Name: single-cell photoconversion in living intact zebrafish
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00
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Grazie a Bernard Kulemaka e membri del lab Smith per loro utili commenti e guida di reagente, Sam Connell e Brent Redford di 3i per mettere in campo imaging domande e Deborah Bang, Karen Heed e Kay Stewart per la cura di zebrafish. Questo lavoro è stato supportato dall'Università di Notre Dame, l'Elizabeth e Michael Gallagher Family, la Fondazione Alfred P. Sloan, Centro Zebrafish ricerca presso l'Università di Notre e centro di cellule staminali e medicina rigenerativa presso l'Università di Notre Dame. Tutti gli studi sugli animali sono stati fatti in conformità con la University of Notre Dame IACUC al Dr. Cody Smith.

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Università di Notre Dame istituzionali Animal Care e Comitato di uso.
1. preparazione del campione di Zebrafish
<ol><li>Posizionare un maschio adulto e un adulto femmina Tg (convertibile della proteina) in una camera di accoppiamento per le procedure standard13. In questo manoscritto, utilizzare Tg(sox10:eos) pesce9 a causa di accesso ma altre linee transgeniche con fotoconvertibile della...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Goins, W. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li></ol>

In tessuti complessi, distinti tipi di cellule si organizzano in domini specifici. Recentemente sono state utilizzate tecniche a singole celle etichetta all'interno di queste strutture di grande tessuto1,2,3. Qui dimostriamo due tecniche che possono essere utilizzate allo stesso modo per visualizzare interazioni cellula singola e interazioni di popolazione delle cellule all'interno di tessuti complessi. Il vantaggio della tecnic...

Più celle distinte interagiscono per costruire e mantenere complessi tessuti animali e vegetali. Queste cellule sono spesso intercalati e difficili da distinguere dai vicini a livello di singola cellula senza microscopia ad alta risoluzione che richiedono la fissazione del tessuto. Tuttavia, per capire come questi si formano tessuti, sono mantenuti e diventare malato, è stato fondamentale per indagare come singole cellule all'interno del tessuto interagisce nel corso del tempo. Idealmente, questi esperimenti richiedono l'etichettatura delle singole cellule all'interno di un tessuto in maniera non invasiva, senza l'obbligo di fissazione. Gli scienziati ora hanno sviluppato numerose tecniche per realizzare questo compito1,2,3,4.
L'individuazione e l'attuazione della proteina fluorescente Medusa verde (GFP) è stato un approccio emozionante che ha permesso per l'etichettatura di cellule distinte in un tessuto ambiente1. Utilizzando promotori di cellula-specifico, è possibile selezionare geneticamente un sottoinsieme delle cellule che sono classificati come1. In alternativa, l'espressione virale indotta di GFP può essere utilizzato per utente-selezionato espressione della GFP3,4. Anche se molto utile, espressione genetica mediata di GFP non consente l'espressione selezionata dall'utente all'interno di un sottoinsieme delle cellule nel tessuto; e l'espressione virale di GFP, sebbene vantaggioso, può essere invasivo. Con l'avvento di GFP derivati e tecniche intelligente come Brainbow di esprimere distinte proteine fluorescenti più scarsamente all'interno dei tessuti, è diventato possibile visualizzare singole cellule e le interazioni tra loro nel complesso tessuto2, 5. Tuttavia, questi approcci marcare le cellule in modo casuale. Se l'esperimento desiderata richiede la visualizzazione di una singola cella o popolazione di cellule che è definita dallo sperimentatore, pertanto sono limitati. Con tali esperimenti, sarebbe vantaggioso avere una proteina fluorescente geneticamente espressa che può essere manipolata per distinguere, in maniera singola cella, e da altre cellule fluorescenti e non fluorescenti.
Per raggiungere questo obiettivo e visualizzare la biologia cellulare di cellule singole all'interno di un tessuto vivente complesso, la comunità scientifica utilizza fotoconversione unicellulare di distinte proteine fluorescenti6,7,8. Espressione di una proteina di fotoconvertibile (cioè, eos, kaede, ecc.) che passa dal verde al rosso fluorescente stato quando esposto ai raggi UV con geneticamente controllata (488 nm) luce, possiamo distinguere una singola cella da sua fluorescente contrassegnati i vicini6,7,8. Questo approccio utilizza un apparecchio attaccato al nostro microscopio confocale che possa indirizzare la luce da una pila di laser a una regione di diffrazione limitata di interesse. Con questa tecnica, possiamo etichettare o singole cellule o più grandi popolazioni in un modo definito dall'utente9,10,11. La tecnica è mini-invasiva rispetto alle iniezioni di singola cellula di GFP virale. Come un proof of concept, mostriamo che possiamo fotoconvertita singole cellule all'interno di un ganglio nel sistema nervoso periferico e fotoconvertita più grandi popolazioni come cellule situate sul lato ventrale del midollo spinale9,10, 11,12. Quindi possiamo visualizzare queste popolazioni di cellule photoconverted 24 h più tardi per guadagnare la comprensione nel loro movimento e la differenziazione durante lo sviluppo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1846">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt;width:320pt" width="427">Tg(sox10:eos) zebrafish animals</td>
			<td style="width:125pt" width="167"></td>
			<td style="width:85pt" width="113"></td>
			<td style="width:854pt" width="1139">Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">100 X 15 mm petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">0.8% Low Melting Point Agarose</td>
			<td>dot scientific inc</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>14021-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Needle dissecting probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)</td>
			<td>Fluka analytical</td>
			<td>A5040-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters</td>
			<td>Zeiss Axiozoom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets</td>
			<td>3i spinning disk confocal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">UV light source (laser) for photoconversion</td>
			<td>405 nm laser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Slidebook software</td>
			<td>3i</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Methylene blue</td>
			<td>Kordon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell photoconversion in living intact zebrafish

