Name: surface functionalization of hepatitis e virus nanoparticles using chemical conjugation methods
Uploaded: 2018-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods at JoVE.com

Forfatterne anerkender sponsorering af finansieringen til RHC af NIH yde #' s: AI095382, EB021230, CA198880, Statens Institut for fødevarer og landbrug samt Finland Distinguished Professor program.

1. HEVNP produktion i insekt celler
Bemærk: Alle følgende trin skal udføres i en celle kultur hætte. Henvise til vores tidligere publikation for mere detaljerede HEVNP produktion procedurer11.
<ol><li>Kultur Sf9 celler i insekt cell media (Se Tabel af materialer) til 50-75% sammenløbet i 6-godt plader.</li>
	<li>Brug insekt celle Transfektion reagenser ifølge producentens protokoller, transfect Bacmids med HEVNP - 573 C ORF2 i Sf99 celler til at...

<ol>
	<li>Ludwig, C., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-like+particles-universal+molecular+toolboxes.">Virus-like particles-universal molecular toolboxes.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).</li><li>Galaway, F. A., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+viruslike+particles:+a+robust,+semisynthetic+targeted+drug+delivery+platform.">MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform.</a> Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).</li><li>Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-based+nanocarriers+for+drug+delivery.">Virus-based nanocarriers for drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).</li><li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+activatable+viral+capsid+functionalized+for+cancer+targeting.">Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).</li><li>Jariyapong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hepatitis+E+virus-like+particle+as+a+carrier+for+oral-delivery.">Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery.</a> Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+hepatitis+E+capsid+protein+self-assembles+into+a+dual-domain+T+=+1+particle+presenting+native+virus+epitopes.">Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes.</a> Virology. 265 (1), 35-45 (1999).</li><li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+elements+of+the+capsid+protein+for+self-assembly+into+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus.">Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+hepatitis+E+virion-sized+particle+reveals+an+RNA-dependent+viral+assembly+pathway.">Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway.</a> J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+configuration+of+hepatitis+E+virus+antigenic+domain.">Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain.</a> J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+characterization+of+a+high-affinity+and+high-specificity+peptide+ligand+LXY30+for+in+vivo+targeting+of+&#945;3+integrin-expressing+human+tumors.">Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of &#945;3 integrin-expressing human tumors.</a> EJNMMI research. 6 (1), (2016).</li><li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus.">Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).</li><li>Peyret, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+gentle+purification+of+virus-like+particles+produced+in+plants.">A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants.</a> J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).</li><li>Technologies, N. b. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vol. MAN0007891 1-2. , (2013).</li><li>Baskin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-free+click+chemistry+for+dynamic+in+vivo+imaging.">Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).</li></ol>

I modsætning til den tidskrævende genteknologi procedure, som normalt tager uger, her vi demonstrere simpel totrins og one-step kemiske konjugation procedurer, som kan være afsluttet inden for 3 dage, for at tilføje kræft målretning ligand og/eller Fluorescens påvisning farvestof til Cys/Lys steder i HEVNPs. Teknikken kan bruges til at screene for bedste ligand målet fra en pulje af ansøgere, og dermed tager fordel af de tilgængelige peptid/lille molekyle syntese tjenester til en rimelig pris og levering tid.</...

