Name: single-cell photoconversion in living intact zebrafish
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish at JoVE.com

Vi takker Bernard Kulemaka og medlemmer af Smith lab for deres nyttige bemærkninger og reagens vejledning, Sam Connell og Brent Redford af 3i for fielding imaging spørgsmål og Deborah Bang, Karen Heed og Kay Stewart for zebrafisk pleje. Dette arbejde blev støttet af University of Notre Dame, Elizabeth og Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation, Center for zebrafisk forskning på University of Notre og centrum af stamceller og regenerativ medicin ved University of Notre Dame. Alle animalske undersøgelser blev udført i overensstemmelse med University of Notre Dame IACUC til Dr. Cody Smith.

Alle dyreforsøg blev godkendt af University of Notre Dame institutionelle Animal Care og brug udvalget.
1. forberedelse af zebrafisk model
<ol><li>Placer en voksen mand og en voksen kvinde Tg (konvertible protein) i en parring kammer per standard procedurer13. I dette håndskrift, bruge Tg(sox10:eos) fisk9 på grund af adgang, men andre transgene linjer med photoconvertible protein kan bruges lige så. Oprette mere end ét kammer i tilfælde a...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system.">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li><li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-mediated+delivery+of+the+green+fluorescent+protein+to+the+endoplasmic+reticulum+of+plant+cells.">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EosFP,+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion.">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (45), 15905-15910 (2004).</li><li>Maurel, D., Banala, S., Laroche, T., Johnsson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+and+Photoconvertible+Fluorescent+Probes+for+Protein+Labeling.">Photoactivatable and Photoconvertible Fluorescent Probes for Protein Labeling.</a> ACS Chem Biol. 5 (5), 507-516 (2010).</li><li>Terskikh, A., Fradkov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&amp;#34;Fluorescent+timer&amp;#34;:+protein+that+changes+color+with+time.">&amp;#34;Fluorescent timer&amp;#34;: protein that changes color with time.</a> Science. 290 (5496), 1585-1588 (2000).</li><li>McGraw, H. F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling.">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li><li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone.">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).</li><li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment.">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li><li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones.">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development.">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li></ol>

I komplekse væv organisere særskilt celletyper i bestemte domæner. Seneste har teknikker været udnyttet til etiketten individuelle celler inden for disse store væv strukturer1,2,3. Her viser vi to teknikker, der kan ligeledes udnyttes til at visualisere både enkelt celle interaktioner og celle befolkning interaktioner i komplekse væv. Fordelen ved photoconversion teknikken er fysisk kontrol videnskabsmanden har tydeligt m...

Flere forskellige celler interagere at opbygge og opretholde komplekse dyre- og plantearter væv. Disse celler er ofte indtrængere og vanskelige at skelne fra naboer på en enkelt celle niveau uden høj opløsning mikroskopi, der kræver fiksering af væv. Men for at forstå, hvordan disse væv form, er fastholdt, og blive syge, det har været nødvendigt at undersøge, hvordan enkelt celler inden for væv interagerer over tid. Ideelt, kræver disse eksperimenter, mærkning af enkelt celler i et væv i en ikke-invasiv måde uden kravet om fiksering. Forskere har nu udviklet mange teknikker til at udføre denne opgave1,2,3,4.
Opdagelsen af og gennemførelse af vandmænd grøn fluorescerende proteiner (NGL) var en spændende tilgang, der er tilladt for mærkning af forskellige celler i en væv miljø1. Via celle-specifikke initiativtagere, er det muligt at genetisk vælge et undersæt af celler, der er mærket1. Alternativt, viral induceret udtryk for normal god landbrugspraksis kan udnyttes til bruger-valgte udtryk for normal god landbrugspraksis3,4. Selvom ganske nyttigt, tillader genetiske medieret udtryk for normal god landbrugspraksis ikke brugervalgte udtryk inden for en delmængde af celler i vævet; og viral udtryk for normal god landbrugspraksis, selv om fordelagtige, kan være invasive. Med fremkomsten af normal god landbrugspraksis derivater og smarte teknikker som Brainbow til at udtrykke forskellige fluorescerende proteiner mere sparsomt i væv, er det blevet muligt at visualisere enkelt celler og interaktioner blandt dem i komplekse væv2, 5. men disse tilgange label celler i en tilfældig måde. Hvis den ønskede eksperiment kræver visualisering af en enkelt celle eller befolkning af celler, der er defineret af eksperimentatoren, er de derfor begrænset. Med sådanne eksperimenter, ville det være en fordel at have en genetisk udtrykt fluorescerende proteiner, der kan manipuleres til at skelne, i en enkelt celle mode, det fra andre fluorescerende og ikke-fluorescerende celler.
For at nå dette mål og Visualiser cellebiologi af enkelt celler i et komplekst levende væv, bruger det videnskabelige samfund enkelt celle photoconversion af forskellige fluorescerende proteiner6,7,8. Ved hjælp af genetisk kontrolleret udtryk for en photoconvertible protein (i.e., eos, kaede, osv.), der overgange fra en grøn til rød fluorescerende tilstand når den udsættes for UV (488 nm) lys, vi kan skelne en enkelt celle fra sin fluorescently mærket naboer6,7,8. Denne metode udnytter et apparat, der er knyttet til vores Konfokal mikroskop, som kan direkte lys fra en laser stak en diffraktion-begrænset region af interesse. Med denne teknik, kan vi enten mærke enkelt celler eller større populationer i en brugerdefineret måde9,10,11. Teknikken er minimalt invasiv sammenlignet med enkelt celle injektioner af viral normal god landbrugspraksis. Som en proof of concept viser vi, at vi kan photoconvert enkelt celler i en ganglion i de perifere nervesystem og photoconvert større befolkningsgrupper, som cellerne ligger på den ventrale side af rygmarven9,10, 11,12. Vi kan derefter visualisere disse photoconverted cellepopulationer 24 timer senere for at få indblik i deres bevægelse og differentiering under udvikling.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1846">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt;width:320pt" width="427">Tg(sox10:eos) zebrafish animals</td>
			<td style="width:125pt" width="167"></td>
			<td style="width:85pt" width="113"></td>
			<td style="width:854pt" width="1139">Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">100 X 15 mm petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">0.8% Low Melting Point Agarose</td>
			<td>dot scientific inc</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>14021-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Needle dissecting probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)</td>
			<td>Fluka analytical</td>
			<td>A5040-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters</td>
			<td>Zeiss Axiozoom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets</td>
			<td>3i spinning disk confocal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">UV light source (laser) for photoconversion</td>
			<td>405 nm laser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Slidebook software</td>
			<td>3i</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Methylene blue</td>
			<td>Kordon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell photoconversion in living intact zebrafish

