Name: single-cell photoconversion in living intact zebrafish
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00
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우리가 버나드 Kulemaka 및 그들의 도움이 의견과 시 지도, 샘 Connell 및 이미징 질문 및 데보라 뱅, 카 렌 주 및 케이 스튜어트 zebrafish 치료 비 위한 3i의 브렌 트 레드에 대 한 스미스 연구소의 회원을 감사 합니다. 이 작품 노 대학 및 줄기 세포의 센터에서 Zebrafish 연구 노 대학에서 재생 의학에 대 한 노트르담의, Elizabeth와 마이클 갤러거 가족, 알프레드 P. 슬로 안 재단, 센터에 의해 지원 되었다 담입니다. 모든 동물 연구 박사 코디 스미스의 Notre Dame 대학 IACUC에 따라 수행 되었다.

모든 동물 연구는 노 틀 담 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 대학에 의해 승인 되었다.
1입니다. 제 브라 견본 준비
<ol><li>표준 절차13당 짝짓기 챔버로 한 성인 남자와 한 성인 여성 Tg (컨버터블 단백질)를 배치 합니다. 이 원고에서는 Tg(sox10:eos)를 물고기9 액세스 하지만 photoconvertible 단백질으로 다른 유전자 변형 라인을 동등 하 게 사용 될...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Goins, W. 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F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling.">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li><li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone.">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).</li><li>Ravanelli, A. M., Appel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+and+oligodendrocytes+arise+from+distinct+cell+lineages+by+progenitor+recruitment.">Motor neurons and oligodendrocytes arise from distinct cell lineages by progenitor recruitment.</a> Genes Dev. 29 (23), 2504-2515 (2015).</li><li>Smith, C. J., Johnson, K., Welsh, T. G., Barresi, M. J. F., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+glia+inhibit+peripheral+glial+infiltration+into+the+spinal+cord+at+motor+exit+point+transition+zones.">Radial glia inhibit peripheral glial infiltration into the spinal cord at motor exit point transition zones.</a> Glia. , (2016).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development.">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. 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복잡 한 조직에서 다른 세포 유형 특정 도메인으로 구성합니다. 최근 기술 이러한 큰 조직 구조1,2,3내에서 개별 셀 라벨에 이용 되어 있다. 여기 마찬가지로 단일 세포 상호 작용 및 복잡 한 조직 내의 세포 인구 상호 작용을 시각화를 활용할 수 있는 두 가지 방법을 설명 합니다. Photoconversion 기술의 장점은 분명히 셀 라벨 과학?...

여러 가지 셀 구축 하 고 복잡 한 동물 및 식물 조직 유지 작용. 이 세포는 종종 삽입 하 고 조직의 고정을 필요로 하는 높은 해상도 현미경 없이 단일 세포 수준에서 이웃에서 구별 하기 어려운. 그러나, 이해 하 고 어떻게 이러한 조직 형태는 유지, 고 병 될, 그것 되었습니다 어떻게 단일 조직 내의 세포 조사 필수 상호 작용 하는 시간이 지남에. 이상적으로, 이러한 실험 정착의 요구 사항 없이 비 침략 적 방식으로 조직 내의 단일 셀의 라벨 필요 합니다. 과학자는 지금이 작업1,2,,34를 달성 하기 위해 수많은 기술을 개발 했다.
발견과 해파리의 녹색 형광 단백질 (GFP)의 구현1조직 환경 개별 셀의 라벨에 대 한 허용 한 흥미로운 접근 했다. 셀-특정 발기인을 사용 하 여, 유전자는1을 표시 하는 셀의 하위 집합을 선택 가능 하다.입니다. 또는, GFP의 바이러스 성 유도 식 GFP3,4의 사용자가 선택한 식에 대 한 이용하실 수 있습니다. 꽤 유용 하지만 GFP의 유전자 중재 표현; 조직에 있는 셀의 하위 집합 내에서 사용자가 선택한 식을 허용 하지 않습니다. 바이러스 성 표현의 GFP, 유리, 수 그리고 침략. 조직 내에서 더 부족 하 게 고유한 형광 단백질을 표현 하는 Brainbow 같은 영리한 기술과 GFP 파생 상품의 출현, 그것은 단일 셀 복잡 한 조직2, 에 그들의 사이에서 상호 작용을 시각화 수 되고있다 그러나 5., 이러한 접근 무작위 방식에서 셀 라벨. 원하는 실험 단일 셀의 시각화 또는 실험에 의해 정의 된 셀의 인구는 경우, 그들은 따라서 제한 됩니다. 이러한 실험 구분, 단일 셀 방식에서에 조작 될 수 있다 유전자 표현 형광 단백질을 것 그것은 다른 형광 비 형광 세포에서.
이 목표를 달성 하 고 단일 셀 복잡 한 살아있는 조직 내에서 세포 생물학을 시각화, 과학계에서는 고유한 형광 단백질6,,78의 단일 셀 photoconversion을 사용 합니다. 빨간 형광 상태로 자외선에 노출 되 면 녹색에서 전환 하는 photoconvertible 단백질 (즉, eos, 단풍나무, 등)의 표현을 제어 유전자를 사용 하 여 (488 nm) 빛, 우리는 붙일 레이블에서 한 단일 셀을 구분할 수 있습니다 이웃6,,78. 이 방법은 관심의 회절 제한 지역에 레이저 스택에서 빛을 직접 수 있는 우리의 confocal 현미경에 부착 된 기구를 이용 한다. 이 기술 우리 중 단일 셀 또는 사용자 정의 방식으로9,,1011에 더 큰 인구 레이블을 수 있습니다. 기술은 바이러스 GFP의 단일 세포 주사에 비해 최소한 침략 적 이다. 개념의 증거로 서 우리는 우리가 신경 절 말 초 신 경계 및 척수9,10의 복 부 쪽에 위치한 셀 같은 photoconvert 큰 인구 내의 photoconvert 단일 셀 수 보여 11,12. 우리 다음 그들의 운동 및 분화 발전 과정에 대 한 통찰력을 얻기 위해 이러한 photoconverted 세포 인구 24 h 나중을 시각화할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1846">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt;width:320pt" width="427">Tg(sox10:eos) zebrafish animals</td>
			<td style="width:125pt" width="167"></td>
			<td style="width:85pt" width="113"></td>
			<td style="width:854pt" width="1139">Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">100 X 15 mm petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">0.8% Low Melting Point Agarose</td>
			<td>dot scientific inc</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>14021-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Needle dissecting probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)</td>
			<td>Fluka analytical</td>
			<td>A5040-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters</td>
			<td>Zeiss Axiozoom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets</td>
			<td>3i spinning disk confocal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">UV light source (laser) for photoconversion</td>
			<td>405 nm laser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Slidebook software</td>
			<td>3i</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Methylene blue</td>
			<td>Kordon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell photoconversion in living intact zebrafish

