Name: surface functionalization of hepatitis e virus nanoparticles using chemical conjugation methods
Uploaded: 2018-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods at JoVE.com

המחברים לאשר חסות המימון כדי RHC על ידי NIH להעניק #' s: AI095382, EB021230, CA198880, המכון הלאומי מזון, חקלאות, כמו גם את התוכנית מן המניין פינלנד.

1. HEVNP ייצור בתאי חרקים
הערה: כל הפעולות הבאות צריכה להתבצע בשכונה התרבות תאים. מתייחסים לפרסום הקודם שלנו מפורט יותר HEVNP ייצור הליכים11.
<ol><li>תרבות Sf9 בתאי חרקים תא מדיה (ראה טבלה של חומרים) 50-75% למפגש ב- 6-ובכן צלחות.</li>
	<li>באמצעות תא חרקים ריאגנטים תרביות ת...

<ol>
	<li>Ludwig, C., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-like+particles-universal+molecular+toolboxes.">Virus-like particles-universal molecular toolboxes.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).</li><li>Galaway, F. A., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+viruslike+particles:+a+robust,+semisynthetic+targeted+drug+delivery+platform.">MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform.</a> Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).</li><li>Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-based+nanocarriers+for+drug+delivery.">Virus-based nanocarriers for drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).</li><li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+activatable+viral+capsid+functionalized+for+cancer+targeting.">Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).</li><li>Jariyapong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hepatitis+E+virus-like+particle+as+a+carrier+for+oral-delivery.">Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery.</a> Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+hepatitis+E+capsid+protein+self-assembles+into+a+dual-domain+T+=+1+particle+presenting+native+virus+epitopes.">Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes.</a> Virology. 265 (1), 35-45 (1999).</li><li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+elements+of+the+capsid+protein+for+self-assembly+into+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus.">Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+hepatitis+E+virion-sized+particle+reveals+an+RNA-dependent+viral+assembly+pathway.">Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway.</a> J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+configuration+of+hepatitis+E+virus+antigenic+domain.">Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain.</a> J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+characterization+of+a+high-affinity+and+high-specificity+peptide+ligand+LXY30+for+in+vivo+targeting+of+&#945;3+integrin-expressing+human+tumors.">Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of &#945;3 integrin-expressing human tumors.</a> EJNMMI research. 6 (1), (2016).</li><li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus.">Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).</li><li>Peyret, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+gentle+purification+of+virus-like+particles+produced+in+plants.">A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants.</a> J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).</li><li>Technologies, N. b. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vol. MAN0007891 1-2. , (2013).</li><li>Baskin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-free+click+chemistry+for+dynamic+in+vivo+imaging.">Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).</li></ol>

בניגוד ההליך זמן רב הנדסה גנטית, אשר בדרך כלל לוקח שבועות, כאן אנחנו להדגים שני שלבים פשוטים והליכי צעד אחד ההטיה כימי, אשר יכולה להסתיים בתוך 3 ימים, של הוספת הסרטן מיקוד ליגנד ו/או קרינה פלואורסצנטית צבע זיהוי לאתרים Cys/ליס של HEVNPs. ניתן להשתמש בטכניקה המסך עבור היעד ליגנד הטוב ביותר מתוך מא?...

