутагенеза подходов к достижению существенн больше смещается красный avGFP варианты по отношению к наиболее красный смещается природных FPs например8 DsRed из Discosoma горлица coralimorphs или mKate/mNeptune по9 Актинии Entacmaea quadricolor. Таким образом, far-red и ближней инфракрасной части оптического спектра выше 600 Нм редко покрыта варианты гена GFP. Это, конечно, жесткое ограничение для флуоресценции микроскопических подходов, которые требуют спектральных демультиплексирование нескольких видов Флюорофор, в то же время. Например, маркеры длинноволновых необходимы также для использования режима низкой абсорбцией кожной ткани между 700-1000 Нм в настройках для глубоких тканей изображений10.
Флуоресцентные белки, полученные от avGFP делятся на несколько классов, основанных на спектральные свойства и химической природы их хромофоры11. С его триады Ser-65/Tyr-66/Gly-67, одичал тип хромофора существует как уравновешенной смесь между нейтральными, фенольные формы (λМакс = 395 Нм, ε = 21000 M-1см-1) и анионными фенолятные формы (λМакс = 475 Нм, ε = 7100 М -1см-1), и спектр излучения экспонаты одного пика 508 Нм. Группа гидроксила Ser-65 имеет решающее значение, поскольку оно donates H-Бонд в глу-222 в близости хромофора (расстояние: 3.7 Å), которая способствует ионизации этой карбоксилат. Класс, я характеризуется хромофора анионные фенолятные, как и EGFP (Phe-64-лей/Ser-65-Чет; λМакс = 488 нм, ε = 35 600 М-1см-1,Эм λ = 509 Нм). В связи с заменой Ser-65-Thr(Ala,Gly), 395 Нм возбуждения пик формы нейтральных фенола подавляется и 470-475 Нм пик анионные фенолятные пять - шесть раз расширение и перенесен на 490 Нм. Класс II состоит из белков с нейтральным фенольные хромофора, как сапфир GFP. Здесь, Чет-203-Иль замещения почти полностью подавляет 475 Нм возбуждения, оставляя только вершина в 399 Нм. Так как анионные хромофора не может быть должным образом сольватированного, благоприятствует его нейтральной форме. Класс III включает в себя «желтый» флуоресцентный варианты (EYFP; SER-65-Gly/Val-68-Leu/SER-72-Ala/THR-203-Tyr; ΛМакс ε = 514 Нм, ε = 84, 600 М-1см-1,Эм λ = 527 Нм) с укладки π взаимодействие ароматических боковой цепи и фенолятные, как в результате замены Thr-203-His(Trp,Phe,Tyr), которые приводят к до 20 Нм красный смещается выбросов Максима (чет-203-Tyr). Дальнейшие замены (Gln-69-Lys) приводит к другой 1-2 нм красный сдвиг 529 Нм, известный11вариант avGFP наиболее красный смещается. Обмен фенола для индола (Tyr-66-ГТО) создает класса IV, как циан люминесцентных ECFP (Ser-65-Чет/Tyr-66-Trp; λmax1 = 434 Нм, ε = 24,800 М-1см-1; λmax2 = 452 Нм, ε = 23600 М-1см-1 ; Em1 λ = 477 Нм, λЭМ2 = 504 нм). Размещения громоздких индола вероятно включена по другим, компенсационные мутации. ECFP возбуждения и выбросов Максима осенью inbetween тех белков с нейтральной или анионные хромофоры. Класс V белки гавани имидазола вместо фенола (Tyr-66-его), например., голубой флуоресцентные белки, как EBFP. Класс VI производится биржей фенол фенил пользу форме нейтральных хромофора исключительно, что соответственно приводит к позиции пик возбуждения и выбросов наиболее сместился синий (360 Нм и 442 нанометр, соответственно).
Классический сайт Направленный мутагенез особенно подходит для производства вариантов хромофора Роман avGFP, перестановка трипептид 65-67 и взаимодействующих остатков в рамке 20 канонические аминокислот. Эти возможности можно расширить когда нестандартные варианты ароматических аминокислот вводятся во время синтеза рибосомных белка12. В принципе существует два способа достижения этого результата. Первая стратегия опирается на субстрат терпимости белка перевод механизма, особенно аминоацил тРНК-синтетаз (aaRSs) к аналогов соответствующих аминокислот. Для достижения этой цели с высокой эффективностью, ауксотрофных штаммов E. coli выражения работают которые не способны синтезировать соответствующий природных аминокислот. Это позволяет замену последнего путем добавления подходящего неканонических аминокислоты (ncAAs) или прекурсоров его питательной среды. Эта стратегия, также известный как селективного давления включения (SPI)13,14, позволяет остатков конкретных замен, которые приводят к глобальным включение ncAA. Вторая стратегия использует стоп-кодон tRNAs супрессор, которые взимаются с ncAA, инженерии ферментов Орсе. Это приводит к readthrough стоп-кадр кодонов и участкам ncAA включение. Следовательно этот метод стоп-кодон подавления (СКС) приводит к расширению генетического кода15. Помощью мутагенеза стоп-кодон помещается в целевых генов на нужный сайт. В принципе SPI может также использоваться для создания рекомбинантных пептидов и белков, учитывая уникальные установки ncAA, учитывая, что редкие канонические аминокислот например Met или ГТО выбираются для замены. С ТРП, SPI подходы показали работать с большим разнообразием аналогов, включая 4 - Ф - 5 - F - и 6-F-ГТО, 7-аза ГТО, 4-OH - и 5-OH-ГТО, а также 4 - и 5-NH2- Trp или даже β (thienopyrrolyl) аланина производные16 ,17,18,19,20. Таким образом SPI может быть весьма выгодным для замены ароматических аминокислот GFP хромофоры нестандартные варианты для изучения возможности для дальнейшего уточнения спектры и Стоксов сдвиг эти FPs. Что касается всех модификаций последовательности белка совместимость с FP складывания и хромофора созревания должны испытываться экспериментально.
В этой работе мы используем класс IV ECFP21, которая осуществляет вместо одичал тип avGFP Tyr, ГТО остатков в пределах своей хромофора триады. С помощью SPI, этот ГТО-66 (и ГТО-57, только другие ГТО остатков в ECFP) заменяется на 4-амино ТРП. Присутствие электрон donating амино-группы 4-амино-ТРП внутри хромофора способствует стабилизации резонанс перенос протона далеко смещен красный возбужденное состояние (ESPT), наделенных 108 Нм Стоксов сдвиг. Этот «золото» флуоресцентный белок (GdFP) представляет собой вариант с крупнейшим красное смещение максимум флюоресценции (574 nm) среди всех белков, avGFP производные. Мы опишем способ производства белка GdFP, SPI и предоставляют протоколы для обязательного анализа результирующее изменение белков, масс-спектроскопии. Кроме того мы покажем, как GdFP могут быть использованы и во время решена флуоресценции спектроскопии подходов.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-aminoindole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>525022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM ULTRA for LC-MS, 83642</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agar-agar</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium molybdate ((NH4)2MoO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>277908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ammonium sulfate ((NH4)2SO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ampicillin sodium salt</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>K029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B4501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bromophenol blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colloidal silica</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Ludox HS-40, 420816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brillant Blue R 250</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3862</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>copper sulfate (CuSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CP86.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X987</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>di-potassium hydrogen phosphate (K2HPO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P749.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6908</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS, 84865</td>
