Name: surface functionalization of hepatitis e virus nanoparticles using chemical conjugation methods
Uploaded: 2018-05-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods at JoVE.com

Författarna erkänner sponsring av finansieringen till RHC av NIH bevilja #' s: AI095382, EB021230, CA198880, Institutet för livsmedel och jordbruk, samt programmet Finland Distinguished Professor.

1. HEVNP produktion i insekt celler
Obs: Alla följande steg bör utföras i en cell kultur huva. Se våra tidigare publicering för mer detaljerad HEVNP produktion förfaranden11.
<ol><li>Kultur Sf9 celler i insekt cell media (se Tabell för material) till 50-75% sammanflödet i 6 brunnar.</li>
	<li>Med insekt cell transfection reagens enligt tillverkarens protokollen, transfect Bacmids som innehåller HEVNP - 573 C ORF2 till Sf99 celler att producer...

<ol>
	<li>Ludwig, C., Wagner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-like+particles-universal+molecular+toolboxes.">Virus-like particles-universal molecular toolboxes.</a> Curr Opin Biotechnol. 18 (6), 537-545 (2007).</li><li>Galaway, F. A., Stockley, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MS2+viruslike+particles:+a+robust,+semisynthetic+targeted+drug+delivery+platform.">MS2 viruslike particles: a robust, semisynthetic targeted drug delivery platform.</a> Mol Pharm. 10 (1), 59-68 (2013).</li><li>Ma, Y., Nolte, R. J., Cornelissen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-based+nanocarriers+for+drug+delivery.">Virus-based nanocarriers for drug delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (9), 811-825 (2012).</li><li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+activatable+viral+capsid+functionalized+for+cancer+targeting.">Chemically activatable viral capsid functionalized for cancer targeting.</a> Nanomedicine (Lond). 11 (4), 377-390 (2016).</li><li>Jariyapong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+hepatitis+E+virus-like+particle+as+a+carrier+for+oral-delivery.">Chimeric hepatitis E virus-like particle as a carrier for oral-delivery.</a> Vaccine. 31 (2), 417-424 (2013).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+hepatitis+E+capsid+protein+self-assembles+into+a+dual-domain+T+=+1+particle+presenting+native+virus+epitopes.">Recombinant hepatitis E capsid protein self-assembles into a dual-domain T = 1 particle presenting native virus epitopes.</a> Virology. 265 (1), 35-45 (1999).</li><li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+elements+of+the+capsid+protein+for+self-assembly+into+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus.">Essential elements of the capsid protein for self-assembly into empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 79 (20), 12999-13006 (2005).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+hepatitis+E+virion-sized+particle+reveals+an+RNA-dependent+viral+assembly+pathway.">Structure of hepatitis E virion-sized particle reveals an RNA-dependent viral assembly pathway.</a> J Biol Chem. 285 (43), 33175-33183 (2010).</li><li>Xing, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+configuration+of+hepatitis+E+virus+antigenic+domain.">Spatial configuration of hepatitis E virus antigenic domain.</a> J Virol. 85 (2), 1117-1124 (2011).</li><li>Xiao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+characterization+of+a+high-affinity+and+high-specificity+peptide+ligand+LXY30+for+in+vivo+targeting+of+&#945;3+integrin-expressing+human+tumors.">Discovery and characterization of a high-affinity and high-specificity peptide ligand LXY30 for in vivo targeting of &#945;3 integrin-expressing human tumors.</a> EJNMMI research. 6 (1), (2016).</li><li>Li, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+self-assembly+of+empty+virus-like+particles+of+hepatitis+E+virus.">Expression and self-assembly of empty virus-like particles of hepatitis E virus.</a> J Virol. 71 (10), 7207-7213 (1997).</li><li>Peyret, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+the+gentle+purification+of+virus-like+particles+produced+in+plants.">A protocol for the gentle purification of virus-like particles produced in plants.</a> J Virol Methods. 225, 59-63 (2015).</li><li>Technologies, N. b. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Vol. MAN0007891 1-2. , (2013).</li><li>Baskin, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copper-free+click+chemistry+for+dynamic+in+vivo+imaging.">Copper-free click chemistry for dynamic in vivo imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (43), 16793-16797 (2007).</li></ol>

