Name: surface functionalization of hepatitis e virus nanoparticles using chemical conjugation methods
Uploaded: 2018-05-11T14:00:00
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著者は NIH によって迎えへの資金のスポンサーを認める許可 #' s: AI095382、EB021230、CA198880、研究所食品農業とフィンランドの識別教授はプログラム。

1 昆虫細胞で HEVNP 生産
注: すべての次の手順は、セル文化フードで行わなければなりません。詳細な HEVNP 生産手順11当社前の文書を参照してください。
<ol><li>Sf9 昆虫細胞のセル 6 ウェル プレートでの 50-75% 合流するメディア (材料表を参照してください)。</li>
	<li>組換えバキュロ ウイルスを生成する Sf99 セルに HEVNP-573 C ORF2 を含む Bacmids ?...

<ol>
	<li>Ludwig, C., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-like+particles-universal+molecular+toolboxes.">Virus-like particles-universal molecular toolboxes.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).</li><li>Galaway, F. A., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+viruslike+particles:+a+robust,+semisynthetic+targeted+drug+delivery+platform.">MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform.</a> Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).</li><li>Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-based+nanocarriers+for+drug+delivery.">Virus-based nanocarriers for drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).</li><li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+activatable+viral+capsid+functionalized+for+cancer+targeting.">Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).</li><li>Jariyapong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hepatitis+E+virus-like+particle+as+a+carrier+for+oral-delivery.">Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery.</a> Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+hepatitis+E+capsid+protein+self-assembles+into+a+dual-domain+T+=+1+particle+presenting+native+virus+epitopes.">Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes.</a> Virology. 265 (1), 35-45 (1999).</li><li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+elements+of+the+capsid+protein+for+self-assembly+into+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus.">Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+hepatitis+E+virion-sized+particle+reveals+an+RNA-dependent+viral+assembly+pathway.">Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway.</a> J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+configuration+of+hepatitis+E+virus+antigenic+domain.">Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain.</a> J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+characterization+of+a+high-affinity+and+high-specificity+peptide+ligand+LXY30+for+in+vivo+targeting+of+&#945;3+integrin-expressing+human+tumors.">Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of &#945;3 integrin-expressing human tumors.</a> EJNMMI research. 6 (1), (2016).</li><li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus.">Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).</li><li>Peyret, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+gentle+purification+of+virus-like+particles+produced+in+plants.">A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants.</a> J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).</li><li>Technologies, N. b. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vol. MAN0007891 1-2. , (2013).</li><li>Baskin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-free+click+chemistry+for+dynamic+in+vivo+imaging.">Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).</li></ol>

週間かかる、時間がかかる遺伝子工学プロシージャと対照をなしてここに示す簡単な 2 ステップとリガンドをターゲット癌を追加する、3 日間内に完了できるワンステップ化学の活用手順や蛍光検出色素 HEVNPs のシステイン/リスのサイトへ。テクニックを使用することができます候補者のプール、したがって合理的なコストと配信時に利用可能なペプチド/小分子合成サービスの活用から最高?...