			<td>LC-MS grade required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>imidazole</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>X998</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iron(II) chloride (FeCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>380024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>AE73.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lysozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium chloride (MgCl2)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>KK36.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>magnesium sulfate (MgSO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8283.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>manganese chloride (MnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>4227.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6781.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>7156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>P029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>T879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium dodecyl sulphate (NaC12H25SO4)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>0183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thiamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(hydroxymethyl)-aminomethane (Tris)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>5429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris hydrochloride (Tris-HCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>857645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tryptone</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8952</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>yeast extract</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>zinc chloride (ZnCl2)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>229997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>amino acids</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-alanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-asparagine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-aspartic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A0884</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-cysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G3126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-isoleucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L8000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-methionine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-phenylalanine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-threonine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptophan</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrosine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-valine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lab materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter with PVDF membrane</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>CCY1.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>conical polystyrene (Falcon) tubes, 50 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer-Lock syringe 5 mL</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EP96.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dialysis membrane, Molecular Weight Cut-Off (MWCO) 5,000</td>
			<td>Spectrum Medical Industries</td>
			<td>Spectra/Por MWCO 5000 dialysis membrane, 133198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) column 1 mL, Ni-NTA</td>
			<td>Macherey Nagel</td>
			<td>Protino series, 745410.5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes (polystyrene, sterile)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>TA19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pQE-80L plasmid vector</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>no longer available</td>
			<td>replaced by N-terminus pQE Vector set Cat No./ID:&#160;32915</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>protein extraction reagent BugBuster</td>
			<td>EMB Millipore</td>
			<td>70921-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>round-bottom polystyrene tubes, 14 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Corning Falcon, 14-959-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trp-auxotrophic E. coli strain</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC 49980</td>
			<td>Bridges BA et al., Chem Biol Interact., 1972, 5(2):77-84; see main text for alternatives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass Spectrometry equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mass spectrometer for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>Agilent 6530 Accurate-Mass QTOF</td>
			<td>coupled with Infinity LC system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mass spectrometry data analysis software</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>MassHunter Qualitative Analysis software v. B.06.00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) column for LC-ESI-TOF-MS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC column, 3 &#181;m particle size, 10 cm x 2.1 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC autosampler vials 1.5 mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Supelco 854165</td>
			<td>with conical 0.1 mL glass inserts, screw caps and septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>benchtop centrifuge for 1.5 mL Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cooling centrifuge for 50 mL Falcon tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>high pressure microfluidizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Microfluidics</td>
			<td>LM series with &#8220;Z&#8221; type chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump for LC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>P-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>&#196;KTA pure 25 L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>orbital shaker for bacterial cultivation</td>
			<td>Infors HT</td>
			<td>Minitron</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV/Vis spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>ULTROSPEC 2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ultrasonic homogenizer for bacterial cell disruption</td>
			<td>Omnilab</td>
			<td>Bandelin SONOPULS HD 3200, 5650182</td>
			<td>with MS72 sonifier tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence spectroscopy equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ps-pulsed laser 470 nm</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>PDL-470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>time- and wavelength-correlated single photon counting (TWSPC) acquisition software</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>SymPhoTime 64</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>time- and wavelength-correlated single photon counting (TWSPC) detector</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>PML-16C</td>
			<td>16 spectral channels, to be selected by grating settings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>single photon counting software</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>SPCM 9.75</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>global fitting software</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>SPC2Glo(R)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescence decay data analysis software</td>
			<td>Picoquant GmbH</td>
			<td>FluoFit program</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software</td>
			<td>OriginLab Inc.</td>
			<td>Origin 9.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neutral density filter set</td>
			<td>Schott</td>
			<td>NG1 to NG11</td>
			<td>(400 - 650 nm, transmission 50 %, 20%, 10 %, 5 %)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm long-pass emission filter</td>
			<td>AHF Analysentechnik</td>
			<td>AHF-488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>quartz cuvette</td>
			<td>Thorlabs GmbH</td>
			<td>CV10Q1400</td>
			<td>1 cm pathlength</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