I motsats till det tidskrävande genteknik förfarandet, vilket tar vanligtvis veckor, här visar vi enkla two-step och one-step kemiska konjugation förfaranden, som kan slutföras inom 3 dagar, lägga till cancer inriktning ligand eller fluorescens upptäckt dye till Cys/Lys platser i HEVNPs. Tekniken kan användas till skärm för bästa ligand målet från en pool av kandidater, och därmed drar fördel av tillgängliga peptid/liten molekyl syntes tjänster på en rimlig kostnad och leverans tid.
<p class="jove_c...

Utvecklingen av nanostorlek vektorer i terapeutiska och diagnostiska leverans, känd som nanotheranostics, har skiftat mycket av det biomedicinska fältet från generaliserad behandlingar mot riktade leverans1. Riktade nanotheranostic leverans integrerar nanostorlek vektorer (nanopartiklar) med theranostic molekyler stabilt direkt theranostic molekyler till en specifik sjuk vävnad eller biokemisk väg2,3,4 . Nanomedicin har kommit i förgrunden för riktade leverans eftersom optimalt storlek nanopartiklarna har kapacitet att stabilisera cirkulationen av theranostic molekyler och selektivt rikta cell surface molekyler presenteras på sjuka vävnader. Många nanotheranostic plattformar är fortfarande lider av passiv cell upptag, pre mogen nedbrytning, toxicitet och otillräcklig association med theranostic molekyler. Framställda övervinna många av dessa hinder i riktade leverans. De har använts som nanocarriers för att Visa utländska epitoper och/eller leverera små molekyler: en regim som kan användas för att bekämpa många sjukdomar1. Denna ansökan är främst beroende av egenskapen för självmontering samt användarvänlighet genetiska modifieringar, att uppfylla utformad ansökan om den givna VLP. Jämfört med genteknik, kemiska Konjugation av främmande peptider till VLP visar en betydande fördel eftersom den tillåter en stor mängd enheter, t ex peptider eller oligosackarider, att vara konjugerat till ytan av framställda i en modulerad och flexibelt sätt utan ändring av VLP församling.
HEVNPs, härrör från det rekombinanta HEV kapsid proteinet, 2nd öppen läsa frame (ORF2), är icke-infektiös, självmonterande förhoppningsvis kan cell-bindande och posten. Eftersom HEV utvecklats för slemhinnor överföring, är monterade kapsid protein likaså stabilt i proteolytiska och sura slemhinnor villkor5. HEVNPs bildar en ihålig, T = 1 ikosaedrisk kapsid, består av 60 identiska enheter6,7 i ORF2, gör den mycket stabil både lagring och fysiologiska förhållanden. Saknar någon virus genetiska element, uppnås effektiv, hög avkastning produktionen genom baculoviridae uttryck systemet i insekt celler. På grund av deras proteolytiska stabilitet, själv monterade HEVNPs extraheras och renas från cell supernatanten, avsevärt minska nödvändiga reningssteg. HEVNPs besitter dessutom en yta exponerad utstick domänen (P) ansluten via ett flexibelt gångjärn till en stabil ikosaedriska bas. P domänen bildar ytan-utsatt spikar ovanpå ikosaedriska basen medan den flexibla gångjärnen gör det möjligt att avsevärt ändra domänen P utan att kompromissa med bas ikosaedrisk struktur. Med 60 upprepade enheter, enda platsspecifika modifiering resulterar i 60 symmetriska platser för kemiska modulering. Nyligen har vi föreslagit en nano-plattform med hjälp av HEVNP som kan kemiskt pneumokocker ligander eller små molekyler för theranostic applikationer. Detta uppnåddes genom att ersätta en enda aminosyra med cystein på domänen utstick av HEV-VLP som en reaktion webbplats med maleimide-länkade peptider eller molekyler. Baserat på tidigare strukturella analysen av HEV-VLP och väl studerat immunogent epitoper8,9, de följande fem HEV-VLP aminosyrorna ersattes med cystein