治療および診断の配信、nanotheranostics、として知られているナノサイズのベクターの開発は、ターゲットを絞った配信1に向かって一般的な治療から生物医学分野の多くをシフトしています。Theranostic 分子安定的に特定の病気にかかったティッシュまたは生化学的経路2,3,4 theranostic 分子を直接にターゲットを絞った nanotheranostic 配信統合ナノサイズ ベクトル (ナノ粒子).ナノメディシンは、最適なサイズのナノ粒子 theranostic 分子の循環を安定し、病気にかかったティッシュの提示細胞表面分子を選択的にターゲットする能力を持っているので、ターゲットを絞った配信の最前線に来ています。まだ多くの nanotheranostic プラットフォーム パッシブ セル吸収, 事前に成熟し劣化、毒性、および theranostic 分子と不十分な協会に苦しみます。群集は、ターゲットを絞った配信でこれらの障害の多くを克服します。彼らは外国のエピトープを表示および/または小さい分子を提供するナノキャリアとして使用されている: 療法は多くの病気1を戦うために使用することができます。このアプリケーションのプロパティに主に依存する特定のエンドユーザのために設計されたアプリケーションを満たすために、遺伝の修正の容易さだけでなく、自己集合。遺伝子工学と比較して、VLP に異質ペプチドの化学的活用のための重要な利点を表示多種多様なペプチドやオリゴ糖、変調の群集の表面に共役するなどのエンティティをことができますので、柔軟 VLP アセンブリの変化なし。
組換え HEV キャプシド蛋白質、2ndオープンから派生した HEVNPs フレーム (ORF2) を読んで、非感染性、カプシド セルの結合、およびエントリの対応を自己組み立てます。粘膜感染の HEV が進化したので組み立てカプシド蛋白はプロテアーゼ、酸性の粘膜条件5同様に安定です。HEVNPs は、T の中空を形成レンダリング非常に安定したストレージと過酷な生理的条件の両方、ORF2 の 60 の同一ユニット6,7から成る、1 の正二十面体キャプシドを =。任意のウイルスの遺伝的要素に欠けている、効率的、高収率生産はバキュロ ウイルス昆虫細胞発現システムによって実現されます。蛋白分解性が高く、自己組織化 HEVNPs を抽出され、細胞培養上清より精製した必要な精製工程を大幅に削減します。さらに、HEVNPs は安定した正二十面体ベースに柔軟なヒンジを介して接続されている表面の露出した突起ドメイン (P ドメイン) を所有しています。P ドメインは、融通がきく蝶番は、大幅に基本の正二十面体構造を損なうことがなく P ドメインを変更することが可能、正二十面体ベースの上に表面に露出したスパイクを形成します。化学変調 60 対称サイトで 60 の繰り返し単位、1 つのサイト固有の変更結果します。最近では、提案するナノ プラットフォーム配位子または theranostic 用小分子化学的に共役することができます HEVNP を使用して。これは、マレイミド リンク ペプチドや分子と反応サイトとして単一のアミノ酸を HEV VLP の突起ドメインのシステインに置き換えることによって達成されました。HEV VLP とよく研究免疫原性エピトープ8,9の前の構造の分析に基づいて、次の 5 HEV VLP アミノ酸に置き換えられたシステイン潜在的な候補として: Y485C、T489C、S533C、N573C、T586C (図 1)。透過電子顕微鏡 (TEM) 観察 (図 2)、によって確認されたその VLP 形成発現と昆虫細胞から精製後、公開されているシステイン サイトは西部によって分析されたビオチンのマレイミド リンク後のしみ活用 (図 2)。5 つの変異体の間で HEVNP-573 C はマレイミド ビオチン活用 (図 2) の最も強い信号を表示され、フォロー アップ4 (図 3) をターゲット乳癌細胞のナノキャリアとしてデモに使用されました。
このプロトコルは、表面システイン共役を通じて腫瘍ターゲット分子を HEVNPs にアタッチする化学の活用方法を示しています。我々 は N573 でシステインを含む組換え HEVNPs と腫瘍腫瘍配信対象と検出分子の共役の詳細 (HEVNP-573 C)。ペプチド、LXY3010 HEVNPs にフォーム LXY30 HEVNP (図 4) 乳房癌腫瘍をバインドする 2 段階クリック化学接合過程に着目しました。その後、N hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 いた HEVNPs を構築する LXY30 HEVNP Cy5.5 蛍光検出の両方生体外で(図 5) で別の Lys サイトに共役と体内4 。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="984">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:391px;">MINI Dialysis Units, 10K MWCO</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:265px;">69572</td>
			<td style="width:167px;">mini dialysis unit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Five Cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B85502</td>
			<td>Tn5 cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SF9 Cells&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11496015</td>
			<td>Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11101, A11100</td>
			<td>Baculovirus expression system</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024</td>
			<td>Bacmid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ESF921 Insect Cell Media</td>
			<td>Expression Systems LLC</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td>insect cell media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy5.5 NHS ester, 5mg</td>
			<td>Lumiprobe Corp</td>
			<td>27020</td>
			<td>Cy5.5 NHS ester</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>87766</td>
			<td>spin desalting column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemical Co</td>
			<td>M8250-250G</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc</td>
			<td>Depends on Rotor</td>
			<td>ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NPO321BOX</td>
			<td>SDS protein gel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:391px;">EMS Glow Discharger</td>
			<td style="width:161px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td>glow discharger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface functionalization of hepatitis e virus nanoparticles using chemical conjugation methods

ウイルス様粒子 (群集) は、外国のエピトープを表示および/または小さな分子の検出と様々 な病気の治療を提供するナノキャリアとして使用されています。遺伝子組み換えは、自己組織化でこのアプリケーションが依存しているし、組換え群集の腫瘍を対象としたアプリケーションを満たすためにシステイン抱合に比べ遺伝的群集に外国のペプチッドの変更だけでも、化学の活用を提供しています、重要な利点の合成ペプチドやオリゴ糖、VLP アセンブリの変更することがなく、変調かつ柔軟に群集の表面に共役するためなどのエンティティの様々 なをことができますので。
ここでは、多機能配信キャリアとして肝炎 E ウイルス粒子 (HEVNP)、モジュール化された theranostic カプセルを使用する方法を示します。HEVNPs の機能には、組織を対象とした、イメージング、および治療薬デリバリーが含まれます。HEVNP の確立の構造調査に基づき、構造的に独立して表面に露出した残基は、チオール選択的リンケージを介してマレイミド リンク化学グループの活用サイトとしてシステイン置換に選ばれました。1 つの特定のシステイン変更 HEVNP (573 アスパラギン システイン交換 aa (HEVNP-573 C)) は乳房がん細胞特異リガンド、LXY30 共役し、近赤外線 (NIR) 蛍光色素 (Cy5.5) 腫瘍ターゲットのレンダリングにラベル付け効果的な診断カプセル (LXY30-HEVNP-Cy5.5) として HEVNPs。Theranostic 配信への応用可能性を探索するよく知られている原子の構造を持つ他の高分子複合体と同様のエンジニア リング戦略を採用できます。

HEV-群集に似ているすべて形成 HEVNPs 可溶性正二十面体のカプシドを変更し、したソリューションの製造及び精製中に集計はありません。シングル ステップ マレイミド ビオチン活用、Cys の各変更の前後に HEVNPs は否定的な汚れの EM (図 2) で HEV 群集から区別されました。マレイミド ビオチン活用効率 Cys 修正 HEVNPs 最初化学発光ストレプトアビジ...

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Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

我々 は、theranostic ナノ粒子 (HEVNP) として肝炎 E のウイルスのカプシド蛋白を設計しました。HEVNP 自己粘膜配信で安定した正二十面体のケージにアセンブルします。ここでは、表面に露出したシステインは、とりわけ腫瘍細胞を結合する配位子の合成を共役残基の変異を対象とした腫瘍に対する HEVNPs の変更について述べる。

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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