engineering 'golden' fluorescence by selective pressure incorporation of non-canonical amino acids and protein analysis by mass spectrometry and fluorescence

Флуоресцентные белки являются основными инструментами для наук о жизни, в частности для микроскопии флуоресцирования живых клеток. В то время как одичал тип и инженерии варианты зеленого флуоресцентного белка Aequorea victoria (avGFP), а также от других видов гомолог уже охватывают большие части оптического спектра, спектральные разрыв остается в регионе ближней ИК-области спектра, для которых на основе avGFP флуорофоров не доступны. Красный смещается флуоресцентный белок (FP) варианты бы существенно расширить инструментарий для спектральных расслоение нескольких молекулярных видов, но естественным красно смещается FPs, полученных из кораллов или актинии ниже квантовый выход флуоресценции и Ниже Фото стабильность по сравнению с avGFP варианты. Дальнейшие манипуляции и возможного расширения хромофора конъюгированных системы к far-red спектральном диапазоне также ограничивается репертуар канонические 20 аминокислот, установленном генетического кода. Чтобы преодолеть эти ограничения, синтетической биологии можно добиться дальнейшего спектральных красный сдвиг через вставку неканонических аминокислот в триады хромофора. Мы описываем применение SPI инженер avGFP варианты с Роман спектральных свойств. Выражение протеина производится в триптофан ауксотрофных E. coli деформации и путем дополнения питательных сред с подходящим индола прекурсоров. Внутри клетки эти прекурсоры преобразованы в соответствующие аналоги триптофана и включены в белки рибосомных механизмом в ответ UGG кодонов. Замена ГТО-66 в варианте расширенной «голубой» avGFP (ECFP), жертвуя электрон 4-aminotryptophan приводит к GdFP, показывая 108 Нм Стоксов сдвиг и сильно смещается красный выбросов максимум (574 Нм), будучи термодинамически более стабилен, чем его предшественник ECFP. Остаток конкретного включения неканонических аминокислоты анализируется по масс-спектрометрии. Спектральные свойства GdFP были характерны отдела Флуоресценция время решен как один из ценных приложений генетически закодированный FPs в науках о жизни.