הפיתוח של וקטורים בגודל ננו במשלוח איבחוניות, המכונה nanotheranostics, השתנתה הרבה בתחום הביו-רפואי מן הטיפולים כללית לקראת משלוח ממוקד1 משלוח nanotheranostic יישוב משתלב בגודל ננו וקטורים (חלקיקים) עם מולקולות theranostic לכוון stably theranostic מולקולות ספציפיות רקמה חולה או מסלול ביוכימי2,3,4 . ננו-רפואה הגיע לחזית של משלוח ממוקד כי חלקיקים בגודל אופטימלי יש את היכולת לייצב את זרימת הדם של מולקולות theranostic, באופן סלקטיבי היעד מולקולות על פני התא המוצג לרקמות החולות. פלטפורמות nanotheranostic רבות עדיין סובלים ספיגת תא פסיבי, השפלה טרום בוגרת, רעילות, האגודה לא מספיקות מולקולות theranostic. האח מים להתגבר על הרבה מכשולים אלה במשלוח ממוקד. הם שימשו nanocarriers להציג epitopes זרים ו/או לספק מולקולות קטנות: משטר יכול לשמש כדי להילחם במחלות רבות1. יישום זה מסתמך בעיקר על הרכוש של הרכבה עצמית כמו גם להקל על שינויים גנטיים, כדי למלא את היישום תוכנן עבור האיש החשוב נתון. בהשוואה להנדסה גנטית, ההטיה כימי של פפטידים זרים כדי האח מים מציג יתרון משמעותי משום שהוא מאפשר מגוון גדול של ישויות, כגון פפטידים או oligosaccharides, כדי להיות מצומדת השטח של האח מים ב מאופנן ו באופן גמיש ללא שינוי של האח מים הרכבה.
HEVNPs, נגזר HEV capsid חלבון רקומביננטי, 2nd פתח קריאה מסגרת (ORF2), הם שאינן זיהומיות, הרכבה עצמית capsids מסוגל התא מחייב כניסה. כי HEV התפתח לשידור הרירית, החלבון capsid שהורכב יציב באופן דומה הפרוטאוליטי ותנאי הרירית חומצי5. HEVNPs טופס חלול, T = 1 icosahedral capsid, המורכב 60 יחידות זהות6,,7 , של ORF2, טיוח זה יציב מאוד גם אחסון וגם בתנאים פיזיולוגיים קשים. חסר כל מרכיבים גנטיים ויראלי, תשואה גבוהה, יעילות הייצור מושגת באמצעות מערכת baculovirus ביטוי בתאי חרקים. בגלל היציבות הפרוטאוליטי שלהם, HEVNPs עצמית שהורכב חילוץ, מטוהרים מן התא תגובת שיקוע, נחוץ טיהור צעדים לצמצום משמעותי. בנוסף, HEVNPs בעלי תחום בליטה חשוף שטח (תחום P) מחובר באמצעות ציר גמיש כדי icosahedral בסיס יציב. התחום P צורות השטח החשופים קוצים על גבי הבסיס icosahedral בזמן הציר גמישה מאפשרת לך לשנות באופן משמעותי את התחום P מבלי להתפשר על מבנה icosahedral בסיס. עם 60 יחידות חוזרות ונשנות, שינוי בייעודי לאתר יחיד התוצאה 60 אתרים סימטרי עבור אפנון כימי. לאחרונה, הצענו ננו-פלטפורמה באמצעות HEVNP זה יכול מבחינה כימית נזווג ליגנדים או מולקולות קטנות עבור יישומים theranostic. זה הושג על-ידי החלפת חומצה אמינית בודדת של ציסטאין על תחום בליטה של HEV-הוי כאתר התגובה עם פפטידים מקושרים maleimide או מולקולות. בהתבסס על ניתוח מבנה הקודם של HEV-הוי ו-8,epitopes immunogenic למד היטב9, חומצות אמינו HEV-הוי חמש הבאה הוחלפו ציסטאין כמו מועמדים פוטנציאליים: Y485C, T489C, S533C, N573C ו- T586C ( איור 1). לאחר ביטוי וטיהור מתאי חרקים, תצורות האח מים שלהם שאושרו על-ידי שידור מיקרוסקופ אלקטרונים (TEM) תצפית (איור 2), ואת האתרים ציסטאין חשוף נותחו על ידי המערב כתם לאחר ביוטין מקושר-maleimide ההטיה (איור 2). בין המוטציות חמש, HEVNP - 573C את האות החזק ביותר של maleimide-ביוטין ההטיה (איור 2), מוצגים שימש להמשך להוכחה nanocarrier עבור תא סרטני השד מיקוד4 (איור 3).
פרוטוקול זה מתאר שיטות ההטיה כימי כדי לצרף פילוח הגידול מולקולות HEVNPs דרך משטח ציסטאין ההטיה. אנחנו פירוט את ההטיה של מולקולות מיקוד וזיהוי הגידול למסירה הגידול עם HEVNPs רקומביננטי המכיל של ציסטאין-N573 (HEVNP - 573C). אנחנו התמקדנו תהליך ההטיה דו-שלבי כימיה לחץ כדי לאגד גידול סרטן השד מיקוד פפטיד, LXY3010 כדי HEVNPs להיווצר LXY30-HEVNP (איור 4). לאחר מכן, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 היו מצומדת לאתר Lys נפרד HEVNPs לבנות LXY30-HEVNP-Cy5.5 לגילוי פלורסנט הן במבחנה (איור 5), ויוו4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="984">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:391px;">MINI Dialysis Units, 10K MWCO</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:265px;">69572</td>
			<td style="width:167px;">mini dialysis unit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Five Cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B85502</td>
			<td>Tn5 cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SF9 Cells&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11496015</td>
			<td>Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11101, A11100</td>
			<td>Baculovirus expression system</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024</td>
			<td>Bacmid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ESF921 Insect Cell Media</td>
			<td>Expression Systems LLC</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td>insect cell media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy5.5 NHS ester, 5mg</td>
			<td>Lumiprobe Corp</td>
			<td>27020</td>
			<td>Cy5.5 NHS ester</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>87766</td>
			<td>spin desalting column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemical Co</td>
			<td>M8250-250G</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc</td>
			<td>Depends on Rotor</td>
			<td>ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NPO321BOX</td>
			<td>SDS protein gel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:391px;">EMS Glow Discharger</td>
			<td style="width:161px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td>glow discharger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface functionalization of hepatitis e virus nanoparticles using chemical conjugation methods