Dyre- og plantearter væv er sammensat af forskellige populationer af celler. Disse celler interagerer over tid at opbygge og vedligeholde væv og kan forårsage sygdom når forstyrret. Forskere har udviklet smarte teknikker til at undersøge karakteristika og naturlige dynamik i disse celler i intakt væv ved at udtrykke fluorescerende proteiner i delmængder af celler. Dog til tider kræver eksperimenter mere valgte visualisering af celler inden for væv, undertiden på den encellede eller befolkning af celler måde. For at opnå dette og visualisere enkelt celler i en befolkning på celler, har forskere udnyttet encellede photoconversion af fluorescerende proteiner. For at demonstrere denne teknik, viser vi her hvordan direkte UV-lys til et Eos-udtrykker celle af interesse i en intakt, lever zebrafisk. Vi image derefter disse photoconverted Eos+ celler 24 timer senere for at afgøre, hvordan de ændrede i vævet. Vi beskrive to teknik: enkelt celle photoconversion og photoconversions af populationer af celle. Disse teknikker kan bruges til at visualisere celle-celle interaktioner, celle-skæbne og differentiering og celle migrationer, hvilket gør det en teknik, der er gældende i mange biologiske spørgsmål.

Photoconversion af fluorescerende proteiner kan bruges til at mærke forskellige celler i en væv6. For at demonstrere dette, blev Tg(sox10:eos) fisk9 brugt til at udtrykke photoconvertible protein Eos under de regulerende sekvenser af sox10. Tg(sox10:eos) dyr på 48 hpf blev først monteret, og derefter afbildet for at afsløre eventuelle ikke-specifikke photoconversion, der kan være opstået. Eos uomvendte fluor...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish at JoVE.com

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Vi præsenterer her, en protokol for at vise, hvordan cellen photoconversion er opnået gennem UV eksponering for specifikke områder at udtrykke de fluorescerende proteiner, Eos, med levende dyr.

Encellede Photoconversion i levende intakt zebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Måling Protein Stabilitet i Living zebrafisk embryoner anvendelse af fluorescens Decay Efter fotoomdannelse (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse af zebrafisk Larver Skeletmuskel Integritet med Evans blå farvestof

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging Subcellulære Strukturer i Living Zebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Cleared Embryonale og postnatal hjerter på Single-celle Opløsning

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membran Potential i Live Zebrafish Embryoer

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion af hypoxi i levende frø og zebrafiskembryoner

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Følgende endokardial væv bevægelser via celle Photoconversion i zebrafisk Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Encellede transkriptom analyser af mus i bugspytkirtlen endokrine celler

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Mikroinjektion af DNA i øjen knopper i xenopus laevis embryoner og billeddannelse af Gfp udtrykker optiske Axonal Arbors i intakt, levende xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Visualisere den udviklende hjerne i levende zebrafisk ved hjælp af Brainbow og Time-lapse Konfokal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...