Name: single-cell photoconversion in living intact zebrafish
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00
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Nous remercions les membres du laboratoire Smith pour leurs commentaires utiles et les conseils de réactif, Sam Connell et Brent Redford de 3i pour mise en service d’imagerie questions et Deborah Bang, Karen Heed et Kay Stewart pour les soins de poisson-zèbre et Bernard Kulemaka. Ce travail a été soutenu par l’Université de Notre Dame, le Elizabeth et Michael Gallagher Family, l’Alfred P. Sloan Foundation, Centre pour la recherche de poisson-zèbre à l’Université de notre-Dame et le Centre des cellules souches et médecine régénérative à l’Université de Notre Dame. Toutes les études animales ont été effectuées dans le respect de l’Université de Notre Dame IACUC au docteur Cody Smith.

Toutes les études animales ont été approuvés par l’Université de Notre Dame institutionnels et animalier Comité d’urbanisme.
1. préparation de l’éprouvette de poisson-zèbre
<ol><li>Placez un mâle adulte et un adulte femelle Tg (protéine convertible) dans une chambre accouplement par procédures standard13. Dans ce manuscrit, utilisez Tg(sox10:eos) poisson9 en raison de l’accès mais autres lignées transgéniques avec les pro...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system.">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li><li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-mediated+delivery+of+the+green+fluorescent+protein+to+the+endoplasmic+reticulum+of+plant+cells.">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li><li>Day, R. N., Davidson, M. 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F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling.">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li><li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone.">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).</li><li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment.">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li><li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones.">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development.">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li></ol>

Dans les tissus complexes, différents types de cellules organisent dans des domaines spécifiques. Récemment, des techniques ont été utilisées pour marquer les cellules individuelles au sein de ces tissus de grandes structures1,2,3. Nous démontrons ici deux techniques qui peuvent de même être utilisées pour visualiser les interactions cellulaires unique et interactions entre population de cellules dans les tissus comple...

Plusieurs cellules distinctes interagissent pour construire et entretenir des tissus animaux et végétaux complexes. Ces cellules sont souvent intercalés et difficiles à distinguer des voisins au niveau unicellulaire sans microscopie haute résolution qui nécessitent la fixation du tissu. Cependant, pour comprendre comment ces forment les tissus, sont maintenus et deviennent malades, il a été essentiel pour étudier comment simple cellules dans les tissus sont en interaction avec le temps. Idéalement, ces expériences exigent l’étiquetage des cellules individuelles au sein d’un tissu, d’une manière non invasive sans l’exigence de fixation. Les scientifiques ont maintenant développé de nombreuses techniques pour accomplir cette tâche1,2,3,4.
La découverte et la mise en œuvre de la protéine fluorescente méduse verte (GFP) était une approche passionnante qui a permis pour l’étiquetage des cellules distinctes dans un tissu environnement1. À l’aide de promoteurs spécifiques des cellules, il est possible de sélectionner génétiquement un sous-ensemble de cellules qui sont étiquetés1. Alternativement, expression induite virale de GFP peut être utilisée pour expression sélectionné par l’utilisateur de GFP3,4. Bien que très utile, expression génétique de médiation de GFP ne permet pas d’expression sélectionné par l’utilisateur dans un sous-ensemble de cellules dans les tissus ; et l’expression virale de GFP, bien qu’avantageuse, peut être envahissante. Avec l’avènement des dérivés de la GFP et habiles techniques comme Brainbow pour exprimer les protéines fluorescentes distinctes plus faiblement dans les tissus, il est devenu possible de visualiser les cellules individuelles et les interactions entre eux en tissu complexe2, 5. Toutefois, ces approches étiqueter les cellules de façon aléatoire. Si l’expérience désirée exige la visualisation d’une seule cellule ou d’une population de cellules qui est définie par l’expérimentateur, elles sont donc limitées. Avec de telles expériences, il serait avantageux d’avoir une protéine fluorescente génétiquement explicite qui peut être manipulée pour distinguer, d’une façon unique cellule, d’autres cellules fluorescentes et non fluorescent.
Pour atteindre cet objectif et visualiser la biologie cellulaire de cellules individuelles au sein d’un tissu vivant complexe, la communauté scientifique utilise seule cellule photoconversion distinctes de protéines fluorescentes6,7,8. Vous utilisez génétiquement contrôlé d’expression d’une protéine et (c.-à-d., eos, kaede, etc.) qui passe du vert au rouge État fluorescente lorsqu’ils sont exposés aux UV (488 nm) léger, on distingue une seule cellule de ses fluorescent étiquetés voisins6,7,8. Cette approche utilise un appareil attaché à notre microscope confocal qui peut diriger la lumière d’une pile de laser à une région limitée par la diffraction d’intérêt. Avec cette technique, nous pouvons soit l’étiquette cellules individuelles ou des populations plus importantes dans une manière définie par l’utilisateur9,10,11. La technique est peu invasive par rapport à des injections de cellule unique de GFP virale. Comme une preuve de concept, nous montrons que nous pouvons photoconvert des cellules individuelles au sein d’un ganglion dans le système nerveux périphérique et de la photoconvert des populations plus importantes comme les cellules situées sur la face ventrale de la moelle épinière9,10, 11,12. Ensuite, nous pouvons visualiser ces populations de cellules photoconverted 24h plus tard pour avoir un aperçu de leur mouvement et de la différenciation au cours du développement.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1846">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt;width:320pt" width="427">Tg(sox10:eos) zebrafish animals</td>
			<td style="width:125pt" width="167"></td>
			<td style="width:85pt" width="113"></td>
			<td style="width:854pt" width="1139">Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">100 X 15 mm petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">0.8% Low Melting Point Agarose</td>
			<td>dot scientific inc</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>14021-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Needle dissecting probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)</td>
			<td>Fluka analytical</td>
			<td>A5040-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters</td>
			<td>Zeiss Axiozoom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets</td>
			<td>3i spinning disk confocal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">UV light source (laser) for photoconversion</td>
			<td>405 nm laser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Slidebook software</td>
			<td>3i</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Methylene blue</td>
			<td>Kordon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell photoconversion in living intact zebrafish