동물 및 식물 조직 세포의 명료한 인구로 구성 됩니다. 이러한 셀 구축 하 고 조직 유지 시간에 따라 상호 작용 하 고 질병 중단 하는 경우 발생할 수 있습니다. 과학자 들은 셀의 하위 집합에 형광 단백질을 표현 하 여 특성과 그대로 조직 내 이러한 세포의 자연 역학 조사를 영리한 기술을 개발 했습니다. 그러나, 실험 시간에 단일 셀 또는 셀 인구 방식에 때로는 조직 내의 셀의 선택 된 시각화 더 필요합니다. 하이 고 셀의 인구 내의 단일 셀을 시각화, 과학자는 형광 단백질의 단일 셀 photoconversion를 활용 하 고. 이 기법을 보여, 우리 여기 어떻게 보여 UV 빛을 지시는 그대로의 Eos 표현 셀 zebrafish 생활. 우리는 다음 그들이 어떻게 조직에 변경 확인 하 photoconverted Eos+ 셀 24 h 나중 이미지. 우리는 두 가지 기술을 설명: 셀 photoconversion 및 photoconversions의 세포의 인구. 이 기술은 세포 세포 상호 작용, 세포 운명 및 차별화, 그리고 셀 마이그레이션, 그건 수많은 생물학 질문에 적용 하는 기술 시각화를 사용할 수 있습니다.

Photoconversion 형광 단백질의 조직6내에서 개별 셀을 사용할 수 있습니다. 이 보여, Tg(sox10:eos) 물고기9 sox10의 규제 시퀀스에서 photoconvertible 단백질 Eos 표현 하 사용 되었다. 48 Tg(sox10:eos) 동물 hpf 했다 처음 탑재, 그리고 다음 발생 했을 수 있는 일반적인 photoconversion 감지 하 군데. Eos Eos photoconverted 형광 신호 작은 비전향?...

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Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

여기, 우리가 어떻게 셀 photoconversion 형광 단백질, Eos, 살아있는 동물을 표현 하는 특정 영역에 자외선 노출을 통해 이루어집니다 보여 프로토콜 제시.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

광 변환 한 후 형광 붕괴를 사용하여 생활 Zebrafish의 태아의 단백질 안정성을 측정 (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

살아있는 Zebrafish의 배아에서 세포 이하 구조를 이미징

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

영상은 단일 셀 해상도에서 배아 및 출생 후의 마음을 해제

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

살아있는 개구리와 Zebrafish 태아의 저산소증 유도

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Zebrafish 태아에 있는 세포 Photoconversion 통해 다음 Endocardial 조직 움직임

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

마우스 췌 장 내 분 비 세포의 단일 셀 Transcriptomic 분석

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

제노푸스 laevis 배아에서 눈부안으로 DNA의 미세 주입 및 GFP의 이미징 그대로 광학 축색 아버를 표현, 살아있는 제노푸스 올챙이

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

무지개와 타임랩스 공초점 이미징을 사용하여 살아있는 제브라피시의 뇌 발달 시각화

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...