Tessuto animale e vegetale è composto da popolazioni distinte delle cellule. Queste cellule interagiscono nel tempo per costruire e mantenere il tessuto e possono causare la malattia quando perturbato. Gli scienziati hanno sviluppato tecniche intelligente per studiare le caratteristiche e dinamiche naturali di queste cellule all'interno del tessuto intatto esprimendo proteine fluorescenti in sottopopolazioni di cellule. Tuttavia, a volte, gli esperimenti richiedono più selezionato visualizzazione delle cellule all'interno del tessuto, a volte alla maniera unicellulare o popolazione di cellule. Per raggiungere questo obiettivo e visualizzare le singole celle all'interno di una popolazione di cellule, gli scienziati hanno utilizzato fotoconversione unicellulare di proteine fluorescenti. Per illustrare questa tecnica, vi mostriamo qui come dirigere la luce UV a una cella che esprimono Eos di interesse in un intatto, vivono zebrafish. Abbiamo quindi immagine quelle cellule di Eos+ photoconverted 24 h più successivamente per determinare come sono cambiate nel tessuto. Descriviamo due tecniche: singola cella fotoconversione e photoconversions delle popolazioni della cellula. Queste tecniche possono essere utilizzate per visualizzare le interazioni cellula-cellula, cellula-destino e differenziazione e migrazioni delle cellule, che lo rende una tecnica che è applicabile a numerose domande biologiche.

Fotoconversione di proteine fluorescenti può essere utilizzato per marcare le cellule distinte all'interno di un tessuto6. Per dimostrare questo, Tg(sox10:eos) pesce9 sono stati utilizzati per esprimere la proteina fotoconvertibile Eos sotto le sequenze regolatrici di sox10. Gli animali di Tg(sox10:eos) 48 hpf erano prima montato e poi ripreso per rilevare qualsiasi fotoconversione aspecifici che può essersi veri...

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Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Qui, presentiamo un protocollo per mostrare come cella fotoconversione è raggiunto attraverso l'esposizione di UV ad aree specifiche che esprimono la proteina fluorescente, Eos, in animali vivi.

Cella singola fotoconversione in Zebrafish intatto vivente

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Misurare Protein Stabilità in Living embrioni di zebrafish Usando fluorescenza Decay Dopo Fotoconversione (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

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Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

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Imaging strutture subcellulari nell&#39;embrione Living Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imaging Azzerato embrionale e postnatale Cuori a risoluzione di una singola cella

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

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Induzione di ipossia in rana vivente e embryos zebrafish

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

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Analisi trascrittomica unicellulare delle cellule Endocrine del pancreas del Mouse

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microiniezione di DNA in boccioli di occhiali in embrioni di Xenopus lavis e imaging di GFP Expressing Optic Aboral Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

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Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...