Watch this Scientific Journal Video about Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence 

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Синтетическая биология позволяет инженерия протеинов с беспрецедентной свойств, с помощью co-translational вставки неканонических аминокислот. Здесь мы представили, как спектрально смещается красный вариант GFP-типа Флюорофор с Роман флуоресценции спектральными свойствами, называют «золото» флуоресцентный белок (GdFP), производится в E. coli через селективного давления включения (SPI).

Инжиниринг «Золотой» флуоресценции путем селективного давления включения неканонических аминокислот и белков анализ по масс-спектрометрии и флуоресценции

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Термодинамика Мембранные белки Складные Измеряется флуоресцентной спектроскопии

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

Флуоресценция методы обнаружения микрофлюидных платформ капли

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Изображений биологических тканей десорбцией Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Высокое разрешение Пространственно-временная Анализ рецептора Dynamics по одиночных молекул флуоресцентной микроскопии

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Орбитальная слежения в модифицированной двухфотонного микроскопа: Приложение к отслеживая внутриклеточного везикулы

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

От быстрого флуоресценции визуализации к молекулярной диффузии Закона о живых клеточных мембран в торговом микроскоп

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Production of Genetically Engineered Golden Syrian Hamsters by Pronuclear Injection of the CRISPR/Cas9 Complex

Производство генетически Золотой сирийских хомяков Pronuclear инъекции комплекса ТРИФОСФАТЫ/Cas9

The pronuclear (PN) injection technique was first established in mice to introduce foreign genetic materials into the pronuclei of one-cell stage embryos. ...

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Оценка коллаген и эластин схемотехнические зависящих от давления в артериях живой, человеческий сопротивления по микроскопии флуоресцирования Label бесплатно

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Antimicrobial Peptides Produced by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids

Антимикробные пептиды, производится путем селективного давления включения неканонических аминокислот

Nature has a variety of possibilities to create new protein functions by modifying the sequence of the individual amino acid building blocks. However, all ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Обнаружения эндотоксинов в нано составов с помощью анализов Lysate (Лал) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...