Name: single-cell photoconversion in living intact zebrafish
Uploaded: 2018-03-19T14:00:00
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Agradecemos a Bernard Kulemaka e membros do laboratório de Smith para seus comentários úteis e orientação de reagente, Sam Connell e Brent Redford de 3i para responder perguntas de imagem e Deborah Bang, Karen Heed e Kay Stewart para cuidados de zebrafish. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Notre Dame, a Elizabeth e Michael Gallagher Family, Alfred P. Sloan Foundation, centro de investigação de Zebrafish na Universidade de Notre e centro de células-tronco e medicina regenerativa da Universidade de Notre Dame. Todos os estudos animais foram feitos em conformidade com a Universidade de Notre Dame IACUC ao Dr. Cody Smith.

Todos os estudos em animais foram aprovados pela Universidade de Notre Dame institucional Cuidado Animal e Comissão de utilização.
1. preparação da amostra de Zebrafish
<ol><li>Coloque um macho adulto e um adulto feminino Tg (proteína conversível) para a câmara de acasalamento por procedimentos-padrão13. Neste manuscrito, use Tg(sox10:eos) peixe9 por causa do acesso, mas outras linhas transgénicas com proteína de photoconvertible pod...

<ol>
	<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression.">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263 (5148), 802-805 (1994).</li><li>Livet, J., Weissman, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).</li><li>Goins, W. F., Krisky, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpes+simplex+virus+vectors+for+gene+transfer+to+the+nervous+system.">Herpes simplex virus vectors for gene transfer to the nervous system.</a> J Neurovirol. 3 Suppl 1, S80-S88 (1997).</li><li>Boevink, P., Cruz, S., Hawes, C., Harris, N., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virus-mediated+delivery+of+the+green+fluorescent+protein+to+the+endoplasmic+reticulum+of+plant+cells.">Virus-mediated delivery of the green fluorescent protein to the endoplasmic reticulum of plant cells.</a> Plant J. 10 (5), 935-941 (1996).</li><li>Day, R. N., Davidson, M. 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F., Snelson, C. D., Prendergast, A., Suli, A., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+neuronal+addition+in+Zebrafish+dorsal+root+ganglia+is+regulated+by+Notch+signaling.">Postembryonic neuronal addition in Zebrafish dorsal root ganglia is regulated by Notch signaling.</a> Neural Dev. 7 (23), (2012).</li><li>Smith, C. J., Morris, A. D., Welsh, T. G., Kucenas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact-Mediated+Inhibition+Between+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+and+Motor+Exit+Point+Glia+Establishes+the+Spinal+Cord+Transition+Zone.">Contact-Mediated Inhibition Between Oligodendrocyte Progenitor Cells and Motor Exit Point Glia Establishes the Spinal Cord Transition Zone.</a> PLoS biology. 12 (9), e1001961 (2014).</li><li>Ravanelli, A. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kirby, B. B., Takada, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+shows+dynamic+oligodendrocyte+progenitor+behavior+during+zebrafish+development.">In vivo time-lapse imaging shows dynamic oligodendrocyte progenitor behavior during zebrafish development.</a> Nat Neurosci. 9 (12), 1506-1511 (2006).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Curr Biol. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li></ol>

Em tecidos complexos, distintos tipos de células organizam em domínios específicos. Recentemente, as técnicas têm sido utilizadas para células individuais de etiqueta dentro destes tecidos grandes estruturas1,2,3. Aqui vamos demonstrar duas técnicas que podem ser utilizadas da mesma forma para visualizar tanto interações célula única e interações de população celular dentro de tecidos complexos. A vantagem da téc...