Des tissus animaux et végétaux sont composée de populations distinctes de cellules. Ces cellules interagissent au fil du temps pour bâtir et maintenir les tissus et peuvent provoquer des maladies lorsque perturbés. Les scientifiques ont développé des techniques intelligents afin d’étudier les caractéristiques et la dynamique naturelle de ces cellules dans les tissus intacts en exprimant des protéines fluorescentes en sous-ensembles de cellules. Toutefois, à certains moments, expériences nécessitent plus sélectionnée visualisation des cellules dans les tissus, parfois à la manière monocellulaires ou population-de-cells. Pour atteindre cet objectif et visualiser les cellules individuelles au sein d’une population de cellules, les scientifiques ont utilisé unicellulaires photoconversion de protéines fluorescentes. Pour illustrer cette technique, nous montrons ici comment diriger la lumière UV à une cellule exprimant l’Eos d’intérêt dans un état intact, vit le poisson-zèbre. Nous avons ensuite image ces cellules de Eos+ photoconverted 24 h plus tard pour déterminer comment ils ont changé dans le tissu. Nous décrivons deux techniques : simple cellule photoconversion et photoconversions des populations de cellules. Ces techniques permettent de visualiser les interactions cellule-cellule, cellule-destin et différenciation et les migrations cellulaires, ce qui en fait une technique qui s’applique à nombreuses questions biologiques.

Photoconversion de protéines fluorescentes peut être utilisée pour étiqueter des cellules distinctes au sein d’un tissu6. Pour illustrer cela, Tg(sox10:eos) poisson9 ont été utilisés pour exprimer la protéine et Eos sous les séquences régulatrices de sox10. Les animaux Tg(sox10:eos) à 48 hpf ont monté tout d’abord et ensuite imagés pour détecter n’importe quel photoconversion non spécifique qui...

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Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Nous présentons ici un protocole pour montrer comment cellule photoconversion est réalisée grâce à l’exposition aux UV dans des zones spécifiques exprimant la protéine fluorescente, Eos, chez les individus vivants.

Photoconversion cellule unique chez le poisson zèbre Intact de la vie

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Mesure de la stabilité des protéines dans le salon embryons de poissons zèbres en utilisant la fluorescence Decay Après Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Recherche

Biologie du développement

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse des Muscle intégrité poisson zèbre larves squelettique avec colorant bleu Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Effacé embryonnaire et postnatal coeurs à la résolution unicellulaire

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Potentiel de membrane de neurones moteurs dans les embryons vivants de zébrés

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induction de l&#39;hypoxie dans les écrevisses vivantes de grenouille et de poisson zèbre

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Mouvements de tissu endocardique suivant via Photoconversion de cellules dans l’embryon de poisson zèbre

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Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Analyse transcriptomique unicellulaire de cellules endocrines pancréatiques de souris

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection d'ADN dans eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Visualiser le cerveau en développement dans le poisson zèbre vivant à l’aide de Brainbow et Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...