Udvikling af nano-størrelse vektorer i terapeutiske og diagnostiske levering, kendt som nanotheranostics, har flyttet meget af den biomedicinske felt fra generaliseret behandlinger mod målrettet levering1. Målrettede nanotheranostic levering integrerer nano-størrelse vektorer (nanopartikler) med theranostic molekyler til stabilt direkte theranostic molekyler til en specifik sygt væv eller biokemisk pathway2,3,4 . Nanomedicin er kommet i forgrunden af målrettet levering fordi optimalt mellemstore nanopartikler har kapacitet til at stabilisere cirkulation af theranostic molekyler og selektivt målrette cellens overflade molekyler præsenteret på syge væv. Mange nanotheranostic platforme stadig lider af passive celle optagelse, pre-moden nedbrydning, toksicitet og utilstrækkelig association med theranostic molekyler. VLPs overvinde mange af disse hindringer i målrettet levering. De har været brugt som nanocarriers til at vise udenlandske epitoper og/eller levere små molekyler: et regime, der kan bruges til at bekæmpe mange sygdomme1. Dette program bygger primært på egenskaben i samlesæt og lethed af genetiske modifikationer, at opfylde programmet designet til den givne VLP. Sammenlignet med genteknologi, kemiske konjugation af udenlandske peptider til VLP viser en betydelig fordel, fordi det giver mulighed for en lang række enheder, såsom peptider eller oligosaccharider, at være konjugeret til overfladen af VLPs i en moduleret og fleksibel måde uden ændring af VLP forsamling.
HEVNPs, afledt af af rekombinante HEV kapsid proteiner, 2nd åben læsning frame (ORF2), er ikke-infektiøse, selv samle capsids i stand til celle-bindende og post. Fordi HEV udviklet sig til slimhinden transmission, er forsamlede kapsid proteiner ligeledes stabil i proteolytiske og sure slimhinde betingelser5. HEVNPs danner en hule, T = 1 ikosaedriske kapsid, der består af 60 identiske enheder6,7 i ORF2, gør det yderst stabil i opbevaring og barske fysiologiske forhold. Mangler enhver viral genetiske elementer, er effektive og højt udbytte produktion opnået gennem baculovirus ekspressionssystem i insekt celler. På grund af deres proteolytiske stabilitet, er selvsamlede HEVNPs udvindes og renset fra celle supernatanten, betydeligt reducere nødvendige rensning trin. Derudover besidder HEVNPs en overflade udsat fremspring domæne (P domæne) tilsluttet via en fleksibel hængsel til en stabil ikosaedriske base. Domænet P danner overfladen-eksponerede pigge på toppen af den ikosaedriske base mens den fleksibel hængsel gør det muligt at væsentligt ændre domænet P uden at kompromittere den base ikosaedriske struktur. Med 60 gentagne enheder, enkelt lokationsspecifikke ændring resulterer i 60 symmetrisk websteder for kemiske graduering. For nylig har vi foreslået en nano-platform ved hjælp af HEVNP, der kan kemisk konjugat ligander eller små molekyler til theranostic applikationer. Dette blev opnået ved at udskifte en enkelt aminosyre med cystein på domænet fremspring af HEV-VLP som en reaktion site med maleimide-linked peptider eller molekyler. Baseret på tidligere strukturel analyse af HEV-VLP og velundersøgte immunogen epitoper8,9, de følgende fem HEV-VLP aminosyrer blev erstattet med cystein som potentielle kandidater: Y485C, T489C, S533C, N573C og T586C ( Figur 1). Efter proteinekspression og -oprensning fra insekt celler, deres VLP formationer blev bekræftet af transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) observation (figur 2), og de udsatte cystein websteder blev analyseret af Western duppes efter maleimide-linked biotin konjugering (figur 2). Blandt de fem mutanter, HEVNP - 573C vises det stærkeste signal om maleimide-biotin konjugering (figur 2) og blev brugt til opfølgning demonstration som nanocarrier for bryst kræftcelle målretning4 (figur 3).
Denne protokol skildrer kemiske konjugation metoder for at tillægge HEVNPs tumor-targeting molekyler gennem overfladen cystein konjugering. Vi detalje konjugation af tumor målretning og sporing molekyler til tumor levering med rekombinante HEVNPs indeholdende en cysteine på N573 (HEVNP - 573C). Vi fokuserede på en to-trins Klik kemi konjugation proces til at binde en bryst kræft tumor målretning peptid, LXY3010 til HEVNPs form LXY30-HEVNP (figur 4). Efterfølgende, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 blev konjugeret til separat Lys-webstedet på HEVNPs at bygge LXY30-HEVNP-Cy5.5 til registrering af fluorescerende både in vitro- (figur 5) og in vivo4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="984">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:391px;">MINI Dialysis Units, 10K MWCO</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:265px;">69572</td>
			<td style="width:167px;">mini dialysis unit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Five Cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B85502</td>
			<td>Tn5 cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SF9 Cells&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11496015</td>
			<td>Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11101, A11100</td>
			<td>Baculovirus expression system</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024</td>
			<td>Bacmid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ESF921 Insect Cell Media</td>
			<td>Expression Systems LLC</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td>insect cell media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy5.5 NHS ester, 5mg</td>
			<td>Lumiprobe Corp</td>
			<td>27020</td>
			<td>Cy5.5 NHS ester</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>87766</td>
			<td>spin desalting column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemical Co</td>
			<td>M8250-250G</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc</td>
			<td>Depends on Rotor</td>
			<td>ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NPO321BOX</td>
			<td>SDS protein gel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:391px;">EMS Glow Discharger</td>
			<td style="width:161px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td>glow discharger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface functionalization of hepatitis e virus nanoparticles using chemical conjugation methods