Várias células distintas interagem para construir e manter o complexos tecidos animais e vegetais. Estas células são frequentemente intercalados e difícil de distinguir de vizinhos em um nível de célula única sem microscopia de alta resolução que exigem a fixação do tecido. No entanto, para compreender a forma como estes tecidos, são mantidas e tornar-se doente, tem sido essencial para investigar como single as células dentro do tecido estão interagindo ao longo do tempo. Idealmente, estas experiências exigem a rotulagem de células únicas dentro de um tecido de forma não-invasiva, sem a exigência de fixação. Os cientistas agora desenvolveram inúmeras técnicas para realizar esta tarefa1,2,3,4.
A descoberta e a implementação da proteína medusas verde fluorescente (GFP) foi uma abordagem interessante que permitiu para a rotulagem de células distintas em um ambiente de tecido1. Usando promotores de célula específica, é possível geneticamente, selecionar um subconjunto de células que são rotulados1. Alternativamente, viral induzida expressão de GFP pode ser utilizada para usuário-selecionado expressão de GFP3,4. Embora bastante útil, expressão mediada genética de GFP não permite expressão selecionado pelo usuário dentro de um subconjunto de células no tecido; e a expressão viral de GFP, apesar de vantajoso, pode ser invasiva. Com o advento de técnicas inteligentes como Brainbow expressar proteínas fluorescentes distintas mais escassa dentro de tecidos e derivados GFP, tornou-se possível visualizar células únicas e as interações entre eles em tecido complexo2, 5. no entanto, essas abordagens rotular as células de uma forma aleatória. Se o experimento desejado requer a visualização de uma única célula ou a população de células é definido pelo experimentador, são, portanto, limitados. Com tais experiências, seria vantajoso ter uma proteína fluorescente geneticamente expressa que pode ser manipulada para distinguir, de forma única célula, que de outras células não-fluorescente fluorescentes.
Para atingir esse objetivo e visualizar a biologia celular de células únicas dentro de um tecido vivo complexo, a comunidade científica usa única célula photoconversion de proteínas fluorescentes distintas6,7,8. Usando geneticamente controlado a expressão de uma proteína de photoconvertible (i.e., eos, kaede, etc.) que transita de um verde para vermelho estado fluorescente quando exposto aos raios UV (488 nm) a luz, podemos distinguir uma única célula de sua fluorescente etiquetadas vizinhos de7,6,8. Esta abordagem utiliza um aparelho ligado ao nosso microscópio confocal que pode direcionar a luz de uma pilha de laser para uma região de difração limitada de interesse. Com esta técnica, podemos rotular ou células únicas ou maiores populações em uma maneira definida pelo usuário9,10,11. A técnica é minimamente invasiva em comparação com injeções de célula única de GFP viral. Como uma prova de conceito, mostramos que podemos photoconvert células únicas dentro de um gânglio no sistema nervoso periférico e as maiores populações de photoconvert como células localizadas no lado ventral da medula espinhal9,10, 11,12. Podemos então Visualizar estas photoconverted populações de células 24h mais tarde para ganhar a introspecção em seu movimento e diferenciação durante o desenvolvimento.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1846">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt;width:320pt" width="427">Tg(sox10:eos) zebrafish animals</td>
			<td style="width:125pt" width="167"></td>
			<td style="width:85pt" width="113"></td>
			<td style="width:854pt" width="1139">Fish were obtained and crossed from the fish facility at the University of Notre Dame</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">100 X 15 mm petri dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Embryo medium is made weekly and provided by the fish facility at the University of Notre Dame containing 5L RO water, 30uL methylene blue, and 200mL salt stock.</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">0.8% Low Melting Point Agarose</td>
			<td>dot scientific inc</td>
			<td>9012-36-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">35 X 10 mm glass-coverslip bottom petri dish</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>14021-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Needle dissecting probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">0.002% 3-aminobenzoic acid ester (Tricaine)</td>
			<td>Fluka analytical</td>
			<td>A5040-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Fluorescent Dissecting Microscope with GFP filters</td>
			<td>Zeiss Axiozoom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Confocal microscope with lasers to excite GFP and RFP filter sets</td>
			<td>3i spinning disk confocal</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">UV light source (laser) for photoconversion</td>
			<td>405 nm laser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Slidebook software</td>
			<td>3i</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td height="21" style="height:15.75pt">Methylene blue</td>
			<td>Kordon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell photoconversion in living intact zebrafish

Tecidos animais e vegetais é composto de populações distintas de células. Estas células interagem ao longo do tempo para construir e manter o tecido e podem causar doenças quando interrompido. Os cientistas desenvolveram técnicas inteligentes para investigar características e dinâmica natural dessas células no tecido intacto por expressar proteínas fluorescentes em subconjuntos de células. No entanto, às vezes, experiências exigem mais selecionada visualização de células dentro do tecido, às vezes a forma unicelular ou população de células. Para alcançar este objectivo e Visualizar células únicas dentro de uma população de células, os cientistas têm utilizado a célula única photoconversion de proteínas fluorescentes. Para demonstrar essa técnica, mostramos aqui como direcionar a luz UV para uma célula Eos-expressando um interesse de uma intacta, vivendo zebrafish. Nós então imagem essas células de Eos+ photoconverted 24h depois para determinar como eles mudaram no tecido. Descrevemos duas técnicas: única célula photoconversion e photoconversions das populações de células. Estas técnicas podem ser usadas para visualizar interações célula-célula, célula-destino e diferenciação e migrações de célula, tornando-se uma técnica que é aplicável em numerosas questões biológicas.

Photoconversion de proteínas fluorescentes pode ser usado para rotular células distintas dentro de um tecido de6. Para demonstrar isso, Tg(sox10:eos) peixe9 foram usados para expressar a proteína photoconvertible Eos sob as sequências reguladoras de sox10. Os animais Tg(sox10:eos) em 48 hpf foram montados primeiro e então fotografada para detectar qualquer photoconversion não-específicos que possam ter ocorr...

Watch this Scientific Journal Video about Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish at JoVE.com

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Aqui, apresentamos um protocolo para mostrar como célula photoconversion é conseguida através da exposição UV para áreas específicas, expressando a proteína fluorescente, Eos, em animais vivos.

Photoconversion de célula única no Zebrafish intacta vida

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Medir a estabilidade da proteína em Viver embriões Zebrafish Usando Fluorescência Decay Após Fotoconversão (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Biologia do Desenvolvimento

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Análise de Zebrafish larvas Músculo Esquelético Integrity com Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imagiologia estruturas celulares no embrião vivo Zebrafish

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Imaging Cleared Embryonic and Postnatal Hearts at Single-cell Resolution

Imagiologia Cleared embrionário e pós-natal Corações na resolução de célula única

Single clonal tracing and analysis at the whole-heart level can determine cardiac progenitor cell behavior and differentiation during cardiac development, ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Potencial de membrana de neurônio motor biossensível em embriões vivos de peixe-zebra

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Indução de hipóxia em sapos vivos e embriões de peixe-zebra

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Seguindo os movimentos de tecido endocárdico através de célula Photoconversion no embrião Zebrafish

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Análises de célula única Transcriptomic de células endócrinas no pâncreas de rato

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection do ADN em Eyebuds em embriões do laevis de Xenopus e imagem latente de GFP que expressa Arbors axonal óticos em girinos intact, vivendo de Xenopus

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Visualizando o cérebro em desenvolvimento em zebrafish vivo usando Brainbow e Imagem Confocal de lapso de tempo

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...