som potentiella kandidater: Y485C, T489C, S533C, N573C och T586C ( Figur 1). Efter uttryck och rening från insekt celler, bekräftades deras VLP formationer av överföring elektronmikroskopi (TEM) observation (figur 2), och de exponerade cystein platserna analyserades genom Western blot efter maleimide-länkade biotin konjugering (figur 2). Bland fem mutanter, HEVNP - 573C visas den starkaste signalen för maleimide-biotin konjugation (figur 2) och användes för uppföljning demonstration som nanocarrier för bröstcancer cancercell inriktning4 (figur 3).
Detta protokoll skildrar kemiska konjugation metoder om du vill bifoga tumör-targeting molekyler HEVNPs genom ytan cystein konjugation. Vi detalj konjugationen av tumör inriktning och upptäckt molekyler för tumör leverans med rekombinant HEVNPs som innehåller en cystein på N573 (HEVNP - 573C). Vi fokuserade på en klick kemi konjugation tvåstegsprocess att binda en breast cancertumör inriktning peptid, LXY3010 till HEVNPs att bilda LXY30-HEVNP (figur 4). Därefter, N-hydroxysuccimide (NHS)-Cy5.5 var konjugerat till webbplatsen separat Lys på HEVNPs att bygga LXY30-HEVNP-Cy5.5 för fluorescerande upptäckt både in vitro- (figur 5) och i vivo4.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="984">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:391px;">MINI Dialysis Units, 10K MWCO</td>
			<td style="width:161px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:265px;">69572</td>
			<td style="width:167px;">mini dialysis unit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">High Five Cells</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B85502</td>
			<td>Tn5 cells</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SF9 Cells&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11496015</td>
			<td>Sf9 cells</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A11101, A11100</td>
			<td>Baculovirus expression system</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:23px;">Bac-to-Bac Baculovirus Expression System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10359-016, 10360-014, 10584-027, 10712-024</td>
			<td>Bacmid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ESF921 Insect Cell Media</td>
			<td>Expression Systems LLC</td>
			<td>96-001-01</td>
			<td>insect cell media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cy5.5 NHS ester, 5mg</td>
			<td>Lumiprobe Corp</td>
			<td>27020</td>
			<td>Cy5.5 NHS ester</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeba Spin Desalting Columns, 40K MWCO, 0.5 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>87766</td>
			<td>spin desalting column</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MES Hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich Chemical Co</td>
			<td>M8250-250G</td>
			<td>MES</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ultra-Clear Centrifuge Thinwall Ultra-Centrifuge Tubes</td>
			<td>Beckman Coulter, Inc</td>
			<td>Depends on Rotor</td>
			<td>ultracentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NuPage 4-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>NPO321BOX</td>
			<td>SDS protein gel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellfectin II Reagent</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10362100</td>
			<td>transfection reagent</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:391px;">EMS Glow Discharger</td>
			<td style="width:161px;">Electron Microscopy Science</td>
			<td style="width:265px;"></td>
			<td>glow discharger</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

surface functionalization of hepatitis e virus nanoparticles using chemical conjugation methods