Viruslignende partikler (VLPs) har været brugt som nanocarriers til at vise udenlandske epitoper og/eller levere små molekyler i detektion og behandling af forskellige sygdomme. Dette program er baseret på genetisk modifikation, samlesæt, og cystein konjugation at opfylde tumor-targeting anvendelsen af rekombinante VLPs. sammenlignet med genetiske modifikation alene, kemiske konjugation af udenlandske peptider til VLPs tilbyder en væsentlig fordel fordi det giver mulighed for en række forskellige enheder, såsom syntetiske peptider eller oligosaccharider, at være konjugeret til overfladen af VLPs i en differentieret og fleksibel måde uden ændring af VLP forsamling.
Her, viser vi hvordan man bruger hepatitis E virus nanopartikel (HEVNP), et modulopbygget theranostic kapsel, som multifunktionelle levering transportør. Funktioner af HEVNPs omfatter målretning af væv, billedbehandling og terapeutiske levering. Baseret på veletablerede strukturelle forskning af HEVNP, blev strukturelt uafhængig og overflade-eksponerede rester udvalgt til cystein udskiftning som konjugation websteder for maleimide i forbindelse med kemiske grupper via thiol-selektiv forbindelser. En bestemt cystein-modificeret HEVNP (Cys udskiftning af asparagin på 573 aa (HEVNP - 573C)) blev konjugeret med et bryst kræft celle-specifikke ligand, LXY30 og mærket med nær-infrarødt (NIR) Fluorescens dye (Cy5.5), gengivelse af tumor-målrettet HEVNPs som effektivt diagnostiske kapsler (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Lignende engineering strategier kan være ansat med andre makromolekylære komplekser med velkendte atomic strukturer til at udforske potentielle anvendelser i theranostic levering.

Beslægtet med HEV-VLPs, alle Cys modificerede HEVNPs dannet opløselige ikosaedriske capsids og samlet ikke i løsning under produktion eller rensning. Før og efter trinvis maleimide-biotin konjugering, hver af Cys modificerede var HEVNPs umulig at skelne fra HEV-VLPs i den negative pletten EM (figur 2). Maleimide-biotin konjugation effektivitet til Cys modificerede HEVNPs blev først testet med Western blotting via kemiluminescens streptavidin bindende. Ef...

Watch this Scientific Journal Video about Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods at JoVE.com

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Overflade Functionalization af Hepatitis E Virus nanopartikler ved hjælp af kemiske konjugation metoder

Vi har manipuleret kapsid proteiner af hepatitis E virus som en theranostic nanopartikel (HEVNP). HEVNP samler selv i en stabil ikosaedriske bur i slimhinden levering. Her beskriver vi ændring af HEVNPs for tumor målretning af muterer overflade-eksponerede rester til cysteines, som konjugat syntetiske ligander, der specifikt binder tumorceller.

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

Blød Litografiske funktionalisering og mønster oxydfri silicium og germanium

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Høst Muse alveolære makrofager og evaluering Cellular aktivering induceret af polyanhydridet Nanopartikler

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

High-throughput Syntese af kulhydrater og Funktionalisering af polyanhydridet Nanopartikler

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

Gør konjugation-induceret fluorescerende pegyleret viruslignende partikler af Dibromomaleimide-disulfid kemi

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Omfattende evaluering af effektiviteten og sikkerheden af moderkagen-målrettet medicinafgivelse ved hjælp af tre komplementære metoder

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

Flash NanoPrecipitation for indkapsling af hydrofobe og hydrofile forbindelser i polymere nanopartikler

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

Fremstilling af Neutrally-ladede, pH-Responsive polymere nanopartikler til Cytosolic siRNA-levering

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...