חלקיקים דמויי וירוס (האח מים) שימשו nanocarriers להציג epitopes זרים ו/או לספק מולקולות קטנות זיהוי וטיפול במחלות שונות. יישום זה מסתמך על ההנדסה הגנטית, הרכבה עצמית, ציסטאין ההטיה כדי למלא את היישום פילוח הגידול של האח מים רקומביננטי. לעומת גנטי מציע שינוי לבד, כימיה ההטיה של פפטידים זרים כדי האח מים משמעותי יתרון משום שהיא מאפשרת מגוון רחב של גופים, כגון peptides סינתטי או oligosaccharides, כדי להיות מצומדת השטח של האח מים בצורה מווסתת ו גמיש ללא שינוי של מכלול האח מים.
. הנה, נדגים כיצד להשתמש את הפטיטיס E וירוס ננו-חלקיק (HEVNP), modularized theranostic קפסולה, כנשא משלוח רב תכליתיים. פונקציות של HEVNPs כוללים פילוח רקמות, הדמיה ומסירת טיפולית. בהתבסס על המחקר המבני ומבוססת של HEVNP, משקעי מבנית עצמאית, השטח החשופים נבחרו עבור החלפת ציסטאין כאתרי ההטיה לקבוצות מקושרים maleimide כימי באמצעות קישורים תיול-סלקטיבית. אחד מסוים ציסטאין-השתנה HEVNP (תחליף Cys של אספרגין-573 aa (HEVNP - 573C)) היה מצומדת השד סרטן תאים ספציפיים ליגנד, LXY30 ומוענקת -סגול (ניר) זריחה צבען (Cy5.5), עיבוד של הגידול, ממוקדות HEVNPs כמו קפסולות אבחון יעיל (LXY30-HEVNP-Cy5.5). אסטרטגיות הנדסיות דומה יכול להיות מועסק עם שאר מכלולי macromolecular עם הבראבה ידועים לחקור יישומים פוטנציאליים משלוח theranostic.

דומה HEV-האח מים, Cys כל ששינה HEVNPs הנוצרת capsids icosahedral מסיסים, ולא צבורים בתמיסה במהלך הייצור או טיהור. לפני ואחרי נטיה צעד אחר צעד maleimide-ביוטין, כל אחד Cys שונה HEVNPs היו להבחין מגניחותיה HEV-האח מים בתוך הכתם שלילי EM (איור 2). Maleimide-ביוטין יעילות ההטיה ל Cys ששונה HEVNPs נבח...

Watch this Scientific Journal Video about Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods at JoVE.com

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Functionalization פני השטח של חלקיקי וירוס הפטיטיס E בשיטות כימיות ההטיה

שתכננו את החלבון capsid של וירוס הפטיטיס E כמו ננו-חלקיק theranostic (HEVNP). HEVNP עצמי מרכיבה לתוך כלוב icosahedral יציב במשלוח הרירית. כאן, אנו מתארים את השינוי של HEVNPs לגידול מיקוד על ידי מוטציה השטח החשופים שאריות אל cysteines, אשר נזווג סינתטי ליגנדים שקושרים במיוחד תאים סרטניים.

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

שיטות פיתוח תובלה דם ברנה macrophage של תרופות תרופתי Nanoformulated

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

Functionalization לליתוגרפיות רך אוקסיד ללא דפוסים סיליקון גרמניום

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

הפעלת נייד קציר המקרופאגים מכתשיים Murine והערכת בהשפעת חלקיקים Polyanhydride

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

ניתוח הפנמה נייד של חלקיקים וחיידקים על ידי Cytometry Multi-Flow דימות ספקטרלי

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

תפוקה גבוהה סינתזה של פחמימות functionalization של חלקיקים Polyanhydride

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

ביצוע הנוצרות על-ידי ההטיה של חלקיקים דמויי וירוס PEGylated פלורסנט מאת כימיה Dibromomaleimide-דיסולפידי

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

הערכה מקיפה של היעילות והבטיחות של משלוח סמים, ממוקדות השליה באמצעות שלוש שיטות משלימות

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

פלאש NanoPrecipitation בשביל העטיפה של תרכובות הידרופוביות, הידרופילית חלקיקים פולימרים

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

הכנת מנטרל-טעון, pH-מגיבים חלקיקים פולימריים עבור משלוח ציטוזה מסירה

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...