Virusliknande viruslika partiklar har använts som nanocarriers för att Visa utländska epitoper och/eller leverera små molekyler i identifiering och behandling av olika sjukdomar. Detta program bygger på genetisk modifiering, självmontering, och cystein konjugation att uppfylla tumör-targeting tillämpningen av rekombinant framställda. jämfört med genetisk modifiering ensam, kemiska Konjugation av främmande peptider till framställda erbjuder en betydande fördel eftersom det tillåter en mängd enheter, såsom syntetiska peptider eller oligosackarider, att vara konjugerat till ytan av framställda på en modulerad och flexibelt sätt utan ändring av sammansättningen VLP.
Här visar vi hur du använda hepatit E virus nanopartikelportföljen (HEVNP), en modulariserade theranostic kapsel, som multifunktionella leverans bärare. HEVNPs funktioner inkluderar vävnad-targeting, imaging och terapeutiska leverans. Baserat på väletablerade strukturella forskning av HEVNP, valdes strukturellt oberoende och surface-exponerade rester för cystein ersättare som konjugation platser för maleimide-länkade kemiska grupper via thiol-selektiv kopplingar. Ett särskilt cystein-modifierat HEVNP (Cys återinsättande av asparagin på 573 aa HEVNP - 573C) var konjugerat till en breast cancer cell-specifik ligand, LXY30 och märkt med nära infraröd (NIR) fluorescens färgämne (Cy5.5), återgäldande den tumör-riktade HEVNPs som effektiva diagnostiska kapslar (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Liknande engineering strategier kan användas med andra makromolekylärt komplex med välkända atomära strukturer att utforska potentiella tillämpningar i theranostic leverans.

Besläktad med HEV-framställda, alla Cys modifierade HEVNPs bildas lösliga ikosaedriska förhoppningsvis och samlade inte i lösning under produktion eller rening. Innan och efter steg maleimide-biotin konjugation, vart och ett av Cys ändrat var HEVNPs omöjlig att skilja från HEV-framställda i negativa fläcken EM (figur 2). Maleimide-biotin konjugation effektivitet till Cys modifierade HEVNPs testades först med Western blotting via Kemiluminiscens str...

Watch this Scientific Journal Video about Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods at JoVE.com

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Ytan funktionalisering av hepatit E Virus nanopartiklar med kemiska konjugation metoder

Vi har konstruerat det kapsid proteinet av hepatit E-virus som en theranostic nanopartiklar (HEVNP). HEVNP monterar själv in i en stabil ikosaedriska bur i slemhinnor leverans. Här, beskriver vi ändring av HEVNPs för tumör inriktning av muterar yta-exponerade rester till cysteines, som konjugat syntetiska ligander som specifikt binder tumörceller.

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Metodutveckling för blodburna Makrofag Transport av Nanoformulated antiretrovirala läkemedel

Nanoformulated drugs can improve pharmacodynamics and bioavailability while serving also to reduce drug toxicities for antiretroviral (ART) medicines. To ...

Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

Mjuk Litografiska funktionalisering och mönstring oxid-fri Silicon och germanium

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Skörd Murina alveolära makrofager och utvärdera cellulär aktivering inducerad av polyanhydrid Nanopartiklar

Biodegradable nanoparticles have emerged as a  versatile platform for the design and implementation of new intranasal vaccines  against respiratory ...

Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Analysera Cellulär internalisering av Nanopartiklar och bakterier genom att multispektralt Imaging Flow Cytometry

Nanoparticulate  systems have emerged as valuable tools in vaccine delivery through their  ability to efficiently deliver cargo, including proteins, to ...

High-throughput Synthesis of Carbohydrates and Functionalization of Polyanhydride Nanoparticles

Hög kapacitet Syntes av kolhydrater och Funktionalisering av polyanhydrid Nanopartiklar

Transdisciplinary approaches involving areas such as material design, nanotechnology, chemistry, and immunology have to be utilized to rationally design ...

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

Att göra konjugation-inducerad fluorescerande pegylerat virusliknande partiklar av Dibromomaleimide-disulfid kemi

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

Omfattande utvärdering av effektiviteten och säkerheten av Placenta-Targeted Drug Delivery med tre kompletterande metoder

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

Flash NanoPrecipitation för inkapsling av hydrofoba och hydrofil föreningar i polymera nanopartiklar

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Preparation of Neutrally-charged, pH-responsive Polymeric Nanoparticles for Cytosolic siRNA Delivery

Beredning av Neutrally laddade, pH-lyhörd polymera nanopartiklar för Cytosolic siRNA leverans

The success of siRNA as a targeted molecular medicine is dependent upon its efficient cytosolic delivery to cells within the tissue of pathology. Clinical ...